全 文 ：江西农业学报 2010, 22(9):38 ～ 41ActaAgriculturaeJiangxi
芦笋基因组 DNA提取与 ISSR反应体系的优化
盛文涛1, 2 ,周劲松2 ,汤泳萍2 ,罗绍春 2 ,朱友林1 ,陈光宇2＊
收稿日期:2010-06-20
基金项目:国家自然科学基金面上项目(30771376);江西省自然科学基金项目((2007GZN1971))。
作者简介:盛文涛(1984─),男 ,硕士研究生,研究方向:作物遗传育种。＊通讯作者:陈光宇。
(1.南昌大学生命科学与食品工程学院 ,江西 南昌 330047;2.江西省农业科学院 生物工程中心 ,江西南昌 330200)
摘 要:ISSR标记技术在芦笋上目前还未见相关的研究报道。本研究在改进芦笋基因组 DNA提取方法基础上 , 以芦笋
基因组总 DNA为模板 ,对芦笋 ISSR反应体系的重要参数进行优化试验 , 建立了一套适用于芦笋稳定可靠 、重复性强的 ISSR
反应体系:25μL的反应体系中 ,模板 DNA量 50 ng、Mg2+浓度 2.0 mmol/L、正反引物各 0.2 μmol/L、dNTPs0.2 mmol/L、Taq
DNA聚合酶 1 U以及 1×Buffer。
关键词:芦笋;基因组;ISSR;反应体系;优化
中图分类号:S644.6 文献标识码:A 文章编号:1001-8581(2010)09-0038-04
OptimizationofExtractionofTotalDNAandISSR-PCRSysteminAsparagusofficinalis
SHENGWen-tao1, 2 , ZHOUJin-song2 , TANGYong-ping2 , LUOShao-chun2 , ZHUYou-lin1 , CHENGuang-yu2＊
(1.SchoolofLifeSciencesandFoodEngineering, NanchangUniversity, Nanchang330047, China;
2.BiotechnologyCenter, JiangxiAcademyofAgriculturalSciences, Nanchang330200, China)
Abstract:Nowadays, therearefewreportsrelatedwithISSRmarkersinasparagus.Thisexperimentoptimizedthemethodforthe
extractionofDNAandthereactiveparametersofISSRsysteminasparagusgenome, andasetofstableandrepeatableISSR-PCRsys-
tem(25μL)hasbeenconstructedasfolows:templateDNA 50 ng, Mg2+ 2.0 mmol/L, eachineveryprimerpair0.2 μmol/L,
dNTPs0.2 mmol/L, TaqDNAenzyme1Uand1×Bufer.
Keywords:Asparagus;Genome;ISSR;Reactivesystem;Optimization
简单重复序列间区多态性标记(Inter-simplese-
quencerepeatpolymorphism, ISSR),是 Zietkiewicz等于
1994年发展起来的一种基于微卫星(simplesequencere-
peat, SSR)的十分有效的分子标记 ,对 SSR之间的 DNA
序列进行 PCR扩增 [ 1] 。其特点是:多态性高;产率中等;
重复性好;操作简单;引物开发无需任何 DNA序列信息 ,
设计简单 ,成本低;在不同的物种间具有通用性 ,比较适
合于基因组未测序已知 DNA序列信息量小的物种上使
用 。目前 , ISSR标记已广泛应用于植物种质资源鉴定评
价 、遗传图谱构建 、重要性状标记 、进化及分子生态学等
研究中 [ 2] 。
芦笋(AsparagusoficinalisL.),属百合科天门冬属
多年生宿根性草本植物 ,是一种深受消费者喜爱的营养
