全 文 ：收稿日期:2011 － 03 － 01．
基金项目:湖北民族学院园艺专业大学生创新项目;国家民委科研资助项目(08HB06)．
作者简介:何娜娜(1989 － ) ，女，主要从事园艺学研究． * 通讯作者:王东辉(1967 － ) ，男，副教授，主要从事生物统计与试验设计研究．
不同产地五鹤续断的同工酶研究
何娜娜，李 慧，王东辉* ，匡华琴，吴 敏，陈冬冬
(湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)
摘要:为了分析恩施州不同产地续断之间的亲缘关系，采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，对恩施州 8 个地区的
五鹤续断进行了过氧化物酶和超氧化物歧化酶同工酶酶谱分析． 8 个地区的续断共电泳出 5 条 POD同工酶酶谱和
4 条 SOD同工酶酶谱，通过聚类分析得出，利川市元堡、恩施市双河地区的续断亲缘关系很近，鹤峰县太平乡和恩
施市鱼塘坝上坝地区的续断亲缘关系也较近，而巴东县绿葱坡与其他地区的差异较大．
关键词:续断;凝胶电泳;过氧化物酶;超氧化物岐化酶
中图分类号:Q946． 5;Q949． 781． 5 文献标识码:A 文章编号:1008 － 8423(2011)03 － 0291 － 04
Studies on Isozymes of Dipsacus from Different Origins
HE Na － na，LI Hui，WANG Dong － hui* ，KUANG Hua － qin，WU Min，CHEN Dong － dong
(School of Biological Science and Technical，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China)
Abstract:In order to analyze genetic relation － ship Dipsacus from different origins in Enshi，Dipsacus
from eight areas of Enshi were conducted on peroxidase and superoxide dismutase isozyme analysis，by u-
sing vertical polyacrylamide gel electrophoresis． A total of 5 POD and 4 SOD isozymes were electrophore-
sed out． The cluster analysis shhws that the Dipsacus in Yuanbao of Lichuan city and the Disacus in
Shuanghe of Enshi City have very close genetic relationship，the Disacus in Taiping of Hefeng County and
the Disacus in Yutangba of Enshi City also have close genetic relationship，but the Dipsacus in Lücongpo
of Badong County is quite different from that of other areas．
Key words:Dipsacus;gel electrophoresis;peroxidase;superoxide dismutase
道地药材五鹤续断是一种常用中药，它是川续断科植物川续断(Dipsacus asper wall．)的干燥根，具有补
肝益肾、续筋接骨、通血脉的功效．其性苦、辛、微温，用于腰膝酸软、风湿 痛、崩漏经多、胎漏下血、跌打损伤
等．续断中含有挥发油、生物碱、多糖、蛋白质和多种重金属离子等主要有效成分．五鹤续断产量高，市场需求
量大，临床应用范围广，开发前景好，但目前续断品种杂，不同产地的续断形态差异较大［1］，因此很有必要对
