全 文 ：收稿日期:2011-12-10; 修订日期:2012-03-10
基金项目:国家自然科学基金面上项目(No． 81173629)
作者简介:程惠娟(1953-) ，女(汉族) ，上海人，现任安徽中医学院副教授，
硕士研究生导师，主要从事细菌生物膜研究及中药抗感染与免疫研究工
作．
鱼腥草水提液对铜绿假单胞菌生物被膜的影响
及与阿奇霉素的抗菌协同作用
程惠娟，汪长中，汪海波，黄锦亮，颜真波
(安徽中医学院，安徽 合肥 230038)
摘要:目的 研究鱼腥草水提液体外对铜绿假单胞菌生物被膜的影响及与阿奇霉素的抗菌协同作用。方法 应用微量倍
比稀释法测定鱼腥草水提液、阿奇霉素对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC) ，棋盘稀释法测定二者协同抗菌作用，MTT
法测定鱼腥草水提液对铜绿假单胞菌生物被膜内细菌代谢的影响，镜下观察该药对铜绿假单胞菌生物被膜的形态影响。
结果 实验结果提示，鱼腥草水提液对铜绿假单胞菌的 MIC 为 250 g·L －1，协同实验表明与阿奇霉素有抗菌相加作用。
鱼腥草水提液对铜绿假单胞菌生物被膜内细菌代谢的 SMIC50 1，3，7d 分别是 31． 25，62． 5，62． 5 g·L
－1，SMIC80分别是
250，250，250 g·L －1。SMIC80药物浓度显示对铜绿假单胞菌生物膜形态形成有干扰作用。结论 鱼腥草水提液与阿奇霉
素抗菌相加作用明显，并能抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成，为鱼腥草治疗由生物膜引起的慢性感染提供了依据。
关键词:生物被膜; 铜绿假单胞菌; 鱼腥草; 抗菌协同
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 07． 004
中图分类号:R962 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)07-1600-02
The in Vitro Effects of Heartleaf Houttuynia Herb Decoction against Pseudomonas aerugi-
nosa Biofilms and its Synergism with Azithromycin on Planktonic Pseudomonas aerugino-
sa
CHENG Hui-juan，WANG Chang-zhong，WANG Hai-bo，HUANG Jin-liang，YAN Zhen － bo
(Anhui University of Traditional Chinese Medicine，，Anhui Hefei 230038，China)
Abstract:Objective To investigate the effects of Heartleaf Houttuynia Herb Decoction against Pseudomonas aeruginosa biofilms
and its synergistic antibacterial in combination with Azithromycin． Methods Microdilution assay was used to detect MIC of
Heartleaf Houttuynia Herb Decoction to Pseudomonas aeruginosa，checkerboard method was used to exam synergism of Heartleaf
Houttuynia Herb Decoction and Azithromycin，MTT assay was used to detect biofilm metabolized，and microscope was applied to
observe biofilm morphology． Results The MIC of Heartleaf Houttuynia Herb Decoction to Pseudomonas aeruginosa was 250 mg·
ml －1，it synergized with Azithromycin． SMIC50 for Heartleaf Houttuynia Herb Decoction against Pseudomonas aeruginosa biofilms
formed for 1d，3 d，7d were 31． 25 g·L －1，62． 5 g·L －1，62． 5 g·L －1 respectively;SMIC80 for the biofilms were 250，250 g·
L －1，250 g·L －1 respectively． Morphologically Heartleaf Houttuynia Herb Decoction inhibited Pseudomonas aeruginosa biofilms
evidently at the concentration of SMIC80 ． Conclusion Heartleaf Houttuynia Herb Decoction can inhibit Pseudomonas aeruginosa
