全 文 ：药材批次少;同时不同地域的差异，也会导致药材所含的有效成
分有一定的差异，因此，对临床用药时，选择药材的道地属性及质
量的优劣具有一定的意义。本实验通过高效液相色谱法建立了
拳参中没食子酸和绿原酸测定方法，并测定了四个产地 10 批次
药材中没食子酸和绿原酸的含量，该含量测定方法准确、简便、灵
敏、重复性好、精密度高;对用药来源的选择提供了一定的依据。
参考文献:
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中没食子酸和绿原酸的含量［J］． 药物分析杂志，2005，25(4) :
390．
收稿日期:2014-02-27; 修订日期:2014-10-20
基金项目:广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项(No． GZPT1206) ;
广西自然科学基金创新研究团队项目
(No． 2011GXNSFF018006)
作者简介:朱 华(1959-) ，男(汉族) ，广西柳州人，广西中医药大学教授，
博士学位，主要从事中药品种、品质及资源开发研究工作．
* 通讯作者简介:王孝勋(1973-) ，男(汉族) ，湖南常德人，广西中医药大
学副教授，博士学位，主要从事中药品种、品质及资源开发研究工作．
对叶百部基因组 DNA提取及 ISSＲ － PCＲ体系优化
朱 华，周雨晴，杜沛霖，王孝勋*
(广西中医药大学，广西 南宁 530022)
摘要:目的 建立适合对叶百部基因组 DNA提取方法及 ISSＲ － PCＲ最佳反应体系。方法 通过改良的 CTAB法提取对叶
百部基因组 DNA，并采用正交试验设计方法对影响 ISSＲ － PCＲ反应体系的 5 种因素(dNTP、模板 DNA、引物、Mg2 +和 Taq
聚合酶)4 个水平进行正交试验，优化 ISSＲ － PCＲ反应体系。结果 确立了对叶百部最佳反应体系，即在 20μl的总反应体
积中含有 10 × PCＲ buffer 2μl，dNTP 175μmol /L，Mg2 + 1． 7mmol /L，引物 0． 6μmol /L，Taq 酶 1． 0U，模板 DNA 15ng。结论
建立并优化了对叶百部基因组 DNA 提取方法及 ISSＲ － PCＲ反应体系。
关键词:对叶百部; DNA提取; ISSＲ; 正交设计; 体系优化
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 01． 085
中图分类号:Ｒ284． 2;S567 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)01-0209-02
对叶百部 Stemona tuberosa Lour．为百部科百部属植物［1］，是
《中国药典》所收载的中药百部 3 个来源品种之一［2］。百部在我
国药用历史悠久，为中医临床常用中药，主要用途为内服止咳、外
用杀虫［3］。据王孝勋［4］进行的百部商品调查显示:百部在国内
各大药市均有销售，其中以对叶百部(大百部)居多。但对叶百
部基本野生，由于破坏性采收以及生态环境的破坏，资源锐
减［5］。因此有必要对对叶百部进行系统的遗传多样性分析，保
护现有的对叶百部野生资源，并进行繁殖研究，该工作具有重要
的生态和经济意义。
简单重复序列间区 (Inter － Simple Sequence Ｒepeat，ISSＲ)
是由 Zietkiewicz等于 1994 年创建的一种新型分子标记技术，与
ＲFLP 和 ＲAPD 技术相比有更高的重复性和稳定性，具有多态性
高、稳定性好、产物特异性强、及操作简单等特点［6］，现已广泛应
用于药用植物种质资源鉴定、进化与亲缘关系分析、遗传多样性
与居群遗传结构检测、遗传作图、基因定位、分子标记辅助育种等
方面研究［7］。由于 ISSＲ主要是由单一引物且以重复序列为主要
引物序列的 PCＲ标记，所以其反应体系易受到 Taq DNA聚合酶、
Mg2 +、引物、模板浓度、dNTP 等因素的影响，建立最佳的 ISSＲ －
PCＲ反应体系对保证试验结果的准确可靠非常重要。
1 材料
1． 1 药材 用于优化体系的为对叶百部嫩叶，2013 年 5 月采自
广西药用植物园，经广西中医药大学中药鉴定教研室王孝勋副教
授鉴定为对叶百部 Stemona tuberosa Lour．。
1． 2 试剂 ISSＲ引物由上海生工合成，Taq DNA聚合酶、dNTPs、
