全 文 ：药物分析杂志 C h in J Pha rnA na l 2 0( )6
,
2 6 ( 10 )
H P L C 法同时测定鸡肝散药材 中 3 种黄酮昔元的含量
来奕刚 , 徐娟华 ’ ,蒋惠娣 , 曾苏 , 赵星
(浙江大学药学院 , 杭州 31 0 3 1)
摘要 目的 : 建立一种用 H P L C 法同时测定鸡肝散药材中 3 种黄酮背元含量的方法 。 方法 :以木犀草素 、 芹菜素 、 5 一 经基 一 6 ,
7 一二甲氧基黄酮为对照品 , A : ile n t Z o ht ax S B 二 C ,: ( 4 . 6 m m x 2 5 0 m m , 5 林m )为色谱柱 , 甲醇 一 0 · 2% 磷酸溶液 ( 7 0 : 3 0 , : / : )为
流动相 ,检测波长 350 n m , 流速 1 . 0 m L · m in 一 ` ,柱温 30 ℃ 。 结果 : 木犀草素 、芹菜素 、 5 一 经基 一 6 , 7 一 二甲氧基黄酮 3 种成分
浓度分别在 8 . 54 一 85 . 4 , 1. 2 一 12 , 9 . 2 一 92 哪 · m L 一 ’范围内有良好的线性关系 , 相关系数均为 0 . 9 99 ;平均加样回收率 ( 。 =
9) 分别为% . 8% , 98 . 0% , 10 . 5 % 。 结论 :本法操作简便 、 准确 、灵敏度高 , 可为鸡肝散药材质量标准的制定提供科学依据 。
关键词 :鸡肝散 ;木犀草素 ;芹菜素 ; 5 一 轻基 一 6 , 7 一 二甲氧基黄酮 ; H PL c
中图分类号 : gR l7 文献标识码 : A 文章编号 : 0 254 一 17 9 3 ( 20 6 ) 10 一 140 4 一 04
H P L C s im u lat n e o u s d e t e r m i n a t i o n o f th r e e fl a v o n o id
a g ly c o n e s i n E ls h o ltz 勿 b勿 n da B e n t h .
LA I Y i 一 g a n g , X U J u a n 一 h u a ’ , J I A N G H u i 一 d i , Z E N G S u , Z H A O Y u
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i ej i a ,19 U
n i v e r s i t y
,
H
a n g z h
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3 10 0 3 1
,
Ch i n
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A b s t r a c t O bj e e t i v e : T
o
d e
v e l o p a n e w m e t h o d fo r s im u l t a n e o u s d e t e rm i
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E l s h o l七 ia b l a nd a Be n t h
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b y H PL C
,
M
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r e fe r e n e e s u b s t a n e e s
,
A g i l e n t Z o br
a x S B 一 C , 8 ( 4
.
6 m m x 2 5 0 m m
,
5 林m ) w a s u s e (1 a s a n a l y t i e a l e o l u m n , w i th
m e t h a n o l 一 0
.
2 % p h o s p h o
r i e a e i d s o l u t i o n ( 7 0
:
3 0
, : / : ) a s m o b i l e p h a s e
,
t h e d e te e ti o n w a
v e l
e n g th w a s a t 3 50
n m
,
th e n o w r a t e w a s 一 0 m L · n l i n 一 ’ a n d t h e e o l u m n t e m p e r a tu r e w a s 3 0 ℃ . R e s u l st : T h e e a l ib r a t io n e u vr e s o f l u t e o -
1i n
, a p i g e n i n
,
5 一 h y d r o x y 一 6 , 7 一 d i m e th o x y fl a v o n e w e er l i n e a r w i th in t h e r a n g e o f 8
.
5 4 一 8 5
.
4
,
1
.
2 一 12 , 9
.
2 一 9 2
林g · m L 一 ’ , th e e o r e l a ti o n e o e if e i e n t w e er 0 . 9 9 9 9 , 0 . 9 9 9 9 , 0 . 9 9 9 9 , a n d t h e i r a v e ar g e r e e o v e r i e s ( n = 9 ) w e r e
9 6
.