五鹤续断进行更深入的研究．
目前，对续断植物的研究主要有品种考证［2］、栽培种植［3］、生物学特性［4］、药理作用［5］、临床应用［6］、质
量辨别［7］、有效化学成分的分离［8］等．而同工酶分析技术广泛应用于中药材亲缘关系及道地性研究中［9］．同
工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶，是基因表达的直接
产物，在很大程度上能反映植物个体的遗传差异．同工酶结构的相似性反映了生物间的亲缘关系，酶谱资料
可以作为鉴定物种，研究分类、进化、遗传和变异的重要参数［10］．其中过氧化物酶是由单基因决定的同工酶，
具有物种、组织器官和发育阶段的特异性，在一定程度上能较好的反映不同种源间的遗传差异．超氧化物岐
化酶是一种与氧环境有关、具有清除氧自由基能力的酶［11 － 12］．故本试验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技
术，分离续断叶片中过氧化物酶和超氧化物歧化酶同工酶，比较电泳后的谱带来分析不同产地续断的亲缘关
第 29 卷第 3 期 湖北民族学院学报(自然科学版) Vol． 29 No． 3
2011 年 9 月 Journal of Hubei University for Nationalities(Natural Science Edition) Sep． 2011
系，为续断植物的分类、选育及遗传研究提供理论依据．
1 材料与方法
1． 1 实验材料
采自建始县龙坪、利川市元堡、恩施市鱼塘坝上坝、恩施市鱼塘坝硒矿区、巴东县绿葱坡、恩施市双河、鹤
峰县太平乡、鹤峰县五里坪地区 8 个产地的五鹤续断．
1． 2 实验仪器
电子天平，DYY －10C型垂直电泳槽及电泳仪(北京六一仪器厂) ，飞鸽牌 GL － 16G － II 高速冷冻离心
机(厂家) ，SZ － 93 自动双重纯水蒸馏器(厂家)．
表 1 聚丙烯酰胺凝胶配制表
Tab． 1 Polyacry lamide gel preparation table
9%分离
胶 /mL
10%分离
胶 /mL
4%浓缩
胶 /mL
30%Acr － 0． 8% Bis贮液 2． 90 2． 60 0． 70
分离胶缓冲贮备液 pH =8． 8 3． 00 3． 40 —
浓缩胶缓冲贮备液 pH =6． 8 — — 1． 20
重蒸馏水 4． 00 1． 90 3． 50
10%Ap 0． 10 0． 10 0． 05
TEMED 0． 01 0． 01 0． 02
1． 3 试剂的配制和准备
1)30%Acr － 0． 8% Bis 贮液:称取 30 g 丙烯酰胺(Acr)和 0． 8 g 甲叉双丙烯酰胺，置于洗净烘干的烧杯
中，加 50 mL重蒸水溶解，搅拌，最后用重蒸水定容至 100 mL，盛于棕色瓶中，在 4℃冰箱中保存．
2)分离胶缓冲贮备液(3 mol /LTris － HCl pH8． 8) :称取 18． 2 gTris，加 40 mL重蒸馏水溶解，再用 1 mol /L
HCl调至 pH =8． 8，然后定容至 100 mL，盛于棕色瓶中，4℃保存．
3)浓缩胶缓冲贮备液(0． 5mol /L Tris － HCl pH6． 8) :称取 6． 7 gTris，加 30mL重蒸馏水，再用 1mol /L HCl
调至 pH =6． 8，然后定容至 100 mL，盛于棕色瓶中，4℃保存．
4)10%的过硫酸铵(10%Ap) :称取 0． 5 g过硫酸铵溶于 5 mL重蒸馏水．使用时现配现用．
5)电极缓冲液 (0． 25 mol /LTris，1． 92 mol /L甘氨酸，pH8． 3) :称取 3 gTris 和 14． 4 g 甘氨酸溶解在 50 mL
蒸馏水中，用浓盐酸调节 pH值至 8． 3，用重蒸馏水定容至 1 000 mL ，盛于棕色瓶中，保存在 4℃冰箱中备用．
6)样品提取液 A(0． 05 mol /L Tris － HCl pH8． 0) :称取 0． 6 gTris，与 30 mL 0． 1 mol /L HCl混匀，调节 pH