Marker 2000(TaKaＲa －公司 )。经初步筛选将引物 U826［(AC)
8C］作为此次正交试验的引物。
2 方法
2． 1 基因组 DNA的提取 本实验参考改良的 CTAB法［8］提取基
因 DNA。方法适当改进如下:①剪取 1 ～ 2g对叶百部嫩叶放在研
钵中，加 PVP适量，加液氮研磨成粉末;②将粉末转入 2． 0ml 离
心管中，加入 800μl 2% CTAB缓冲液混匀;③65℃水浴 40min，每
隔 10min振摇一次;④取上清液转至新离心管中，加入 1000μl 的
氯仿∶ 异戊醇(24∶ 1) ，颠倒混匀，10000r /min 离心 5min;⑤重复
④操作 1 次;⑥取上清液加入 2 倍体积经 － 20 ℃预冷的无水乙
醇混匀，－ 20℃ 冰箱沉淀 DNA 30min;⑦4℃ 10000r /min 离心
10min，弃上清，沉淀用 70%乙醇漂洗 2 次;⑧室温干燥后 DNA溶
于 200μl 1 × TE中，4℃ 贮存备用。
2． 2 对叶百部基因组 DNA质量检测 使用 1． 5% 琼脂糖凝胶电
泳和紫外分光光度计检测 DNA 纯度与浓度，并将提取的 DNA 稀
释到 60ng /μl备用。
2． 3 ISSＲ － PCＲ反应体系的正交试验设计与扩增程序 采用 L16
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(45)正交试验设计，对影响 PCＲ反应的 Mg2 +、dNTP、TaqDNA 聚
合酶、模板 DNA、ISSＲ 引物浓度进行 5 因素 4 水平筛选，见表
1 ～ 2。总反应体积为 20μl，均含 10 × CＲ buffer 2μl。扩增程序为:
95℃预变性 5 min ;95℃变性 55 s，53℃退火 1 min，72℃延伸 2
min，共 40 个循环 ;72℃最后延伸 10 min。4℃保存。
扩增产物以 2000 bp Ladder Plus Marker 为分子量标记，每管
加入 5μl 有核酸染料的 6 × Loading Buffer 充分混匀，取 10 μl 在
2． 0% 琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照。
表 1 PCＲ反应的因素 －水平设计
水平
Taq 聚合
酶 /U
Mg2 +
/μmol·L －1
dNTP
/μmol·L －1
引物
/μmol·L －1
模板
DNA /ng
1 0． 5 1． 3 125 0． 2 15
2 1． 0 1． 7 175 0． 4 30
3 1． 5 2． 1 225 0． 6 45
4 2． 0 2． 5 275 0． 8 60
表 2 PCＲ反应的［L16(45)］正交设计
编号
Taq 聚合
酶 /U
Mg2 +
/μmol·L －1
dNTP
/μmol·L －1
引物
/μmol·L －1
模板
DNA /ng
1 0． 5 1． 3 125 0． 2 15
2 0． 5 1． 7 175 0． 4 30
3 0． 5 2． 1 225 0． 6 45
4 0． 5 2． 5 275 0． 8 60
5 1． 0 1． 3 175 0． 6 60
6 1． 0 1． 7 125 0． 8 45
7 1． 0 2． 1 275 0． 2 30
8 1． 0 2． 5 225 0． 4 15
9 1． 5 1． 3 225 0． 8 30
10 1． 5 1． 7 275 0． 6 15
11 1． 5 2． 1 125 0． 4 60
12 1． 5 2． 5 175 0． 2 45
13 2． 0 1． 3 275 0． 6 45
14 2． 0 1． 7 225 0． 2 60
15 2． 0 2． 1 175 0． 8 15
16 2． 0 2． 5 125 0． 4 30
2． 4 PCＲ产物扩增统计分析 参照何正文等［9］的方法，通过直
观分析，根据谱带的条带数量和明亮度对扩增结果进行打分。运
用新复极差法(SSＲ法)对扩增结果进行分析，得到对叶百部 IS-
SＲ － PCＲ单因素反应条件的最高分值。
3 结果
3． 1 基因组 DNA电泳检测 对叶百部基因组 DNA 电泳结果见
图 1，基因组 DNA条带清晰，无降解和拖尾现象;电泳孔附近无
残留，表明 DNA中没有其它杂质和蛋白质;紫外分光光度计检测
结果，OD260 /280值范围皆在 1． 70 和 1． 95 之间，浓度均不低于
700ng /μl，说明该对叶百部 DNA提取法纯度和浓度都较高，符合