8%
,
9 8
.
0%
,
10 0
.
5%
, r e s p e e t i v e l y
.
C o n e l u s i o n : Th e m e th o d 15 s i m p l e
, a e e u r a te a n d s e n s it i v e
, a n d e a n b e u s e d
fo
r q u a l i t y e o n t or l o f E
.
bl a dn
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.
K e y w o r ds
:
lsE h
o l打 ia b l a n d a B e n th . ; l u t e o l i n : a p i g e n i n ; 5 一 h y d or x y 一 6 , 7 一 d i m e th o x yfl a v o n e ; H P L C
鸡肝散又称四方篙 ( E ls ho ltz at bl a n da B en ht . ) ,
为唇形科香蕾属多年生草本植物 。 性味苦辛 、 凉 ,具
有清热解毒 、 消炎止痛的功效 , 民间常用于治疗感
冒 、 痢疾 、 肝炎等病症 L’ ) 。 鸡肝散中主要含有挥发
油和黄酮类化学成分 〔’ .3j ,前者研究较早较多 ,而后
者的研究相对较少 。 最 近有研究报道 ,其黄酮类成
分具有 良好的抗心律失常和心肌缺血等作用 〔4 一 ’ 」。
因此 ,建立合理可行的黄酮类成分含量测定的方法 ,
对于正确评价该药材质量具有重要意义 。 在鸡肝散
黄酮类成分中 ,主要含木犀草素及其昔类 ,还含一定
量的芹菜素及其昔类和 5 一 经基 一 6 , 7 一 二甲氧基
黄酮昔元等 L’ 〕 。 已有文献对鸡肝散浸膏中木犀草
素昔进行了测定 〔8〕 , 但此类成分真正在体内起作用
的是其昔元 , 即木犀草素 〔’ 〕。 故为 了清楚了解鸡肝
散中这些昔元成分的含量和组成特征 , 本文通过对
其药材进行水解 ,并用 H PL C 法同时测定木犀草素 、
芹菜素和 5 一 经基 一 6 , 7 一 二 甲氧基黄酮这 3 种黄
酮昔元含量 , 以达到既控制 主成分含量又反映出各
成分组成比例特征 的 目的 , 为鸡肝散药材的质量控
制提供科学的参考依据 。
1 仪器和试药
1
.
1 仪器 A g il e n t 1 10 高效液相色谱仪 ( A g i le n t
* 通讯作者 T e l : ( 0 57 1 ) 8 8 2 0 84 56 : E 一 m a i l : p h n o s y@ 12 6 . e o m
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药物分析杂志 h C in Jp h n a rAn l a20 6
,
2 6 ( 10 )
公司 ,美 国 ) 、 D AD 检测器 、 四元泵 、 A isl en t 色谱工作
站 。
1
.
2 药材来源及处理 鸡肝散药材由云南金殿制
药有限公司提供 ,原植物标本由云南昆明大学李恒
教授鉴定 。 药材经干燥后打粉 ,过 40 目筛后 , 备用 。
1
.