biofilms，and synergize with Azithromycin．
Key words:Pseudomonas aeruginosa; Biofilms; Heartleaf Houttuynia Herb; Synergistic antibacterial
全球每年死于细菌感染的人数多达一千三百多万，成为致死
的第二位因素，其中细菌对抗生素的耐药性对人类生存形成了重
要的威胁。细菌形成的生物被膜(becteril bioflim，BF)是细菌产
生耐药性的重要因素之一。因此从我国中药中寻找抗生物被膜
的药物是解决细菌耐药问题的重要途径。由于目前中医治疗仍
然以中药水提剂为主，因此本实验选用在中医临床治疗肺系疾病
常用组方成分鱼腥草，研究该药对引起呼吸道生物膜相关感染的
主要致病菌铜绿假单胞菌生物被膜［1 ～ 3］形成的影响，以期为中药
治疗慢性感染提供依据。
1 材料
1． 1 菌株和药物 铜绿假单胞菌(ATCC27853) ，由安徽中医学院
第一附属医院细菌室提供。
鱼腥草购于安徽中医学院第一附属医院中药房，并经鉴定。
按戴自英提供的方法［4］制备生药浓度为 1 000 g·L －1的水提液，
调整 pH至 7． 2 ～ 7． 4，过滤后备用。阿奇霉素(Azithromycin) (石
药集团欧意药业有限公司产品，生产批号:100110101)。
1． 2 试剂和仪器 LB 培养基、胰酶大豆肉汤培养基(Tripticase
Soy Broth，杭州微生物试剂有限公司) ;M － H 培养基(杭州微生
物试剂厂) ;四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma 公司) ;二甲基亚砜
(DMSO，天津市光复精细化工研究所，分析纯) ;自配 pH7． 4 的
PBS溶液。318 酶标仪(上海三科仪器有限公司) ;96 孔微量培养
板(杭州生友生物技术有限公司) ;DPH － 9162 型电热恒温培养
箱(上海一恒科技有限公司) ;CX21 型光学显微镜(日本 Olympus
公司) ;Sirion200 型场扫描电镜(美国 FEI公司)。
2 方法
2． 1 鱼腥草水提液对铜绿假单胞菌的 MIC 及与阿奇霉素的抗
菌协同作用 鱼腥草对铜绿假单胞菌的 MIC 参照文献［5］进行，
药物水提液以 MH 培养基对倍稀释成 10 个浓度梯度最终浓度
0． 98 g·L －1，阿奇霉素按同法稀释最终浓度 0． 98 mg·L －1，分别
加入 96 孔板中，每个浓度 8 个复孔，每孔 100 μl。另设一列不含
药物的培养基作为对照，6 h培养的菌液以比浊法调整到 0． 5 号
麦氏浓度，经 200 倍稀释后，每孔加入 100 μl，振荡，37℃培养 18
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h，以无菌生长的最小药物稀释度为 MIC。
协同抗菌试验采用棋盘法，药物浓度从 2MIC至 1 /8MIC。各
药物孔中加入菌量同 MIC，100 μl /孔。37℃培养 24 h，观察细菌
生长情况。
2． 2 鱼腥草水提液对铜绿假单胞菌生物膜形成代谢的影响
(SMIC80、SMIC50)96 孔酶标板中 SMIC 测定，1 ～ 10 列药物稀释
方法及每孔菌量同 MIC，设 11 列为含菌而不含药物的培养基作
为阴性对照，12 列加培养基作为空白对照，每个浓度 8 个复孔，
至 37℃培养箱中培养，每隔 48 h 换一次含药培养基，在 1，3，7 d
时间点。取出酶标板，MTT 法酶标仪 492 nm 波长下读取 OD
值，8 个复孔取均值，以阴性对照的 OD 值为 100%，各药物组 OD
值为阴性对照的 20%、50%为 SMIC80和 SMIC50。
2． 3 鱼腥草水提液对铜绿假单胞菌生物膜影响的形态观察 药
物以胰酶大豆肉汤调至相应 SMIC80浓度，无菌盖玻片作为载体
放入无菌培养皿中，菌液浓度 1 × 104 cfu /ml。另设不含药物组作
为对照。分别在 37℃温箱中培养，6 h，1，3，7 d 时间点各取 1 片
盖玻片，镀银染色后光学显微镜、扫描电镜下观察形态。
3 结果
3． 1 药物对铜绿假单胞菌的 MIC 及与阿奇霉素的抗菌协同作
用 药物对铜绿假单胞菌的 MIC 见表 1，与阿奇霉素抗菌协同作
用见图 1。
表 1 鱼腥草水提液、阿奇霉素对铜绿假单胞菌的 MIC
药物 MIC
鱼腥草水提液 250． 00 g·L －1
阿奇霉素 31． 25 mg·L －1
图 1 鱼腥草水提液与阿奇霉素的抗菌协同作用
结果提示鱼腥草水提液对铜绿假单胞菌的 MIC 为 250 g·
L －1:阿奇霉素 31． 25 mg·L －1，两药联合后，鱼腥草水提液对铜
绿假单胞菌的 MIC 为 62． 5 g·L －1，阿奇霉素 15． 6 mg·L －1，
FIC = 0． 749，提示两药联合应用后有相加作用。
3． 2 鱼腥草水提液对铜绿假单胞菌生物膜形成代谢的影响 结
果见表 2，图 2。
表 2 鱼腥草对铜绿假单胞菌的 SMIC g·L －1
组别 1d 3d 7d
鱼腥草水提液 SMIC50 31． 25 62． 5 62． 5
鱼腥草水提液 SMIC80 250 250 250
