全 文 :Mycosystema
菌 物 学 报 15 January 2011, 30(1): 85-91
jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2011 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.
基金项目:国家科技基础条件平台建设子项目:“自然保护区生物标本整理、整合及共享试点(No. 2005DKA21404, 2006-2008)”课题“自然保护区
民族医药植物标本整理”;西南交通大学生物学潜力学科发展工程建设项目;中央高校基本科研业务费专项资金(No. SWJTU09ZT28);西南交通大
学生物信息与功能基因组团队建设项目
△并列第一作者
*Corresponding author. E-mail: maocq@swjtu.edu.cn
收稿日期: 2010-05-05, 接受日期: 2010-11-25
鲜猴头菌口服液益智保健功效初步研究
王利丽 1△ 郭红光 1△ 王青龙 1 谭睿 1 付庆伟 1 刘娜 1 洪淑华 1
沈明珠 2 余杰 2 李迪强 3 茆灿泉 1*
1西南交通大学生命科学与工程学院 成都 610031
2北京玛西蒙科技有限公司 北京 100090
3中国林业科学院森环森保所 北京 100091
摘 要:初步评估了鲜猴头菌口服液的益智保健功效以及对糖尿病及其相关症状的改善作用。在研究中,首先采用急性毒性
实验检测鲜猴头菌口服液饮用的安全性;然后,采取小鼠跳台和避暗实验以及迟发型变态反应初步分析了鲜猴头菌口服液对
正常小鼠的学习和记忆能力以及对由 Cy 诱导的免疫抑制小鼠的细胞免疫应答能力的影响;同时,又以 STZ 诱导的糖尿病大
鼠作为模型,测定了鲜猴头菌口服液对糖尿病典型症状的改善作用。结果显示,鲜猴头菌口服液的 LD50>27.2mL/kg;在跳
台和避暗 2 个实验中,与空白对照组相比较,猴头低、中、高 3 个剂量组小鼠的潜伏期明显缩短,且 5min 错误次数明显减
少;在迟发型变态反应中,与阴性对照组相比较,猴头组小鼠的左后足趾肿胀度极显著增强;此外,鲜猴头菌口服液还对由
STZ 诱导的糖尿病大鼠的精神状态和体重均有改善作用,而与正常组相比较,口服液对糖尿病大鼠的血常规指标影响不明显。
这表明,鲜猴头菌口服液为安全物质,它能显著的提高小鼠的记忆和学习能力,能极显著的提高免疫抑制小鼠的细胞免疫应
答水平,还能对由糖尿病引起的体重下降有改善作用,同时不会引起副作用。
关键词:猴头菌,益智,免疫,糖尿病,口服液
A preliminary study of fresh Hericium erinaceus oral liquid on
health-care function and promotion of learning and memory
WANG Li-Li1△ GUO Hong-Guang1△ WANG Qing-Long1 TAN Rui1 FU Qing-Wei1 LIU Na1
HONG Shu-Hua1 SHEN Ming-Zhu2 YU Jie2 LI Di-Qiang3 MAO Can-Quan1*
1School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China
DOI:10.13346/j.mycosystema.2011.01.021
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http://journals.im.ac.cn/jwxtcn
2Beijing Mushroom Science & Technology Co.,Ltd, Beijing 100090, China
3Institute of Forest Ecology, Environment and Protection, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China
Abstract: The study was designed to investigate the toxicity of fresh Hericium erinaceus oral liquid and its treatment effects on
learning and memory, DTH reaction in a mouse model of immunosuppression, and STZ-induced diabetes in a rat model. The results
showed that the LD50 of fresh Hericium erinaceus oral liquid is higher than the dose of 27.2mL/kg. In the stay-down and
stay-through assays, the time of latency and the number of errors made in the 5 minutes in the oral liquid-treated group was
apparently less than those of the other groups. In the delayed type hypersensitivity (DTH) reaction, the swell of left back toes in the
oral liquid-treated immunosuppressed mice was significantly bigger than that in the non-treatment immunosuppressed mice. In
addition, the body weight of STZ-induced diabetic rats in the oral liquid-treated group was significantly improved in comparison
with that before taking the oral liquid, and the haematological traits of diabetic rats in the oral liquid-treated group were not obvious
as compared with those in the normal control group. The conclusion is that fresh Hericium erinaceus oral liquid is no toxicity, and it
can significantly improve the ability of learning and memory, and strengthen the responses of the cellular immunity in mice. Besides,
it can protect rats against STZ-induced diabetes.