保健型高档蔬菜 ,素有 “蔬菜之王 ”的美誉[ 3] ,近年来在
全国各地发展迅速 , 2008年中国芦笋种植面积已达到
9.5万 hm2 ,约占世界芦笋种植面积的 50%。由于芦笋基
因组未测序 ,已获知的 DNA序列信息少 ,开发 SSR、SNP
等新型分子标记成本高 ,目前国内外对芦笋种质资源遗
传多样性、遗传图谱构建和基因定位等方面的研究主要
利用 RAPD和 AFLP等随机型分子标记技术 , ISSR较之
RAPD稳定可靠 ,比 ARLP简单方便 ,目前 ISSR标记在
芦笋上的研究尚未见报道[ 4] 。 ISSR是一种基于 PCR的
分子标记 ,其扩增效果受各种 PCR参数和反应程序影
响 ,在不同物种 、不同引物和不同 PCR参数的扩增条件
下存在差异 。同时 ,由于芦笋是多年生作物 ,真叶退化 ,
针状拟叶 ,富含多糖和酚类等次生代谢物质 ,芦笋基因组
DNA提取方法需要进行适当改进 [ 5] 。因此 ,本研究在芦
笋基因组 DNA提取方法改进基础之上 ,通过对芦笋 IS-
SR反应体系主要影响因素进行优化 ,建立了适用于芦笋
的 ISSR反应体系 ,为 ISSR标记技术在芦笋遗传育种研
究中的应用奠定技术基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料 本试验材料为第三届国际芦笋品种试
验中的 THIELIM,种植于江西省农业科学院生物工程中
心芦笋试验基地 。
1.2 试验试剂 ISSR引物(表 1)参考哥伦比亚大学开
发的引物序列 (htp://www.biotech.ubc.ca/services/
naps/primers/Primers.pdf),在其序列基础上适当修改、
添加 1 ～ 3个选择性碱基序列 ,然后送由上海生工生物工
程技术服务有限公司合成 , dNTPs、DNAmarker和 Taq
酶、Mg2+、10×bufer等试剂分别购自明日百傲和 MBI公
司。 ISSR反应体系优化试验选用的是引物 ISSR6。
1.3 DNA提取 采用改良 CTAB法提取基因组 DNA,
参考吴翼等的方法并稍作改良 [ 6] ,首先称取试验品种
THIELIM新鲜嫩绿的拟叶 4 ～ 6g,置于预冷的研钵中;加
入适量的液氮 ,迅速研磨至组织破碎转入 50 mL的离心
管中;加入 15 mL的 CTAB提取液 (2% CTAB, 100
mmol/LTris-HCl, pH8.0, 20 mmol/LEDTA, pH8.0,
1.4 mol/LNaCl, 0.1% 2-mercapthoethanol, 2%PVP)65
℃水浴 40 ～ 60min,中途轻轻混匀几次;水浴后冷却至室
温 ,加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1),轻轻上下颠倒充分
混匀 ,室温静置 10 min;13000 r/min离心 10 min,取上清
液 ,重复氯仿 /异戊醇抽提一次;于上清液中加入 2/3倍
体积的冰冷异丙醇 ,小心混匀至 DNA形成絮状 , -20 ℃
冰箱静置 10 ～ 20 min;4 ℃ 12000 r/min离心 10 min,沉
淀 DNA;弃上清 ,用 75%乙醇洗 2 ～ 3次 ,用滤纸条吸干
残留乙醇 ,在超净工作台内无菌风干 , DNA溶于 200 μL
超纯水;加入 2 μLRNase溶液 56 ℃水浴 2 h;0.8%琼脂
糖凝胶电泳检测 DNA完整性 ,根据 OD260 /OD280、OD260 /
OD230的比值判断有无多糖、蛋白质、RNA等杂质 ,从而确
定 DNA的纯度 ,并计算样品 DNA浓度 ,作为母液 4 ℃保
存备用 。
表 1 部分试验所用引物
序列号 序列 序列号 序列
ISSR1 (AG)8T ISSR2 (GA)8T
ISSR3 (GA)8C ISSR4 (CT)8A
ISSR5 (AG)8C ISSR6 (AG)8YC
ISSR7 (GATA)4 ISSR8 BDB(CA)6
ISSR9 DBD(GA)7 ISSR10 VHV(GT)7