与阳性对照组相比差异显著，P﹤ 0． 01
图 2 鱼腥草对 P． a． BF菌代谢的影响
3． 3 鱼腥草水提液对铜绿假单胞菌生物膜形态的影响 结果见
图 3 ～ 10。图 3，5，7，9 为不加药物阴性对照组，图中可以观察到
细菌从粘附到成熟生物膜形成的过程。铜绿假单胞菌培养 6h
后，光镜下可见载体黏附的细菌增多，而药物作用的载体上细菌
数量少，説明鱼腥草水提液在黏附阶段开始对细菌的粘附有了干
扰。铜绿假单胞菌培养 1，3 ，7 d后细菌黏液质增多致成熟生物
膜形成，扫描电镜下可观察到成熟的生物膜为多层粘液结构，细
菌被完全包埋在生物膜中。而药物组(图 4，6，8，10)菌体形态清
晰，且菌量小，未见黏液，更无生物膜产生。
图 3 Pa培养 6 h(1 000 ×) 图 4 鱼腥草作用 Pa培养 6h(1 000 ×)
图 5 Pa培养 1d(1 000 ×) 图 6 鱼腥草作用 Pa培养 1d(1 000 ×)
图 7 Pa培养 3d(1 000 ×) 图 8 鱼腥草作用 Pa培养 3d(1 000 ×)
图 9 Pa培养 7d(20 000 ×) 图 10 鱼腥草作用 Pa培养 7d(20 000 ×)
4 讨论
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)被世界卫生组织
公认为医院内感染的主要病原菌之一，该菌在感染机体过程中常
以生物被膜方式生长，BF 作为一种生物屏蔽，可使细菌逃逸机体
免疫系统，通过调节细菌代谢状态降低细菌对抗菌药物的敏感
性，并能有效阻止药物透过被膜使直接与菌体接触的抗菌药物浓
度降低，从而导致 BF 相关感染反复发作、难以治愈［ 6，7］。绿假单
胞菌对多种抗生素耐药，使这些感染难以治愈［8］。全球兴起的
对耐药问题的关注，以及有关药物的匮乏，使得我们进入了后抗
生素时代。因此迫切需要从新的途径解决抗生素的耐药问题，中
药在治疗慢性感染中有独特疗效，这是否和抗生物膜继而消除生
物屏蔽有关，值得探讨。自古至今中医治疗以水煎剂为主，因此
本实验选用鱼腥草水煎液探讨该药对铜绿假单胞菌生物膜的作
用，以及和阿奇霉素的协同抗菌作用，为临床治疗相关疾病提供
依据。
鱼腥草为三白草科蕺菜属植物，味辛、微寒、归肺经，具有清
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热解毒、利尿通淋、止血、祛痰止咳、镇痛等多种功能，临床用于肺
痈吐脓、痰热喘咳，热痢，热淋，痈肿疮毒［9］，是国家卫生部正式
确定为药食两用的品种之一，为我国传统常用药物之一，主治呼
吸道感染及皮肤化脓感染，是很多治疗慢性感染经方验方中重要
的一味组药，在中医药中具有重要地位。本实验提示鱼腥草对铜
绿假单胞菌的浮游状态有一定的抗菌活性，虽然鱼腥草单独对浮
游状态的铜绿假单胞菌活性不强，但是和阿奇霉素联合应用时有
抗菌相加作用，两药的 MIC浓度降低提示抗菌活性的增强，这为
中西医结合治疗提供了思路。根据 Bockstael 等报道［10］，本实验
选择 1，3，7 d三个时间点分别作为生物膜形成过程的粘附阶段、
初步生物膜形成阶段、成熟生物膜形成阶段，观察药物对铜绿假
单胞菌生物被膜形成的影响。膜内菌的代谢实验表明鱼腥草对
50%生物被膜形成的干扰活性较强，在生物被膜形成的粘附阶
段，初步、成熟生物被膜形成阶段，31． 25，62． 5 g·L －1浓度的药
物质量就起到干扰作用，这足以消除生物被膜的生物屏障作用从
而有利于其他抗菌药物，以及体内免疫因素发挥杀菌作用，而抑
制 80%生物被膜则需要加大药物浓度至 250 g·L －1。在生物被
膜形态观察的实验中，为了更好的观察细菌粘附载体的过程我们
增加了 6 h组作为不可逆粘附阶段的起始，光镜下观察到铜绿假
单胞菌在 SMIC80药物浓度作用下粘附阶段的载体和不加药对照
组相比，载体上粘附的细菌明显减少，细菌粘附到载体上 1 d 时
可以看到菌体周围已经产生粘液，而药物组，菌体清晰。初步生
物膜形成阶段，药物组细菌减少更明显，菌体清晰，对照组载体上
细菌量多并观察到细菌周围的粘液，细菌被粘液覆盖。细菌培养
7 d时成熟生物膜形成了，扫描电镜下对照组观察到有粘液形成
的厚厚的多层生物膜形态，细菌完全被覆盖，药物组菌体清晰菌
体表面光滑并可以观察到菌体周围的中药结晶体。
本实验表明鱼腥草水提液有抗菌相加、抗铜绿假单胞菌生物
膜作用。临床试验表明，鱼腥草能提高体内巨噬细胞吞噬能力，
增加机体抗感染和特异性体液免疫力，具有较强的抗病毒、抗衰
老、抗癌的功效［11］，这为由鱼腥草组成的复方及其制剂临床治疗
慢性感染提供了依据。鱼腥草来自与天然植物，为药食两用品
种，具毒副作用小、不易形成耐药性等抗生素缺少的优点，因此在
抗感染应方面的应用有着良好的前景。由于鱼腥草成分复杂，究
竟那种成分为抗生物膜和抗菌相加作用的有效成分还有待进一
步的研究。
参考文献:
［1］ Parsek MR，Singh PK． Bacterial biofilms:An emerging link to disease-
pathogenesis［J］． Annu Rev Microbiol，2003，57:677．
［2］ Moreau － Marquis S，Stanton BA，O＇Toole GA． Pseudomonas aeruginosa