3 试剂 对照品 : 木犀草素购于中国药品生物制
品检定所 (供含量测定 , 批号 : 1 1 1 5 2 0 一 2 0 0 2 0 1 ) ;芹
菜素 购 于 iS g m a 公 司 ( 纯 度 大 于 9 % , 批 号 :
0 6 4 kO6 5 3 ) ;5 一 轻基 一 6 , 7 一 二 甲氧基黄酮由本实验
室 自行分离所得 , 并经波谱分析鉴定结构 , 纯度 经
H P LC 归一法检测为 98 . 8% ;色谱纯 甲醇 , 超纯水 ,
其余试剂均为分析纯 。
2 色谱条件
色谱柱 : A g i l e n t Z o r b ax S B 一 C . 8 柱 ( 4 . 6 m m x
2 5 0 m m
,
5 林m ) ;流动相 : 甲醇 一 0 . 2 % 磷酸溶液 ( 7 0
:
30
, : / : ) ;流速 : 一 o m 一』 : m i n 一 ’ ;检测波长 : 3 5 0 : , , 11 ;
柱温 : 30 ℃ ;进样量为 20 林 L 。 在此条件下 , 木犀草
素 、芹菜素 、 5 一 经基 一 6 , 7 一 二甲氧基黄酮的理论塔
板数分别为 6 8 3 4 , 8 13 4 , 12 5 9 7 。 色谱图见图 l 。
图 1 对照品 ( A )及样品 ( B ) H P L C 图
f
’
19 1 H P L C
o
h。 。 a t o g r月 , n s o f c h e n , j c aj l℃ fe Z℃ n e e s u b s t a n e e s ( A ) a n d
s a m p l e ( B )
1
. 木犀草素 ( l u t e o l i n ) 2 . 芹菜素 ( a p ig e n i n ) 3 . 5 一 怒基 一 6 , 7 一 三
甲氧基黄酮 ( 5 一 h y d ro x y 一 6 , 7 一 d im e t h o x yfl a v o n e )
3 方法和结果
3
.
1 混合对照品储备液的制备 精密称取经减压
干燥至恒重 的对照品木犀草素 、 芹菜素 、 5 一 轻基 -
6
,
7 一二甲氧基黄酮适量 , 用甲醇分别配制成浓度为
85 4
,
120
,
92 0 林g
·
m L
一 ’ 的单一对照品储备液 。 精
密量取上述单一对照 品储备液各 5 m L 至同一 50
m L 量瓶中 ,加流动相定容至刻度 , 摇匀 , 即得 。
3
.
2 供试品溶液的制备 精密称取经减压干燥至
恒重的药材样品粉末 2 0 m g , 加 3 m ol · L 一 `盐酸甲
醇溶液 ( 甲醇体积百分数为 70 % ) 30 m L , 于 85 ℃水
浴 中回流水解 3 h , 冷却后用 6 m ol · L 一 ’ 氢氧化钠
溶液调节 p H 至 3 一 4 , 过滤 ,残渣用 5 m L 甲醇洗涤
3 次 ,合并滤液 , 用流动相定容至 50 m L , 摇匀 。 用
.0 45 林m 滤膜过滤 ,取续滤液作为供试品溶液 。
3
.
3 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液
1
.
0
,
3
.
0
,
5
.
0
,
7
.
0
,
10
.
0 m L
, 分别置 于 1 0 m L 量瓶
中 ,加流动相定容至刻度 ,摇匀 , 即得 1 一 5 号混合对
照品溶液 。 各进样 20 林L , 以峰面积 ( )Y 为纵坐标 ,
对照品溶液的浓度 ( X ) 为横坐标 , 绘制标准曲线 。
结果表明 :木犀草素 、芹菜素 、 5 一 轻基 一 6 , 7 一 二甲
氧基黄酮 3 种成分浓度分别在 8 . 54 一 85 . 4 , 1 . 2 -
12
,
9
.
2 一 92 此 · m L 一 ’范围内呈 良好的线性关系 ,
相应的回归方程分别为 :
Y = 9 4
.
4 7 X 一 4
.
0 9 r = 0
.
9 9 9 9
Y = 9 8
.
9 7 X 一 1
.
7 O r = 0
.
9 9 9 9
Y = 2 3
.
3 6X 一 0
.
3 9 r = 0
.
9 9 9 9
3
.
4 精密度试验 在上述色谱条件下 ,取 “ 3 . 3 ” 项
下 5 号混合对照品溶液连续进样 6 次 ,测得木犀草
素 、芹菜素 、 5 一 经基 一 6 , 7 一 二甲氧基黄酮的峰面
积 ,其 R S D ( n = 6) 分别为 0 . 5% , 1 . 9 % , 0 . 7% 。
3
.