1.4 ISSR-PCR基本反应体系 ISSR-PCR基本反应
体系为 25 μL:10×扩增缓冲液 2.5 μL;MgC12(25mmol/
L)2.0 μL;引物(5 μmol/L)2.0 μL;模板 DNA(20 ～
200 ng/μL)1 μL;2 μLdNTPs(1 mmol/L)2.0 μL;Taq
DNA聚合酶(1 U/μL)1 μL;加入 ddH2O补齐到 25 μL。
1.5 反应体系的优化 在基本反应体系中分别调整模
板 DNA、Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶各因子的用
量 ,进行单因子多水平试验时 ,模板 DNA的用量分别设
为:10、50、100、150 ng;Mg2+浓度分别设为:1.0、1.5、2.0、
2.5 mmol/L;dNTPs浓度分别设为:0.05、0.1、0.2、0.3
mmol/L;引物的用量分别设为:0.1、0.2、0.3、0.4 μmol/
L;TaqDNA聚合酶的用量分别设为:0.5、1.0、1.5、2.0
U,反应进行 3次重复。当 DNA用量优化时 ,其他因素采
用芦笋 PCR基本反应体系所用剂量;Mg2+浓度优化时 ,
DNA为 50ng,其他因素采用上述的 PCR基本反应体系
所用剂量;dNTPs浓度优化时 , DNA为 50 ng, Mg2+为 2
mmol/L,其他因素采用上述的 PCR基本反应体系所用剂
量;引物浓度优化时 , DNA为 50 ng, Mg2+为 2 mmol/L,
dNTPs为 0.2 mmol/L,其他因素采用上述的 PCR基本反
应体系所用剂量;TaqDNA聚合酶优化时 , DNA为 50
ng, Mg2+为 2.0 mmol/L, dNTPs为 0.2 mmol/L,正反引
物各为 0.2 μmol/L。
1.6 ISSR-PCR反应程序 反应程序是 94℃预变性 5
min;32个循环中变性 94 ℃1 min, 48 ～ 53 ℃复性 1 min,
72 ℃延伸 1 min;最后 72℃延伸 10 min。
1.7 PCR产物的检测 ISSR扩增产物分别采用 2%
琼脂糖凝胶电泳和 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分
析 , 2%琼脂糖凝胶电泳用 0.5×TBE电泳缓冲液 ,在恒
定 200 V电压下电泳 40 min,最后在紫外成像系统中照
相并记录分析;6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在恒压
2000 V下电泳 2 ～ 3 h,银染后用数码相机拍照并记录
分析 。
2 结果与分析
2.1 DNA的提取 采用改良 CTAB法提取的芦笋基因
组 DNA(图 1)无 RNA污染 ,无降解现象。 OD值检测 ,得
出 OD260 /OD280比值在 1.78 ～ 1.96之间 ,同时经紫外分光
光度法测得提取的芦笋 DNA浓度在 300 ～ 600 μg/mL之
间。说明改良 CTAB法提取的芦笋基因组 DNA纯度高 ,
蛋白质、酚类及多糖等杂质去除较完全。
2.2 不同 PCR参数对 ISSR-PCR的影响 为了在芦
笋中建立最优的反应体系 ,本研究在基本反应体系中 ,对
影响 ISSR-PCR扩增的模板 DNA、Mg2+、dNTPs、引物、
Taq酶的浓度设置了不同处理。结果表明 ,高质量 DNA
模板是 PCR扩增成功的前提 ,经不同 DNA浓度梯度反
应得出 20 ～ 150 ng的量都能扩增出来(图 2),说明 ISSR
反应中对基因组的量要求不是很严格 ,且扩增效果差别
不大 ,这与笔者在同样的芦笋基因组 SRAP优化中得到
的结论相同 [ 7] 。Mg2+作为反应的催发剂 ,主要是通过影
响 Taq酶活性从而间接影响 PCR扩增 ,结果表明 Mg2+
浓度在 2.0 ～ 2.5 mmol/L时 ,可获得最好的扩增结果 ,浓
度太低造成扩增不完全 ,浓度太高引起条带成拖尾状
(图 3)。 dNTPs是 PCR反应中的原料 ,其浓度大小直接
