全 文 ：·食 用菌· 北方园艺 2010(22):174～ 176
第一作者简介:王虹(1978-),女,本科,讲师,现主要从事化学化工
等方面的教学与科研工作。
收稿日期:2010-09-08
黄绿蜜环菌产胞外多糖发酵培养的研究
王 　虹1 , 游潇 倩2 , 余 　梅2 ,3
(1.青海大学化工学院 ,青海西宁 810016;2.南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095 ;3.青海普兰特药业有限公司 ,青海西宁 810007)
　　摘　要:通过正交试验法分析了精制培养基与粗犷培养基对黄绿蜜环菌液体发酵产胞外多
糖的影响 ,以期获得比较适宜的培养基组成。结果表明:黄绿蜜环菌胞外多糖较优的精制培养基
组成为:每100 mL含马铃薯20 g 、葡萄糖 4 g、酵母膏0.20 g 、KH2PO4 0.15 g 、MgSO4 0.05 g ,每 1
mL含VB1 12μg ,pH 6.0。
关键词:黄绿蜜环菌;胞外多糖;培养基组成
中图分类号:S 646.1+9　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2010)22-0174-03
　　黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens)属白蘑科蜜环
菌属食用菌 ,俗称黄蘑菇。它味道鲜美 ,香气浓郁 ,含有
丰富的蛋白质 、矿物质 、氨基酸和多种维生素及增强机
体免疫功能和抑制肿瘤生长等生理活性的化学成分 ,具
有较高的营养价值和食疗保健作用 ,特别是“硒” 的含量
很高 ,是癌症的克星。现主要分布于青海省的海北(祁
连、海晏 、刚察),黄南(泽库 、河南),海南(共和 、贵德 、兴
海),果洛(玛沁 、甘德 、久治),玉树等地。曾有报道 ,黄绿
蜜环菌中提取的多糖具有抗肿瘤的作用[ 1] 。近年来 ,野
生黄绿蜜环菌的过度采食 ,加上退变的生境致使发生量
逐年减少[ 2] 。因此对黄绿蜜环菌胞外多糖的工业化生
产研究 ,无论从食品工业方面还是从医疗保健方面来说
都是很有研究价值的。现通过对精制培养基与粗矿培
养基组成及二者结果的显著性比较 ,旨在为黄绿蜜环菌
胞外多糖的深入研究和开发利用提供参考。
1　材料与方法
1.1　试验材料
1.1.1　菌种　黄绿蜜环菌(青海大学微生物实验室保
存)。
1.1.2　试验仪器　GXZ-300型智能光照培养箱;SW-
CJ-2FD型双人单面净化工作台;UV-9200紫外可见分
光光度计;LDZX-40Ⅱ立式自动压力蒸汽灭菌器;84-Ⅱ型
磁力恒温搅拌器;AdventurerTM 天平;数显恒温水浴锅
HH-6;格兰仕微波炉。
1.1.3　培养基　液体种子培养基:马铃薯 20%,蔗糖
2%,蛋白胨 0.2%,KH2PO4 0.15%,MgSO4 0.05%,pH
6.0[ 3] 。基础发酵培养基:马铃薯 20%, 碳源 ,氮源 ,
KH2PO4 0.15%,MgSO4 0.05%,pH 6.0[ 4] 。
1.2　试验方法
1.2.1　发酵方法　种子斜面培养:从原种取一小块菌体
到 PDA斜面培养基 ,置于光照培养箱中 ,温度控制在
(25±1)℃,培养4～ 5 d ,菌体长满斜面的3/4时 ,即可作种
子斜面使用[3] 。液体菌种制备:取一块约 0.5 ～ 1.0 cm2
的菌块接种到250 mL三角瓶中 ,其装液量为100 mL ,置
于光照培养箱中 ,温度控制在(25±1)℃,光照强度为
2 000 lx ,静置培养 3 d ,得液体菌种[ 5] 。
1.2.2　黄绿蜜环菌菌丝生物量测定　将培养 6 d的发
酵液过滤后得菌丝体 ,用蒸馏水冲洗2 ～ 3次 ,60℃条件
下烘干至恒重 ,电子天平称重[ 4] 。
1.2.3　黄绿蜜环菌液体发酵胞外多糖含量的测定　用
蒽酮—硫酸法[ 4] 测定黄绿蜜环菌液体发酵胞外多糖含
量。葡萄糖标准曲线制作:精确称取干燥恒重的葡萄糖