值至 8． 0，加水稀释至 100 mL．
7)样品提取液 B(0． 05 mol /L 磷酸缓冲液 pH7． 8) :含 1% PVP(聚乙烯吡咯烷酮)．
8)样品处理液(40%Gly － 0． 1%溴酚蓝溶液) :称取 0． 1 g溴酚蓝，甘油 40 mL，加蒸馏水溶解，定容至 100
mL，盛于棕色瓶中，保存在 4℃冰箱中备用．
9)TEMED溶液:直接用原液．
1． 4 试验方法
1． 4． 1 样品处理 分别称取 8 个地区续断新鲜叶片 0． 2 g，放入事先冰浴的研钵中，加入 1 mL 样品缓冲液
(POD同工酶样品提取液用缓冲液 A 0． 05 mol /L Tris － HCl pH8． 0，SOD同工酶样品提取液用样品提取液 B
0． 05 mol /L 磷酸缓冲液 pH7． 8)．研磨后将匀浆全部转入离心管，配平后放入 4℃离心机 10000 r /min离心 15
min，取上清液冷藏待用．
1． 4． 2 凝胶制备 分离胶制备经过反复实验对比，
确定浓缩胶浓度为 4%，分离胶浓度 POD 同工酶为
9%，SOD同工酶为 10%，配方如表 1．
1． 4． 3 染色方法 POD 同工酶采用醋酸联苯胺
法:称取 0． 1 g联苯胺，加少量无水乙醇溶解，依次加
5 mol /L HAc 10 mL，1． 5 mol /L NaAc 10 mL，H2O 70
mL ，最后加入 3 ～ 5 滴 H2O2 ． 将此显色液倾入培养
皿中，待电泳凝胶片加入后不断搅动．常温下染色 5
min，显色完毕用蒸馏水清洗数次，7%醋酸固定． 数
码相机照相． SOD同工酶的染色先将电泳好的凝胶浸入含有 0． 24 mmol /L NBT 和 0． 28 mmol /L 核黄素的
pH7． 8、50 mmol /L 的磷酸缓冲液中，暗中反应 20 min;取出后再浸入含有 28 mmol /L TEMED(Mr:116． 2)的
pH7． 8、50 mmol /L的磷酸缓冲液中，光下(600Lx)显色，直至凝胶上呈现出无色的 SOD同工酶条带时照相．
1． 4． 4 结果计算 酶带迁移率(Rf)=酶带迁移距离 /溴酚蓝迁移距离．
相似系数计算公式:S = 2w / (a + b)．其中 S 为相似系数;w 为 2 个品种相同的条带数;a、b 分别为 2 个
品种各自的条带数．
292 湖北民族学院学报(自然科学版) 第 29 卷
聚类分析:根据同工酶谱带的迁移率(Rf) ，利用 NTSYS 2． 10e软件进行计算，得到聚类分析图．
1，建始县龙坪;2，利川市元堡;3，恩施市鱼塘坝上坝;4，恩施市鱼塘坝硒矿区;
5，巴东县绿葱坡;6，恩施市双河;7，鹤峰县太平乡;8，鹤峰县五里坪．
图 1 POD同工酶酶谱
Fig． 1 The map of POD isozymes
图 2 续断聚类分析图(POD)
Fig． 2 Dendrogram by cluster analysis of Dipsacus asper
2 结果与分析
2． 1 不同产地续断的过氧化物酶酶谱分析
2． 1． 1 过氧化物酶 POD电泳图像
图 1 中电泳图谱分别代表了五鹤续断
根径叶中 POD同工酶谱带，不同产地
续断的酶带各有不同． 供试材料共显
示出 5 条谱带，从负极到正极依次编
号为 Rf1 ～ Rf5 ． Rf 值在 0． 35 ～ 0. 55 之
间，其中 Rf2为除了 5 号材料外，其他
材料共有的谱带，可作为续断在过氧
化物同工酶谱上的特征酶带． 在 8 份
供试材料中，1 号(建始县龙坪)和 3
号(恩施市鱼塘坝上坝)所显示的酶
谱完全相同且酶带最多，有 4 条;5 号
(巴东县绿葱坡)所显示的酶带最少，仅有 1 条．
2． 1． 2 相似系数分析 计算不同产地续断过氧化物酶酶带迁移率(Rf) ，结果如表 3;以及 8 个不同续断产
地类型酶谱间相似系数，结果如表 4．
表 3 8 个产地续断过氧化物酶同工酶酶谱 Rf 值
Tab． 3 Rf values of peroxidese isozeymes
of Dipsacus from eight origins