5 稳定性试验 在上述色谱条件下 ,取同一份供
试品溶液 ( 2 0 1 一 ] l 花 ) 于 0 , 2 , 8 , 2 0 , 24 h 分别进
样 ,测得木犀草素 、芹菜素 、 5 一 轻基 一 6 , 7 一 二甲氧
基黄酮 的峰 面 积 , 其 RSD ( n = 5 ) 分别为 0 . 4 % ,
1
.
5 %
,
0
.
4 %
。 表明供试品溶液在 24 h 内稳定 。
3
.
6 重复性试验
日内精密度考察 : 取同一批样品 ( 2(X〕l 一 1 1 叶 )
按供试品溶液制备方法于同一天 内平行制备 5 份溶
液 ,在上述色谱条件下 ,进样测定并计算木犀草素 、芹
菜素 、 5 一 经基 一 6 , 7 一二甲氧基黄酮 3 种黄酮昔元的
含量 ,其 RS (D n = 5) 分别为 0 , 5% , 2 . 6% , 0 . 5% 。
日间精密度考察 : 取同一批样品 ( 2 0 01 一 1 1 叶 )
按供试品溶液制备方法于不 同天 ( 0 , 1 , 2 , 3 , 4 d) 内
分别制备 1 份溶液 ,在上述色谱条件下 ,进样测定并
计算木犀草素 、芹菜素 、 5 一 经基 一 6 , 7 一 二甲氧基黄
酮 3 种黄酮昔元 的含 量 , 其 R SD ( n = 5 )分别 为
0
.
9%
,
2
.
6%
,
2
.
9 %
。
3
.
7 加样回收率试验 精密称取木犀草素对照品
16
.
5 m g
、芹菜素对照品 1 . 2 m g 、 5 一 经基 一 6 , 7 一 二
甲氧基黄酮对照品 13 . 7 m g 置于同一 10 m L 量瓶
中 ,加甲醇溶解并稀释至刻度 , 作为加样对照 品溶
液 。 精密称取已知昔元含量 的样品 ( 2 002 一 H 花 )
10 m g
,平行 9 份 ,每 3 份为一组 , 按高 、 中 、低 3 个
水平分别精密加人加 样对照 品溶液 1 . 2 , 1 . 0 , 0 . 8
m L
,按供试品溶液制备方法操作 ,制备所需溶液 ,在
上述色谱条件下 ,取 20 林L 分别进样测定 ,并计算 3
种黄酮昔元的 回收率和其 R SD 值 。 结果木犀草素
高 、 中 、低 3 个水平的回收率 ( n = 3) 分别为 % . 1% ,
9 6
.
4%
,
9 7
.
8% : 其 R SD 分 别 为 1 . 5% , 1 . 3% ,
1 4 0 6一 药物分析杂志 h Ci n J p hm a rA n沮 20 06
,
26 ( 10 )
2
.
2 % ;平均 回收率 ( n = 9) 为 % . 8% 。 芹菜素高 、
中 、低 3 个水平的 回收率 ( n = 3) 分别为 9 . 5% ,
9 6
.
7%
,
9 7
.
9% : 其 R SD 分 别 为 2 . .3% , 2 . 3% ,
1
.
1% ;平均回收率 ( n = 9) 为 98 . 0 % 。 5 一 经基 一 6 ,
7 一 二甲氧基黄酮高 、 中 、低 3 个水平的回收率 ( n 二
3 )分别为 10 2 . 1% , 9 . 3% , 10 . 2 % ;其 R S D 分别为
2
.
9%
,
2
.
4 %
,
2
.
6 % ; 平 均 回 收 率 ( n = 9 ) 为
10 0
.
5%
。
3
.