100 mg 配制成溶液 ,分别准确吸取 10、20、30 、40 、60、80、
100、120 、140 、160μL 置于比色管中 ,加蒸馏水至 1 mL ,
各管中加入蒽酮 3 mL。于 620 nm波长处测定其吸光
度 ,以糖的质量浓度为纵坐标 ,吸光度为横坐标 ,绘制葡
萄糖标准曲线。黄绿蜜环菌液体发酵胞外多糖含量测
定:将发酵液过滤除去菌丝体 ,取 2.5 mL 液体 ,加入 3
倍体积的乙醇 ,低温静置 12 h ,离心 ,去上清液 ,将沉淀
溶解 ,定容至50 mL。
1.3　发酵培养基的优化
1.3.1　不同碳源对生物量及 EPS 含量的影响　培养基
组成:碳源 2%,蛋白胨 0.2%,KH2PO 4 0.15%,MgSO4
0.05%,pH 6.0。碳源种类:乳糖 、蔗糖 、葡萄糖 、可溶性
淀粉 、大米 、小麦汁 、玉米粉 、白糖。
1.3.2　不同氮源对生物量及 EPS 含量的影响　培养基
组成:葡萄糖2%,氮源(以0.2 g蛋白胨的氮量0.0291 g
为基础 , 折算后分别加入), KH2PO4 0.15%, MgSO4
0.05%,pH 6.0。
1.3.3　精制培养基正交实验　培养基组成:马铃薯
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北方园艺 2010(22):174 ～ 176 ·食 用菌 ·
20%,葡萄糖酵母膏 ,生长因子 VB1 , KH2PO4 0.15%,
MgSO4 0.05%,pH 6.0 ,试验因素和水平见表1。
　　表 2　　　　正交实验因素和水平
水平 因素
A B C
葡萄糖/g·(100mL)-1酵母膏/ g·(100mL)-1 VB1/μg·mL-1
1 2% 0.2% 8
2 4% 0.4% 10
3 6% 0.6% 12
1.3.4　粗培养基正交实验　组成:马铃薯 20%,白糖 ,
麸皮 ,生长因子 VB1 , KH2PO4 0.15%,MgSO4 0.05%,
pH 6.0 ,试验因素和水平见表 2。
　　表 1　　　　正交实验因素和水平
水平 因素
A B C
白糖/g·(100mL)-1麸皮汁/ g·(100mL)-1 VB1/μg·mL-1
1 2% 2% 8
2 4% 3% 10
3 6% 4% 12
2　结果与分析
2.1　标准曲线
该试验操作中得到葡萄糖的标准曲线回归方程 ,
A=0.1899C-0.0158(R2 =0.996),表明试验范围内线
性良好。
2.2　发酵培养基的优化
2.2.1　不同碳源对菌丝生物量及 EPS含量的影响　黄
绿蜜环菌对不同种类碳源(精制 、粗)的利用能力不同 ,
从而导致菌丝体在碳源不同的培养基中生长状况的不
同 ,因而会影响其生物量和胞外多糖的产量。由图 1可
知 ,菌丝生物量与 EPS含量有一定的正相关性 ,可以确
定黄绿蜜环菌液体发酵最佳精制碳源为葡萄糖 ,最佳粗
碳源为白糖。对于精制碳源的培养基中所含有的未被
消耗糖类物质和粗碳源其组成成分的不确定性 ,都可能
对试验结果产生一定的影响 ,但基于其主要成分为糖类
物质 ,故可用以上几种物质作为粗碳源进行初步测定。
图 1　碳源对菌丝生物量以及 EPS 含量的影响
2.2.2　不同氮源对菌丝生物量及 EPS含量的影响　由
图2可知 ,菌丝生物量与 EPS含量有一定的正相关性 ,
酵母膏作为氮源时最有利于菌体生长以及 EPS 产生 ,可
以确定黄绿蜜环菌液体发酵最佳精制氮源为酵母膏 ,最
佳粗氮源为麸皮汁。
2.2.3　精制培养基成分优化正交实验结果　根据以上
图 2　氮源对菌丝生物量以及 EPS 含量的影响
结果 ,以黄绿蜜环菌菌丝生物量以及 EPS含量为指标 ,
分别进行精制培养基和粗培养基的 L9(34)正交实验 ,对
培养基组成进行优化。并对 2组正交实验的结果进行
显著性分析 ,选出最优培养基组成。试验培养基:葡萄
糖 ,酵母膏 ,生长因子 VB1 , 马铃薯 20%, KH2PO4 0.