样品编号 Rf1 Rf2 Rf3 Rf4 Rf5
1 0． 350 0． 405 — 0． 455 0． 550
2 — 0． 405 — — —
3 0． 350 0． 405 — 0． 455 0． 550
4 0． 350 0． 405 — 0． 455 —
5 — — 0． 445 — —
6 — 0． 405 — — —
7 0． 350 0． 405 — 0． 455 —
8 — 0． 405 0． 445 — —
表 4 8 个不同品种续断酶谱间相似系数(POD)
Tab． 4 Similar coefficient of isoenzyme bands
of Dipsacus asper in eight
品种编号 1 2 3 4 5 6 7 8
1 1． 000
2 0． 400 1． 000
3 1． 000 0． 400 1． 000
4 0． 857 0． 5 0． 857 1． 000
5 0 0 0 0 1． 000
6 0． 400 1． 000 0． 400 0． 500 0 1． 000
7 0． 857 0． 500 0． 857 1． 000 0 0． 500 1． 000
8 0． 333 0． 667 0． 333 0． 400 0． 667 0． 667 0． 400 1． 00
由表 4 可见，8 份供试材料相似系数最大的为 1(1 号和 3 号;2 号和 6 号;4 号和 7 号) ;相似系数最小的
为 0．相似度越大，说明物种间的酶谱差异越小，物种间关系越密切，反之则说明差异越大． 5 号除了与 8 号的
相似系数为 0． 667，与其他材料的相似系数都为 0，说明了 5 号(巴东县绿葱坡)与其他地区续断差异性最大，
亲缘关系较远．
2． 1． 3 遗传距离及聚类分析 根据相似系数的聚类结果表明，在聚类距离 0． 680 左右，8 份续断材料可以
分为 3 大类．第一大类包括建始县龙坪、恩施市鱼塘坝上坝、恩施市鱼塘坝硒矿区、鹤峰县太平乡;第二大类
包括利川市元堡、恩施市双河、鹤峰县五里坪;第
三类只包括巴东县绿葱坡的材料． 说明了巴东县
绿葱坡的续断材料与其他地区的差异性最大．
2． 2 不同产地续断的超氧化物酶酶谱分析
2． 2． 1 超氧化物的 SOD 电泳图谱 图 3 中电泳
图谱分别代表了五鹤续断 SOD 同工酶谱带，不同
产地续断的酶带各有不同． 供试材料共显示出 4
条谱带，依次编号为 Rf1 ～ Rf4 ． Rf 值在 0． 167 ～
0. 667 之间． 2 号、3 号、4 和 5 号材料的谱带都为 2
392第 3 期 何娜娜等:不同产地五鹤续断的同工酶研究
条，Rf值较为接近． 6 号、7 号和 8 号材料的谱带都为 4 条，1 号材料为 3 条谱带．
图 4 续断聚类分析图(SOD)
Fig． 4 Dendrogram by cluster analysis of Dipsacus asper
1，鹤峰县五里坪;2，利川市元堡;3，恩施市双河;4，建始县龙坪;
5，恩施市鱼塘坝硒矿区;6，鹤峰县太平乡;7，巴东县绿葱坡;8，恩施市鱼塘坝上坝．
图 3 SOD同工酶酶谱
Fig． 3 The map of SOD isozymes
2． 2． 2 相似系数 计算不同产地续断超氧化物岐化酶的 Rf 值，如表 6．据表 6 Rf 值计算再得酶谱间相似系
数，如表 7．
表 6 8个产地续断超氧化物歧化酶同工酶酶谱 Rf 值
Tab． 6 Rf values of superoxide isozymes
of Dispacus from eight origins
样品编号 Rf1 Rf2 Rf3 Rf4
1 0． 167 0． 450 — 0． 600
2 — 0． 433 — 0． 633
3 — 0． 467 — 0． 633
4 — 0． 467 — 0． 633
5 — 0． 467 — 0． 667
6 0． 267 0． 433 0． 533 0． 633
7 0． 300 0． 433 0． 500 0． 600
8 0． 300 0． 433 0． 500 0． 567