Key words: Hericium erinaceus, learning and memory, immunity, diabetes, oral liquid
猴头菌 Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.属于
非褶菌目,猴头菇科,猴头菇属,是我国著名的药
食兼用真菌。现代研究表明,猴头菌的子实体和发
酵菌丝中均含有多糖、脂肪酸、甾醇、猴头菌素和
猴头菌酮等多种活性物质。其中,猴头菌酮
(hericenones)和猴头菌素(erinacines)是两种低
分子量的生物活性物质,它们可以自由地通过血-
脑屏障(Blood-brain barrier, BBB),同时在大脑中
促使神经生长因子(NGF)的合成(Hirokazu et al.
2002),猴头菌醇提物(不含有猴头菌酮)能促进
1321 N1 人星形细胞瘤中 NGF mRNA 的高表达和
NGF 的分泌,而后者可促进 PC12 细胞突起的生长
(Koichiro et al. 2008),这提示猴头菌可以作为预
防及治疗阿尔茨海默氏痴呆症(Alzheimer’s disease)
等神经退行性疾病的饮食补充物或药品;猴头菌水
提物能激活巨噬细胞,并诱导巨噬细胞分泌 NO 和
细胞因子 IL-1β及 TNF-α(Chang et al. 2006;Jong et
al. 2009),这提示猴头菌能够通过增强免疫细胞的
活性来调节机体的免疫功能。此外,猴头菌甲醇提
取物还可明显降低由 STZ 诱导的糖尿病大鼠的血糖
浓度以及血清中的甘油三酯及胆固醇,能明显改善
因糖尿病引起的多饮症(Jinn et al. 2005)。
本文是在猴头菌菌株的筛选、优化、栽培、液
体发酵以及基因指纹分析等前期工作的基础上,初
步分析了猴头菌的益智和增强细胞免疫应答水平
功效及对糖尿病相关症状的改善作用。
1 材料与方法
1.1 试剂
鲜猴头菌口服液:北京玛西蒙科技有限公司生
产;脑复康片(吡拉西坦片):湖北华中药业有限
公司生产,实验前用去离子水溶解并配制成 1.5%
(W/V)溶液;环磷酰胺(cyclophosphamide,Cy):
江 苏 恒 瑞 医 药 公 司 生 产 ; 链 脲 佐 菌 素
(streptozotocin,STZ):美国 Sigma 公司生产,实
验前将 STZ 溶解于 pH4.5,0.1mol/L 的柠檬酸钠-
柠檬酸缓冲液中,配制成 1%(W/V)溶液;戊巴比
妥钠:Sigma 公司生产,实验前将戊巴比妥钠溶解
于灭菌去离子水中,配制成 1%(W/V)溶液;格列
齐特片(II),法国施维雅药厂和天津华津制药厂合
作生产,实验前将格列齐特片研磨后,溶解于灭菌
去离子水中,配制成 0.16%(W/V)溶液。
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菌物学报
1.2 仪器
游标卡尺(精密度 0.02mm)、小鼠跳台仪、小
鼠避暗箱、德国拜安捷 2 代血糖仪。
1.3 实验动物
普通级昆明种近交系小鼠,体重 20.0g±2.0g,
由成都中医药大学实验动物中心提供,合格证号为
普 001-01;普通级雄性 SD 大鼠,体重 180-230g,
由成都达硕生物科技有限公司提供,生产许可证号
为 SCXK(川)2008-24。实验动物自由饮水及摄食。
所有实验动物适应性喂养 1 周,确定其活动、
进食及粪便等情况均无异常,然后进行实验。