下游实验对对叶百部基因组 DNA的要求。见表 3。
图 1 对叶百部基因组 DNA电泳图
3． 2 PCＲ扩增结果 正交试验 PCＲ 扩增产物电泳结果见图 2。
由图 2 可知 16 个处理均有条带出现。参照何正文等［9］的方法，
依据条带数量和明亮度对扩增结果进行打分，明亮记 3 分，亮记
2 分，暗记 1 分，无条带记 0 分。结果见表 4。
表 3 对叶百部 OD值及浓度检测
序号 OD260 /280 浓度 /ng·μl － 1
1 1． 824 861
2 1． 803 768
3 1． 749 713
4 1． 871 856
5 1． 934 945
6 1． 709 723
图 2 2． 0%琼脂糖凝胶电泳的检测结果
表 4 对叶百部 ISSＲ正交优化组合扩增结果
序号
条带数
明亮 亮 暗
总赋值 序号
条带数
明亮 亮 暗
总赋值
1 1 1 4 9 9 1 1 3 8
2 1 1 2 7 10 0 4 3 11
3 1 1 2 17 11 0 0 3 0
4 0 0 2 2 12 0 0 3 3
5 1 3 3 12 13 1 0 3 6
6 1 2 3 10 14 1 1 3 8
7 2 2 1 11 15 1 3 3 12
8 1 2 2 9 16 2 1 3 11
3． 3 极差分析结果 运用新复极差法(SSＲ法)对 PCＲ扩增结果
进行分析，得到 ISSＲ － PCＲ反应中单因素反应条件的最高分值。
见表 5。
表 5 极差分析结果
水平
Taq聚合酶
总分 平均分
Mg2 +
总分 平均分
dNTP
总分 平均分
引物
总分 平均分
模板 DNA
总分 平均分
1 25 6． 25 35 8． 75 30 7． 50 31 7． 75 41 10． 25
2 42 10． 5 36 9． 00 34 8． 50 27 6． 75 37 9． 25
3 22 5． 50 30 7． 50 32 8． 00 36 9． 00 26 6． 50
4 37 9． 25 25 6． 25 31 7． 75 32 8． 00 22 5． 50
极差 20 5． 00 11 2． 75 4 1． 00 9 2． 25 19 4． 75
3． 3． 1 dNTP浓度对 ISSＲ － PCＲ 扩增结果的影响 由表 5 可看
出，dNTP浓度为 125μmol /L 时，平均分值最低为 7． 50 分;dNTP
浓度为 175 μmol /L时，平均分值最高为 8． 50 分;说明 175μmol /
LdNTP浓度为对叶百部 PCＲ反应的适宜浓度。
3． 3． 2 模板 DNA 浓度对 ISSＲ － PCＲ 扩增结果的影响 模板
DNA浓度为 60ng时，平均分值最低为 5． 5 分;模板 DNA 浓度为
15ng时，平均分值最高为 10． 25 分;说明 15ng 模板 DNA 浓度为
对叶百部 PCＲ反应的适宜浓度。
3． 3． 3 引物浓度对 ISSＲ － PCＲ 扩增结果的影响 引物浓度为
0． 4μmol /L时，平均分值最低为 6． 75 分;引物浓度为 0． 6μmol /L
时，平均分值最高为 9． 00 分;说明 0． 6μmol /L引物浓度为对叶百
部 PCＲ反应的适宜浓度。
3． 3． 4 Mg2 +浓度对 ISSＲ － PCＲ 扩增结果的影响 Mg2 +浓度为
2． 5mmol /L时，平均分值最低为 6． 25 分;Mg2 +浓度为 1． 7mmol /L
时，平均分值最高为 9． 00 分;说明 1． 7mmol /L Mg2 +浓度为对叶
百部 PCＲ反应的适宜浓度。
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时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 1 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 1
3． 3． 5 Taq酶浓度对 ISSＲ － PCＲ 扩增结果的影响 Taq 酶浓度
为 1． 5U时，平均分值最低为 5． 50 分;Taq 酶浓度为 1． 0U 时，平
均分值最高为 10． 50 分;说明 1． 0U Taq 酶浓度为对叶百部 PCＲ
反应的适宜浓度。
采用极差法对正交试验中各单因素进行分析后得到最佳处
理组合为 即:dNTP浓度为 175μmol /L，模板 DNA浓度为 15ng，引
物浓度为 0． 6μmol /L，Mg2 +浓度为 1． 7mmol /L，Taq 酶浓度为1． 0