biofilm formation in the cystic fibrosis airway［J］． Pulm Pharmacol Ther
2008，21:595．
［3］ Mulcahy H，Charron － Mazenod L，Lewenza S． Extracellular DNA che-
lates cations and induces antibiotic resistance in Pseudomonas aerugino-
sa biofilms［J］． PLoS Pathog，2008，4(11) :e1000213．
［4］ 戴自英．临床抗菌药物学［M］．北京:人民卫生出版社，1985:377．
［5］ 叶应妩，王毓三．全国临床检验操作规程［M］．南京:东南大学出版
社，1997:566
［6］ Cos terton JW，Leandow ski Z，Caldw el l ED，et al． Microbial b iof ilm
［J］． Annu Rev Microbiol，1995，49(10) :711．
［7］ Kobayash i H． Biofilm disease:i ts clinical manif es tat ion an dtherapeut
ic possibil it ies of macrolides［J］． Am J Med，1995，99(6A) :268．
［8］ Heidi H，Sibley CD，Surette MG et al． Drosophila melanogaster as an
Animal Model for theStudy of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infec-
tions In［J］． Vivo PLoS Pathogens October，2011，7 (10) :．
［9］ 国家药典委员会．中国药典［S］．北京:化学工业出版社，2005:155．
［10］ Bockstael K，Geukens N，Van Mellaert L，et al Evaluation of the type I
signal peptidase as antibacterial target for biofilm － associated infection
of Staphylococcus epidermidis［J］． Microbiology，2009，155:3719．
［11］ 巩聿清，武玉锦．鱼腥草的临床药理研究进展［J］．中国药业，2005，
14(3) :73．
收稿日期:2012-01-03; 修订日期:2012-04-06
基金项目:国家自然科学基金(No． 30771140)
作者简介:殷明伟(1957-) ，女(汉族) ，河南郑州人，现任河南大学副教授，硕士研究生导师，学士学位，主要从事中药药理及临床研究工作．
* 通讯作者简介:刘 彬(1959-) ，男(汉族) ，河南巩义人，现任河南大学教授，硕士研究生导师，硕士学位，主要从事分子药理学研究工作．
七种中药对酒精致 PC12 细胞损伤保护作用的研究
殷明伟，王利枝，蒋 燕，邓锦波，刘 彬*
(河南大学护理学院神经生物学研究所，河南 开封 475004)
摘要:目的 观察赤芍、炒白芍、丹参、三七、地榆、黄芪和白芷七种中药对酒精致损伤的 PC12 细胞的保护作用。方法 用
不同浓度的药物分别作用于贴壁的 PC12 细胞 2 h后，加入终浓度达 800 mmol /L的酒精，继续作用 24 h。采用 MTT法检
测不同浓度的中药对酒精致损伤的 PC12 细胞增殖的影响。结果 加入赤芍 (2． 0 ～ 10． 0 mg /ml)、地榆(0． 125 ～ 14． 0 μg /
ml)和丹参 (8． 0 ～ 20． 0μg /ml)后细胞增殖率显著高于单纯酒精处理的 PC12 细胞(P ＜ 0． 01) ;其中赤芍浓度在 10 mg /
ml、地榆浓度在 2 μg /ml、丹参浓度在 14 μg /ml时对细胞的保护作用最强，其余中药对酒精致损伤的 PC12 没有明显保护
作用。结论 赤芍、地榆和丹参能有效的保护酒精所致损伤的 PC12 细胞。
关键词:赤芍; 丹参; 地榆; 酒精; PC12 细胞
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 07． 005
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)07-1602-03
Protective Effects of Seven Kinds of China Traditional Medicine on Ethanol － induced In-
jury in PC12 Cells
YIN Ming-wei，WANG Li-zhi，JIANG Yan，DENG Jin-bo，LIU Bin*
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时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 7 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 7