1.4 急性毒性实验
昆明种小鼠 16 只,雌雄各半,随机分为 4 组,
阴性对照组给予生理盐水 20mL/kg;3 个猴头组分
别按 6.8mL/kg、13.6mL/kg、27.2mL/kg 给予鲜猴头
菌口服液。各组实验动物分笼喂养,每天灌胃给药
3 次,每次间隔 8h,连续 8d 内观察和记录小鼠的
中毒症状、死亡情况(包含死亡时间和死亡个数),
并根据小鼠的死亡数确定鲜猴头菌口服液的 LD50
数值,依据 LD50 数值确定口服液的毒性大小。
1.5 改善记忆作用研究
1.5.1 实验动物分组和给药方式:昆明种小鼠 96 只,
雌雄各半,随机分为 10 组,其中 5 组用于跳台实
验,另 5 组用于避暗实验。空白对照组给予生理盐
水 20mL/kg;阳性对照组给予 1.5%脑复康溶液
20mL/kg;猴头组分别按 4mL/kg、8.5mL/kg 和
12.5mL/kg 给予鲜猴头菌口服液。每天分 3 次灌胃,
连续 8d。各组实验动物分笼喂养。实验前排除对
40V 直流电不敏感或超常敏感的小鼠。
1.5.2 跳台实验:实验第 8 天,给药 1h 后进行跳台
实验,跳台实验分为训练和测验两阶段。训练时先
将小鼠放入反应箱内适应 3min,然后通以 40V 直
流电,小鼠受到电击后跳回平台以躲避电击为正确
反应,而再次跳到铜栅上受到电击为错误反应。首
先,将小鼠平稳放置在跳台上,开始计时,记录小
鼠第 1 次从平台跳到铜栅上所需要的时间,此即潜
伏期。记录小鼠训练期间 5min 内错误反应次数,并
以此作为学习能力指标;24h 后重新测定,记录潜伏
期和 5min 内错误次数,并以此作为记忆能力指标。
1.5.3 避暗实验:实验第 8 天,给药 1h 后进行避暗
实验,避暗实验分训练和测验两个阶段。实验期间,
暗室底部通以 40V 交流电。训练时将小鼠放入明
室,但它们会很快钻入暗室;小鼠进入暗室后受到
电击,迫使其又逃回明室,并以此获得记忆。实验
时将小鼠面部背向洞口放入明室,同时启动计时
器;小鼠穿过洞口进入暗室受到电击即停止记时,
取出小鼠。记录每只小鼠从放入明室到进入暗室遭
遇电击所需的时间,此即潜伏期。记录小鼠训练期
间 5min 内错误反应次数,并以此作为学习能力指
标;24h 后重新测定,记录潜伏期和 5min 内错误次
数,并以此作为记忆能力指标。
1.6 DTH 迟发型变态反应
昆明种小鼠 24 只,雌雄各半,随机分为 6 组,
按正常对照组,阴性对照组(Cy 诱导模型)和猴头
组:猴头组又按 2.5mL/kg,7.5mL/kg 和 12.5mL/kg
分低、中、高 3 组给予鲜猴头菌口服液,正常对照
组和阴性对照组给予等量生理盐水,各组灌胃体积
相同,每日分 2 次灌胃,连续 5d。分笼喂养。
实验前,向小鼠腹腔注射 2%(v/v,用生理盐
水配制)SRBC 悬液 0.20mL(约 1×108 个 SRBC)。
在 SRBC 致敏后,向阴性对照组和实验组的小鼠腹
腔注射 Cy 150mg/kg 体重,制造免疫抑制动物模型,
正常组仅腹腔注射等体积的生理盐水。
致敏后第 4 天,给药后测量小鼠的左后足跖部
厚度;然后在左后足跖部皮下注射 2% SRBC 悬液
0.02mL,右侧注入等量的生理盐水溶液。24h 后测
量左后足跖部厚度,同一部位测量 3 次,取平均值。
以 SRBC 攻击前后左足跖厚度的差值来表示 DTH
的程度。
1.7 鲜猴头菌口服液改善糖尿病的作用
雄性 SD 大鼠 36 只,随机分为 4 组,即正常组