U，总反应体积为 20μl。
4 讨论
DNA提取是进行分子生物学实验的先决条件，模板 DNA 的
含量是制约扩增产物稳定性及特异性的一个重要因素，往往影响
PCＲ的成功。植物生长过程中产生大量多糖、多酚等次生代谢产
物，且组分与含量随植物生长周期和环境条件存在较大差异，在
提取过程中 DNA容易被多酚氧化酶所降解，这就给 DNA的提取
带来困难，本实验在改良的 CTAB 法中加入 2%的 PVP － 40，使酚
类化合物的结构更稳定，也使酚类化合物因多酚氧化酶的失活而
不能形成复合物;在抽提过程中更易去除，提高了 DNA 的纯度;
同时把“酚∶ 氯仿∶ 异戊醇(25∶ 24∶ 1)”替换成“氯仿∶ 异戊醇
(24∶ 1)”，能较好地去掉多酚等杂质。所提取的对叶百部基因
组 DNA 纯度高、质量好，可以用于分子生物学实验。
有关 PCＲ 反应体系优化的报道很多，但大多是采用简单的
梯度试验方法对每个因素的最佳水平进行摸索，需要进行多次梯
度试验，过程繁琐，且不能兼顾到各因素间的交互作用，对试验结
果的判断缺少量化，缺乏一定的标准。而正交实验设计具有分散
均衡、综合可比、可伸缩性强及效用明确的特性，了解各因素之间
的内在规律，能较快的找到最优水平的组合［10］。本实验利用 L16
(45)的实验设计对对叶百部 PCＲ反应体系中的 5 种主要影响因
素进行了优化，并结合极差法，对试验中各单因素进行分析，建立
了适合对叶百部的 ISSＲ － PCＲ 最佳反应体系，为对叶百部遗传
多样性研究、品种鉴定、亲缘关系分析、遗传作图等奠定了基础。
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名家名流
收稿日期:2014-02-18; 修订日期:2014-08-01
基金项目:国家中医药管理局课题(No． 1199ws02) ;
广东省科学技术厅———广东省中医药科学院联合科研专项
(No． 2012A032500007)
作者简介:温丹婷(1985-) ，女(汉族) ，广东梅州人，广州中医药大学博士
研究生，主要从事中医药治疗不孕症、子宫内膜异位症工作．
* 通讯作者简介:徐 珉(1970-) ，女(汉族) ，湖北襄阳人，广东省中医院
主任医师，硕士研究生导师，博士学位，主要从事女性生殖健康及生殖障
碍的中医药防治研究工作．
李丽芸教授治疗卵巢储备功能降低不孕中医临证思考
温丹婷1，李秀铭2，张 茜1，刘志清2，周慧萍2，王小云2，曹立幸2，徐 珉2*
(1．广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510045;
2．广州中医药大学第二附属医院·广东省中医院，广东 广州 510120)
摘要:总结了李丽芸教授治疗卵巢储备功能降低不孕的临证思考经验。李师认为卵巢储备功能降低病机特点主要是
“肾气衰，天癸竭”，与各脏腑相关。肾虚为本，李师将其分为肾阳虚型、肾阴虚型、肾阴阳俱虚型，认为中医治疗以补肾填
精为大法，温补肾阳:温肾暖宫，健固督带，滋养肾阴，调理气血，调理冲任。同时应强调预防为主，未病先防，已病防变，
主张中西医结合治疗。
关键词:卵巢储备功能降低; 不孕; 李丽芸
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 01． 086
中图分类号:Ｒ249． 2 / ． 7 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)01-0211-03
祖国医学中并无“卵巢储备功能下降”“生育潜能下降”“生
殖衰老”的病名，而是根据其不同的临床表现归纳到不同的中医
疾病中。卵巢储备功能下降一般可表现为月经周期改变、经量改
变、不孕及潮热、盗汗、烦躁等围绝经期症状，故本病应属中医学
中的“月经先期”“月经后期”“月经先后不定期”“月经过少”“崩
漏”“全不产”“断续”“绝经前后诸证”等。
李丽芸是广州中医药大学教授，著名中医妇科学家罗元恺教
授学术继承人，全国第二三批名老中医药专家学术传承指导老
师。李教授从医五十余年，治学严谨，有坚实的理论基础及丰富
的临床经验，尤擅长治疗卵巢早衰、卵巢储备功能下降不孕等病，
·112·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 1 时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 1 期