影响扩增产物的多少 ,经检测得出的浓度是 0.2 mmol/L
比较合适 ,浓度低会造成条带不清楚 ,浓度超过 0.2
mmol/L会引起拖尾状(图 4)。考虑到过高的引物浓度
会生成引物二聚体 ,此试验设置的引物浓度较低。由图
5可见 ,只有引物浓度为 0.2 ～ 0.4 μmol/L时才可以扩
增出较为清晰稳定的条带 ,而其它的浓度如 0.2 μmol/L
以下扩增出的条带都较少。所以最佳引物所需的浓度在
一个大概范围内是 0.2 ～ 0.4 μmol/L(图 5)。TaqDNA
聚合酶的用量为 1 ～ 2 U时 ,其扩增的 DNA片段数和浓
度大小差别不大 ,从经济上考虑利用 1 U就可以扩增出
清晰的条带(图 6)。通过综合各反应因素的影响和用
量 ,得出芦笋基因组较优的 ISSR反应条件 25 μL反应体
系中:DNA50 ng、Mg2+ 2.0 mmol/L2.0 μL、引物 0.2
μmol/L2.0 μL、dNTPs0.2 mmol/L2.0 μL、Taq酶是
1U。
2.3 PCR产物的检测 通过 ISSR扩增产物大小分析 ,
从 100 ～ 2000bp大小不等 ,首先通过在 3%琼脂糖凝胶
39 9期 盛文涛等:芦笋基因组 DNA提取与 ISSR反应体系的优化
电泳分析 ,分辨率中等(图 7),而在 6%变性聚丙烯酰胺
电泳上 ,分辨率清晰(图 8),所以通过试验得出在进行芦
笋 ISSR分析时首先可以通过普通琼脂糖电泳分析 ,得到
初步的分析结果 ,然后再进行垂直胶电泳分析可以得出
更加精细和可靠的结果 ,两者结合共同分析提高筛选
效率。
1～ 10表示不同的模板 DNA;M(λmarker)
图 1 芦笋 DNA0.8%琼脂糖检测结果
1、2、3、4分别代表浓度 10、50、100、150ng;
1和 1＊雌雄DNA;M:MarkerDL2000
图 2 模板 DNA的浓度
1、2、3、4分别代表浓度 1.0、1.5、2.0、2.5mmol/L;
1和 1＊雌雄 DNA;M:MarkerDL2000
图 3 Mg2+浓度梯度扩增
2.4 体系的稳定性检验 根据 ISSR引物的 Tm值 ,在
PCR仪上设置温度最低为 49℃,最大为 54℃,对引物进
行了梯度 PCR扩增 ,从 54个 ISSR引物中筛选了 20个引
物及它们的最适退火温度。利用筛选出的最适退化温度
的 ISSR引物 ,对优化试验得出的反应条件进行稳定性检
验(图 9),经 3次 PCR重复 , 扩增条带较为稳定、分辨率
较高 ,由此推论此次优化的体系的可靠性 ,可以用于以后
的芦笋 ISSR-PCR检测。
1、2、3、4分别代表浓度 0.05、 0.1、 0.15、0.2、0.25mmol/L;
1和 1＊雌雄DNA;M:MarkerDL2000
图 4 dNTPs浓度梯度扩增
1、2、 3、4分别代表浓度 0.1、0.2、0.3、0.4μmol/L;
1和 1＊雌雄DNA;M:MarkerDL2000
图 5 引物浓度梯度扩增
1、2、 3、4分别代表浓度 0.5、1、 1.5、 2U;
1和 1＊雌雄DNA;M:MarkerDL2000
图 6 Taq酶浓度梯度扩增
40 江 西 农 业 学 报 22卷
图 7 ISSR产物 3%普通琼脂糖检测(MarkerDL2000)
图 8 6%变性聚丙烯酰胺凝胶检测(MarkerDL2000)
图 9 ISSR反应扩增图谱(MarkerDL2000)
2.5 引物初步的筛选结果 选取芦笋试验品种材料的
两性株的自交后代分离群体 ,分别等量取 10株雄株和
10株雌株 ,运用群体分离分析法(BSA)以消除样本间遗
传背景的差异 ,建立 5对基因池 ,以提取基因组 DNA用
做引物筛选模板[ 8, 9] 。从扩增产物电泳图中选择条带清
晰 、重复性好、多态性高的引物用作进一步的 ISSR研究 ,
部分筛选引物扩增结果如下(图 10)。通过对 54对引物
筛选得出可以稳定清晰扩增的条带为 39条 ,占整个筛选
引物的 72.2%,说明 ISSR引物适合芦笋基因组的分析。
3 讨论
由于芦笋是多年生作物 ,富含多糖和酚类等次生代
谢物质;芦笋真叶退化 ,针状拟叶 ,叶绿素含量高 ,操作不