8 样品含量测定 精密称取各样品均 2 份 , 按
,’3 . 2 ” 项下方法制备供试品溶液 , 在上 述色谱条件
下 ,进样测定 ; 同时取 “ 3 . 1 ” 项下 5 号混合对照品溶
液在相同条件下进样测定 , 以峰面积外标法计算样
品中 3 种黄酮昔元的含量 。 结果见表 1 。
表 1 样品含量测定结果 ( m g · g 一 , , n = 2)
T a b 1 T h e er s u l st o f sam
P le d e t e r m i n a it o n
部位
( )[
a rt )
采集时间
( p i
o k i n g
ti , n e )
木犀草素
(】u t e o l i。 )
芹菜素
(
a p i罗 n i n
5 一 经基 一 石
7 一 二甲氧基黄
酮 ( 5 一 卜y d r o x y 一 6 , 7
一 d i o e ht o x川va o n e )
花 ( fl o w e r )
花 ( n o * e r )
花 ( fl o w e r )
花 ( n o w e r )
梗茎 ( s te rn )
叶 ( 卜af )
解前后变化不大 , 说明可能 以游离形式存在 。 最后
选定最佳水解条件为 : 盐酸浓度为 3 m d · L 一 ’ , 水
解温度为 85 ℃ , 甲醇体积百分数为 70 % ,水解时间
为 3 h 。
4
.
3 检测波长 的选择 用甲醇分别配制木犀草素 、
芹菜素 、 5 一 经基 一 6 , 7 一 二甲氧基黄酮对照品溶液 ,
进行紫外 一 可见光扫描 , 根据其图谱可知这 3 种成
分在 350 n m 处都有较强吸收 ,并且杂质干扰少 , 灵
敏度高 。 因此本文选择 350 n m 作为检测波长 。
4
.
4 流动相的选择 通过比较甲醇 一 水 、 甲醇 一 醋
酸溶液和甲醇 一 磷酸溶液等洗脱系统 ,发现后者对
成分分离效果较好 ,再经过系统微调 ,结果选用甲醇
一 0
.
2% 磷酸溶液 ( 7 0 : 30 , : / : ) 时 , 3 种黄酮昔元能
达到基线分离 。
4
.
5 不同生药样品含量的 比较 从表 1 中可 以看
出 ,采摘时间和不 同药用部位对药材中 3 种黄酮昔
元的含量均有影响 ;在花中 3 种黄酮昔元总含量以
1 月份为高 , 这与民间常于 1 一 12 月份采集药材
的习惯基本相符 。 测定结果也表明 : 对于成熟花序 ,
3 种黄酮昔元含量之间存在一定的 比例关系 , 即木
犀草素 、芹菜素 、 5 一 轻基 一 6 , 7 一 二甲氧基黄酮 的比
例为 ( 13 一 14 ) : l : ( 1 1 一 12 ) 。
4
.
6 小结 本法一次性同时测定药材 中 3 种黄酮
成分 ,方法简便 ,准确可靠 , 可为药材的质量控制提
供较为全面科学的依据 。
服旧8131352X() 2 一 09 12 . 8 1. 2
2X() 2
一 1 1 1 6
.
5 1
.
2
2X() l
一
09 1 ]
.
7 1
.
1
2X() l
一 11 16
.
2 1
.
2
2X() l
一 11 5
.
4 0
.
9
2加 l 一 1 1 1 6 . 0 0 . 9
4 讨论
4
.
1 检测成分的确定 木犀草素及其昔类是鸡肝
散的主要化学成分 , 含量较高 ; 而芹菜素类 ,虽然含
量较低 ,但其含量与木犀草素类成一定 的比例 ,且据
文献报道 ,木犀草素和芹菜素均具有多种药理活性 ;
同时据文献报道 , 5 一 经基 一 6 , 7 一 二甲氧基黄酮具
有抗真菌等作用 〔`“ 」 , 且 已 由本实验室 自行分离制
得 。 因此 ,为了既控制鸡肝散药材主成分含量又反
映各成分组成比例特征 ,本文选用这 3 种黄酮成分
作为鸡肝散药材含量测定的指标 。
4
.