6 只、阴性对照组 10 只、鲜猴头菌口服液组 10 只
和格列奇特组 10 只。实验前,糖尿病大鼠单次腹
腔注射 STZ 50mg/kg 体重,正常组仅腹腔注射等体
积柠檬酸钠缓冲液。在注射完STZ 6h后的未来48h,
除正常组外,向另 3 组大鼠提供 10%的葡萄糖溶液
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以防止 STZ 引起的致命性低血糖作用。1 周后,大
鼠禁食 8h,采尾血,血糖仪测定其空腹血糖,空腹
血糖>10mmol/L 确定为糖尿病模型并开始进入实
验。鲜猴头菌口服液按 5.20mL/kg 体重给予;格列
奇特片按 0.16%格列齐特片溶液 5.20mL/kg 体重给
予;正常组和阴性对照组(STZ 诱导模型)则分别
给予等量的生理盐水。各组实验动物分笼喂养。每
天灌胃给药 1 次,连续 4 周。实验期间,每天测量
大鼠的体重,观察其饮水和饮食情况。末次给药 24h
后,大鼠禁食 8h,1%戊巴比妥钠麻醉,心脏取血,
EDTA-K2 抗凝,送四川省人民医院四川省医学科
学院药物非临床安全评价室进行血常规指标测定。
1.8 统计学方法
数据以 x +SD 表示,采用 t 检验分析。p<0.05
为差异显著,p<0.01 为极显著差异,p>0.05 为无
统计学差异。
2 结果
2.1 急性毒性实验
鲜猴头菌口服液分别按照 3 个剂量进行灌胃,经
过 8d 的连续观察,实验结果表明,当鲜猴头菌口服
液分别在小鼠体内达到 6.8、13.6 和 27.2mL/kg 时,
各剂量组均无死亡情况,无明显中毒症状(表 1)。而
且各剂量组的小鼠精神状态良好,毛色光泽,饮食和
饮水均正常,粪便未见异常,无法测出半数致死量,
确认受试物质的半数致死剂量 LD50>27.2mL/kg,因
此认为鲜猴头菌口服液是安全物质。
表 1 鲜猴头菌口服液的急性毒性实验
Table 1 Results of acute toxicity of fresh Hericium erinaceus
动物数量
Number of mice
动物死亡数
Number of died mice组别
Groups
灌胃剂量
Dosage
(mL/kg)
雌性
Female
雄性
Male
雌性
Female
雄性
Male
阴性对照组
Negative
control
0 2 2 0 0
6.8 2 2 0 0
13.6 2 2 0 0
猴头组
H. erinaceus
27.2 2 2 0 0
2.2 跳台实验
与空白对照组相比较,猴头低剂量和高剂量
组及阳性对照组小鼠的潜伏期均有显著延长(p<
0.05),猴头中剂量组小鼠的潜伏期有了极显著延长
(p<0.01)(图 1-A);训练学习期各组小鼠的 5min
错误次数无显著差异(p>0.05),而记忆测试期猴
头低剂量和中剂量组小鼠的 5min 错误次数显著减
少(p<0.05),猴头高剂量组和阳性对照组小鼠的
5min 错误次数极显著减少(p<0.01)(图 1-B)。
图 1 鲜猴头菌口服液对小鼠学习记忆的跳台实验测定
*:p<0.05;**:p<0.01;∆:p>0.05.
Fig. 1 Effects of fresh Hericium erinaceus oral liquid on learning and
memory of mouse in step-down assay. *: p<05; **: p<01; ∆: p>05.