方便;且没有专门提取其基因组的相关报道 ,高质量基因
组 DNA是许多芦笋分子生物学实验的前提 ,为此 ,很有
必要对芦笋基因组 DNA提取方法进行研究。其中本试
验利用的改良 CTAB法 ,在其提取试剂中 ,加入巯基乙
醇 ,可以防止氧化现象发生和去除多糖、多酚类物质 ,从
而得到高质量的模板 DNA,因此能够满足普通的 PCR反
应要求。同时 ISSR分子标记试验技术是基于 PCR扩
增 ,反应条件受各反应要素种类和水平的影响 ,所以在进
行相关的芦笋基因组研究时有必要进行各反应条件的筛
选与优化。在基本反应条件中 ,进行各反应条件单因素
浓度的优化 ,使实验具有针对性。本试验曾试图通过在
单因素优化的条件的基础上 ,以利用正交设计开展进一
步的优化使试验更具有科学性 ,但得出在进行正交试验
时 ,评价标准是通过目测观察扩增的条带数 ,使试验带有
一定的主观性 ,不能进行科学分析 ,这是需要改进的地
方 ,所以最后只进行了单因素分析方法[ 10] 。而本试验通
过在基本程序上 ,进行单因素分析同样可以得出可靠稳
定结果 ,说明此方法的可行性 [ 11] 。通过单因素分析得出
DNA模板纯度对 ISSR-PCR影响因素最大 ,其它依次是
Mg2+ , dNTPs,引物和 Taq酶浓度 。
图 10 芦笋基因组的 ISSR引物筛选标记(MarkerDL2000)
目前 ,本课题组正在利用 ISSR分子标记技术及优化
的反应体系进行芦笋种质资源遗传多样性 ,芦笋性别决
定基因的定位和标记转化等研究 ,获得较好的研究结果 ,
将另行报道 。
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(下转第 45页)
41 9期 盛文涛等:芦笋基因组 DNA提取与 ISSR反应体系的优化
M:分子量标准;1～ 5:SPS1;6～ 10:SPS2
图 7 枇杷果实发育过程中 SPS基因表达的RT-PCR分析
3 讨论
目前 ,对于植物基因表达的检测方法多运用分子检
测的方法 ,其中 PCR检测最为常用[ 9] 。根据 GenBank中
登录的植物 SPS基因序列设计一对简并引物 ,利用 RT-
PCR扩增 。本试验编设的退火温度的跨越范围为 10℃,
从高于 Tm值 5 ℃降到低于它 5 ℃,退火温度的降幅为 2
℃。最终 ,通过调整后的 RT-PCR得到了较为理想的扩
增结果 。RT-PCR产物 1%琼脂糖凝胶电泳检测后 ,进
行测序和生物信息学上的分析 ,证实研究所得到的基因
序列即为所需的“青种”枇杷果实 SPS基因的保守片段 ,
即:SPS1(386 bp)和 SPS2(383 bp)。测序结果经 BLAST
分析比对表明本研究所克隆的 SPS1基因片段与桃果实
的 SPS基因(登录号:EF568782)有 91%的同源性 , SPS2
基因片段与柑桔属的 SPS基因(登录号:AB006660)有
81%的同源性。
为了分析 SPS基因在果实发育过程中的表达情况 ,
本试验利用了半定量 RT-PCR方法 。根据 GenBank中
登录的枇杷内参基因序列设计一对引物 ,利用 RT-PCR
扩增找到适合的循环数及退火温度。本试验编设的不同
循环数 ,分别为 24、27、30、33、36、39个循环 ,退火温度的
跨越范围为 15 ℃,从高于 Tm值 10 ℃降到低于它 5 ℃,
退火温度的降幅为 1 ℃。最终 ,通过调整后的 RT-PCR
得到了适合的循环数为 27和较为理想的扩增结果 。RT
-PCR产物 1%琼脂糖凝胶电泳检测 ,而后进行测序 ,证
实得到的基因序列与所需的一致。本研究表明 SPS1和
SPS2基因的表达量均随果实的发育进程而逐渐增加。
其中 ,幼果期(4月 7日)SPS1和 SPS2基因的表达量很
少;膨大期(5月 7日)SPS1基因的表达量明显增加 ,
SPS2基因的表达量在成熟期(5月 21日)明显增加 ,总
的来说 , SPS基因的表达量在枇杷果实膨大期有较明显
的增加。
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