2 水解条件的优化 因为水解完全与否直接影
响测定结果 的可靠性 , 因此必须对样品的水解条件
进行优化 。 采用正交试验法 , 以水解液中木犀草素 、
芹菜素 、 5 一 轻基 一 6 , 7 一 二 甲氧基黄酮的含量为指
标 ,选取盐酸浓度 、 甲醇浓度 、水解温度和水解时间
4 个因素对水解条件进行考察 , 选出最佳的水解条
件 ;同时以相应的木犀草素昔 、芹菜素昔和药材提取
液作参照 ,用聚酞胺色谱法和 H P L C 法相结合进行
水解完全与否的考察 ,结果显示在此条件下 , 2 种昔
均能水解完全 , 5 一 轻基 一 6 , 7 一 二甲氧基黄酮在水
参考文献
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理与临床 ) , 20 04 , 20 ( l ) : 14
W A N G F
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(本文于 2 0 5 年 12 月 19 日收到 )
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[ W H O 会议 l
李长贵副研究员赴丹麦哥本哈根参加 W H O 流感病毒中和方法标准化研讨会
应 W H O 邀请 , 经 国家食品药品监督管理局批准 ,我所疫 苗三 室李长贵副研究员作 为临 时顾 问 于 20 06 年 10 月 2 一 4 日赴丹麦哥本哈根参
加 w H O 流感病毒中和方法标准化研讨会 。 该次会议在 W H o 欧洲 区办公室召开 , 参加会议的有 w H o 官员肠 sz fo P al k on y ay 、 aD vi d w o d 、 w en -
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、 欧洲 区 官员 N ed r e t E而 ro gl u 等 ,有来自美国 、 英 国 、荷 兰 、 澳大利 亚 、 日本 、 中国 、 泰国等国家流感监测和疫苗管理 当局的临时顾 问 17
人 , 以及来自于企 业的观察员约 10 人
会议背景 : 随着高致病性禽流感在全球的肆虐 , W HO 敲响了新 一轮流感大流行的警钟 。 但在新型流 感病毒抗体 的检测 中 , 发现传统的血
凝抑制 ( IH ) 方法不敏感 。 如在 19 97 年中国香港 }巧M 感染病例和后来的 疫苗 I 期临床研究中 , 发现采用 病毒中和 ( V N ) 测定 的杭体 G M T 比
川 方法高数倍 。 因此在 2 0 03 年德 国 D re ds en 会议中 , W HO 提 出应 当尽快采用新 的杭体检测 方法 , 其中以 中和 方法作为 重点研究 内容 。 W HO
联合美国 C D C 、 英国 M B S C 于 2 004 一 2 0 05 年进行 了流感病毒中和方法的协作研究 。 本次会议即对第一阶段协作研究进行总结 ,对中和 方法进
行标准化 , 并提 出进 一步协作研究的 内容和进程
会议 内容 : 首先由 Ial n S t叩 h en s on 博士报告 了时此次协作研究的总结 。 本次研 究以 3H NZ 亚型流 感病毒作 为研究对象 。 滴定血清包括 19
份人免前和免后血清 , 3 份雪貂免后血 清 采用 的病毒分别 为鸡胚和 细胞制 备的 刀 P朋 a m叮 20 7/ 9 ( H 3 N 2) 或相似株及各 实验室 自备相似
株 采用 此三株病毒分别用 IH 和 V N 对 2 份血清进行三 次滴定 , 以 考察在实验室内和 实验室间的 变异性 , 同 时试 图确 立与 lH l : 40 滴度 ( 已
知 50 % 免疫保 护滴度 ) 对应的 v N 滴度 〔 由于 V N 目前 没有统一的方法程序 , 故各 实验室根据 自己建立的方 法进行测定 , 这是本 次协作研究 的
不 同之处 在参加协作研究的 17 个 实验 室中 , 只 有 1 个按时完成任务并提交结果 , 其 中 , 包括我所疫 苗三 室 。 在数据分析 中 , 以样品重 复测