15%,MgSO4 0.05%,pH 6.0 ,试验结果见表 3。极差分
析表明各因素对黄绿蜜环菌菌丝生物量以及 EPS含量
的影响程度均为B>A>C 。由于各因素对菌丝生物量的
影响均不显著 ,因此以EPS含量为主要指标 ,确定最佳的培
养基成分为:马铃薯20 g/100mL ,葡萄糖4 g/100mL ,酵母膏
0.20 g/100mL ,VB1 12 μg/mL , KH2PO4 0.15 g/100mL ,
MgSO4 0.05 g/100mL ,pH 6.0。
　　表 3　　　精制培养基成分优化正交实验
试验号 1 2 3 4
A B A×B C
生物量
/g·(100mL)-1EPS含量/ g·L-1
1 1 1 1 1 0.58 1.773
2 1 2 2 2 0.548 1.583
3 1 3 3 3 0.525 1.526
4 2 1 2 3 0.855 3.076
5 2 2 3 1 0.677 2.312
6 2 3 1 2 0.526 1.427
7 3 1 3 2 0.818 2.909
8 3 2 1 3 0.330 0.911
9 3 3 2 1 0.676 2.213
均值1 0.551 0.751 0.479 0.644
均值2 0.686 0.518 0.693 0.631
均值3 0.608 0.576 0.673 0.57
极差 0.135 0.233 0.214 0.074
显著性
均值1 1.627 2.586 1.370 2.099
均值2 2.272 1.602 2.291 1.973
均值3 2.011 1.722 2.249 2.234
极差 0.645 0.984 0.921 0.261
显著性 ＊ ＊
　　注:＊表示差异显著 , ＊＊表示差异极显著 ,下同。
2.2.4　粗培养基成分优化正交实验结果　试验培养基:
白糖 ,麸皮汁 ,生长因子 VB1 , 马铃薯 20 g/100mL ,
KH2PO 4 0.15 g/100mL ,MgSO 4 0.05 g/100mL ,pH 6.0 ,
结果见表4。极差分析表明各因素对黄绿蜜环菌菌丝生
物量以及 EPS 含量的影响程度均为 A>B>C ,各因素
对菌丝生物量以及 EPS含量影响均极显著。确定最佳
的培养基成分为:马铃薯 20 g/100mL ,白糖4 g/100mL ,
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麸皮汁3 g/100mL ,VB1 8μg/mL ,KH2PO4 0.15 g/100mL ,
MgSO4 0.05 g/100mL ,pH 6.0。
　　表 4　　　粗培养基成分优化正交实验
试验号 1 2 3 4
A B A×B C
生物量
/ g·(100mL)-1EPS含量/g·L-1
1 1 1 1 1 0.27 0.159
2 1 2 2 2 0.285 0.227
3 1 3 3 3 0.651 0.747
4 2 1 2 3 0.716 1.169
5 2 2 3 1 0.822 2.084
6 2 3 1 2 0.809 1.967
7 3 1 3 2 0.805 1.898
8 3 2 1 3 0.794 1.727
9 3 3 2 1 0.784 1.678
均值 1 0.402 0.597 0.624 0.625
均值 2 0.782 0.634 0.595 0.633
均值 3 0.794 0.748 0.759 0.720
极差 0.392 0.151 0.164 0.095
显著性 ＊＊
均值 1 0.378 1.075 1.284 1.307
均值 2 1.740 1.346 1.025 1.364
均值 3 1.768 1.464 1.576 1.214
极差 1.390 0.389 0.551 0.150
显著性 ＊＊
3　结论
该试验表明 ,精制培养基和粗培养基对菌丝生物量
的影响差异不显著 ,而对 EPS含量的影响差异显著 ,因
此以 EPS含量为主要指标 ,得出在精制培养基中胞外多
糖产量高于粗培养基中。这是因为粗培养基的成分不
确定 ,其中的碳源和氮源多数是迟效碳源和氮源 ,不易
于被利用 ,影响多糖的产量。通过碳源 、氮源等单因子
筛选和正交实验 ,确定黄绿蜜环菌液体培养最佳精制碳
源 、氮源分别是葡萄糖和酵母膏 ,最佳粗碳源 、氮源分别
是白糖和麸皮汁。精制培养基最佳组成是马铃薯
20 g/100mL ,葡萄糖4 g/100mL ,酵母膏 0.20 g/100mL ,
VB1 12 μg/mL , KH2PO4 0.15 g/100mL , MgSO4 0.05
g/100mL ,pH 6.0。粗培养基最佳组成是马铃薯
20 g/100mL ,白糖 4 g/100mL ,麸皮汁3 g/100mL ,VB1 8
μg/mL ,KH2PO 4 0.15 g/100mL , MgSO4 0.05 g/100mL ,
pH 6.0。通过显著性分析表明 ,液体发酵 EPS含量在精
制培养基中较高。黄绿蜜环菌产胞外多糖工艺条件的
优化 ,为黄绿蜜环菌胞外多糖的深入研究和开发利用提
供参考 ,对推动青藏高原食用菌产业向深加工方向发
展 ,具有深远的科学意义和广泛应用前景。
参考文献
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Study on Fermentation Production of Exo-polysaccharides by Armillaria luteo-virens
WANG Hong1 , YOU Xiao-qian2 , YU Mei3
(1.College of Chemical Engineering , Qinghai University , Xining , Qinghai 810016;2.Nanjing Agricultural University , Nanjing , Jiang su 210095;
3.Qinghai Plateau Pharmaceutial Limited Company , Xining , Qinghai 810007)
Abstract:Using orthogonal experiment to analysis the effects betw een depurate medium and crude medium on
fermentation production of exo-polysaccharide f rom Armillaria luteo-virens , while the optimum medium and reaction
conditions we obtained.Otherwise , the different submerged-culture conditions were studied.The results showed that the
depurate medium composition was as follows ,potato 20 g/100mL , glucose 4 g/100 mL , yeast ex-tract 0.20 g/100 mL ,
VB112μg/mL ,KH2PO4 0.15 g/100 mL ,MgSO4 0.05 g/100 mL ,pH 6.0.
Keywords:Armillaria luteo-virens;exo-poly saccharide;medium composition.
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