表 7 8 个不同品种续断酶谱间相似系数(SOD)
Tab． 7 Similar coefficient of isoenzyme bands
of Dipsacus asper in eight different regions
品种编号 1 2 3 4 5 6 7 8
1 1． 000
2 0． 400 1． 000
3 0． 400 1． 000 1． 000
4 0． 400 1． 000 1． 000 1． 000
5 0． 400 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000
6 0． 856 0． 667 0． 667 0． 667 0． 667 1． 000
7 0． 856 0． 667 0． 667 0． 667 0． 667 1． 000 1． 000
8 0． 856 0． 667 0． 667 0． 667 0． 667 1． 000 1． 000 1． 000
由相似系数可知，2、3、4、5 号之间相似系数都为 1． 000，说明它们的亲缘关系很接近． 6、7、8 号之间相似
系数也为 1． 000，它们的亲缘关系也很接近．
2． 2． 3 遗传距离及聚类分析 根据相似系数的聚类结果表明，在聚类距离 0. 560 左右，8 份续断材料可以
分为四大类．第一类只有鹤峰县五里坪的续断;第二
类包括利川市元堡、恩施市双河、建始县龙坪、恩施市
鱼塘坝硒矿区的续断;第三类只有鹤峰县太平乡的续
断;第四类包括巴东县绿葱坡和恩施市鱼塘坝上坝的
续断．
3 结论与讨论
同工酶是由基因决定的，同工酶谱带的差别能够
反映不同地区续断间遗传基础的相互联系与差异．恩
施州 8 个产地续断的过氧化物同工酶酶谱条带数目最多 4 条，最少 1 条，除了巴东县绿葱坡地区的没有第二
条谱带以外，其他 7 个地区的都有第二条谱带．超氧化物歧化酶谱条带数目最多 4 条，最少 2 条，并且都有第
二条和第四条谱带，说明各地区五鹤续断有着共同的遗传基础．比较两种酶的聚类分析结果可以看出，利川
市元堡和恩施市双河地区的续断亲缘关系很近，鹤峰县太平乡和恩施市鱼塘坝上坝地区的续断亲缘关系很
近．巴东县绿葱坡与其他地区的差异较大，可能是由于巴东与其他地区气候差异较大，该产区的续断发生了
基因突变．
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492 湖北民族学院学报(自然科学版) 第 29 卷
3 结论
采用 pH值培养基和反应 pH值条件对 3 个根霉菌株产酶活性的研究中发现，pH 值对 3 个根霉菌株的
生长及产酶活性的影响较大，在 pH 4． 6 ～ 5． 8 时，3 个根霉菌株产酶活性相对较大，除此之外，酶的活性小很
多．实验的过程中主要对糖化酶、液化酶、蛋白酶的活性进行了研究，发现酶的种类不同，适宜的 pH 范围不
同，根霉菌株产糖化酶液化酶适宜 pH为 4． 6 ～ 5． 2，糖化酶的活性达到 1． 41 × 102 ～ 1． 59 × 102U /g，液化酶的
活性达到 0． 69 × 103 ～ 2． 21 × 103U /g，菌株产蛋白酶的适宜 pH 5． 8，蛋白酶活性为 1． 98 × 102U /g ～ 2． 58 ×
102U /g．酶在反应的过程中提供适宜的 pH，有利酶促反应的进行，pH4． 6 时，糖化酶的活性可提高到 1． 52 ×
102 ～ 3. 21 × 102U /g，蛋白酶在反应的过程中提供 pH5． 8，酶的活性可提高到 2． 56 × 102 ～ 2． 97 × 102U /g，液
化酶在反应的过程中受 pH值的影响较大，提供 pH5． 2 ～ 5． 8，酶的活性明显高于其他的 pH 值范围，与产酶
条件下提供的 pH相比，不能提高液化酶的活性，但控制 pH 值是保证稳定酶活性的重要手段． 在 3 个菌株
中，ERh3421 的优势更明显，其糖化酶、液化酶、蛋白酶的活性高于其他 2 个菌株．
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