定结 果和双份血清测定结果考察实验室内变异 , 以 平均 几何 变异 系数 ( Mea n G e o m e itr o C oe 佑 C ien t 。 f V iar at ion , C C v) 考察实验室间差异 。 结 果
发现 , 在 实验室 内重复性较好 , 11 方法中只 有 7 % 的 测定大于二倍差距 ,在 v N 中为 2 % 但各实验 室间 差异很大 , 以血清 N 为例 , IH G CV 达
27 8 %
,
v N G C V 高达 5 29 % 这说明 , 虽 然 IH 方法 有通行的程序 ,但不 同实验 室间结果差异仍 旧很大 , 而 V N 结果由于方法不 同导致 变异更大
在对数据进一步分析 中 , 将血清滴度排序后 ,发现各 实验室间有很好的一致性 , 以 中间点血 清 H 作 为标 准 , 其余血清对其作相对 滴度 变换后 ,
各试验室间 G C V 变异缩小 为 IH 64 % , v N 为 1巧% 。
(lJ hn w o d 博士在报告 中也认为传统的 以 火鸡血球为基础的 IH 方法不敏感 ,但 以马血球代替鸡血球后 ,测 定杭体 滴度接近中和方 法 。 这
主要是在马血球上有较多的禽流感病毒结合受体 ( a2 , 3 一 半乳糖相 连的唾液酸 ) ,但某些马血球非特异性较高 , 需要对其进行筛选 , 且血球保存
时间 不 能 太久 。 Jol n W o d 博士提出建立抗体 国 际标准品的必要性 : 首先 ,根据协作研究的结果和分析 , 无论是 lH 还是 V N 方法 , 各 实验室间
结果差异都较大 ,但根据同一份血清标化后 , 差异明显缩 小 。 另外 ,在 20 05 一 20 06 年 间 , 全球有 21 家 H SM 疫 苗研 究机构进入临床研究 , 由于
各 实验室间 方法差异 , 无法比较血清学结果和疫苗的免 疫效 果 。 因此 , Jho n w o d 博士认为 ,建立 SH NI 杭体标准品是必要和可行的 。 同 时 , 建
立杭体标准品后 , 可以在 以后 的流行病 学研究中 ,得到保护性杭体 的准确数值 。 w HO 已经批准建立这一标准品 ,初步设想是收集 2 ~3 升 的血
清 , 由 M B S C 统一分装并冻干 , 然后在第二阶段的协作研究中标 定并赋值 。 目前面 临 的 困难是候选血清的收集 。 从感 染 SH M 病毒的恢复期
病人中收集大 量血清困难很大 , 而从临床研究志愿者中收集高滴度血清是可行的办法 〔
美 国 C D C 的 Jac q u el in e K atz 博士报告 了修订 的流感病毒中和方法操作程序 。 对试验关键因素 , 如 : 病毒攻击量 、 细胞接种数量 、 细胞加入
状态 、 培养时间 、判 定终点方法等对本次协作研究结果的影响进行了分析 ,并提出 了最佳的试验步骤 。 但在终 点的判定上 ,仍 保留细胞病 变法
和检查流感病毒 N P 蛋 白表达 两种方法 。
在第二阶段的协作标 定 中将 以 H S NI 病毒为主 , 由 W H O 提供灭活的反向遗传 学制备 SH M 重配病毒 , 血清中包括 国际参考品候选血清 ,
采用 马血球为基础 的 川 方法 ( H IH )和修订的 中和试验两种方法进行研究 。 此阶段的研究将在得到国际参考品候选血清后尽快进行 。
除参与技术性讨论外 ,笔者还提到了 M BS C 和 NI C P B P之间合作建立杭体标准品 的事宜 。 作为双 方领导互访 的结果 , 我们 已 经将这 一题
目通知 M BS C , 而 Joh n w o d 博士 已经 了解这一课题 ,其他与会人员也表示了极大的兴趣 ,希望我们能够提供候选血清 。 随后 , 李长贵副研究 员
就血清最佳 采集时机与大会人员进行了 交流 。 通过参加本次研讨会 , 我们 了解到 W HO 在应对流感大流行中进行的努力和在实验方法标准化
中面 临的挑战 。 M CP BP 积极参与第一阶段协作研究并成功地提交了结果 ,我们将在后 续研究中继续努 力并发挥更大的作用 。