2.3 避暗实验
与空白对照组相比较,猴头低剂量和中剂量组
小鼠的潜伏期有显著延长(p<0.05),高剂量组和
阳性对照组小鼠的潜伏期有极显著延长(p<0.01)
(图 2-A);训练学习期猴头中剂量组和阳性对照
组小鼠的 5min 错误次数显著减少(p<0.05),猴
头高剂量组小鼠的 5min 错误次数极显著差异(p<
0.01),而猴头低剂量组小鼠的 5min 错误次数则无
显著差异(p>0.05);而记忆测试期猴头组和阳性
对照组小鼠的 5min 错误次数均极显著减少(p<
0.01)(图 2-B)。
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图 2 鲜猴头菌口服液对小鼠学习记忆的避暗实验测定
*:p<0.05;**:p<0.01;∆:p>0.05.
Fig. 2 Effects of fresh Hericium erinaceus oral liquid on learning
and memory of mouse in step-through assay. *: p<0.05; **: p<0.01;
∆: p>0.05.
2.4 DTH 迟发型变态反应
注射 Cy 后,与正常组相比较,阴性对照组小
鼠的左后足趾肿胀度有显著性下降(p<0.01),提
示免疫抑制小鼠模型制造成功。给予鲜猴头菌口服
液 5d 后,与阴性对照组相比较,猴头低、中和高 3
个剂量组小鼠的左后足趾肿胀度均有极显著提高
(p<0.01);而与正常组相比较,猴头低剂量组小
鼠的左后足趾肿胀度的变化没有显著性差异(p>
0.05),猴头中、高剂量组小鼠的左后足趾肿胀度有
极显著提高(p<0.01)(图 3)。
2.5 鲜猴头菌口服液改善糖尿病的作用
与正常组相比较,大鼠注射 STZ 的 24h 后出现
了精神不振、多饮、多食、多尿、脱毛和消瘦等典
型的糖尿病症状;在 STZ 注射 1 周后,大鼠的空腹
血糖值显著地高于正常组(数据未列出),这提示
糖尿病大鼠模型制造成功。给药 4 周后,与阴性对
照组相比较,猴头组大鼠的活动增多,精神状态较
给药前有较大的改善。
图 3 鲜猴头菌口服液对小鼠的 DTH 测定 与阴性对照组相比
较,** p<0.01;与正常组相比较,∆ p<0.01.
Fig. 3 Effects of fresh Hericium erinaceus oral liquid on the delayed type
hypersensitivity in mouse. Compared with the negative control group, ** p<
0.01; compared with the normal control group, ∆ p<0.01.
糖尿病最显著的特征就是多尿、多饮、多食和
体重骤降,因此体重指标可以间接地反映糖尿病治
愈的程度(张志才等 2008)。实验前,除正常组外,
其余 3 组大鼠的体重间均无显著性差异(p>0.05);
给药 4 周后,与给药前各组体重相比较,发现正常组
和猴头组的大鼠体重有了极显著增加(p<0.01),格
列奇特组的大鼠体重有了显著增加(p<0.05),而阴
性对照组体重的变化无显著性差异(p>0.05)(图 4)。
图 4 STZ 糖尿病建模后及给药 4 周后大鼠体重的变化 与 0
周的正常组相比较,∆ p <0.05,∆∆ p<0.01;与 0 周的猴头组相比较,
** p<0.01;与 0 周的格列奇特组比较,o p<0.05.
Fig. 4 Body weight changes of STZ-induced diabetes mellitus and
intragastric administration of drug after 4 weeks in rats. Compared with
the normal group in 0 week, ∆ p<0.05, ∆∆ p<0.01; compared with the
Hericium erinaceus group in 0 week, ** p<0.01; compared with the
Gliclazide group in 0 week, o p<0.05.
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给药 4 周后,与正常组相比较,阴性对照组
大鼠的红细胞和血红蛋白含量无显著性差异(p>
0.05);白细胞数量显著降低(p<0.05),血小板数
量极显著增加(p<0.01);与阴性对照组相比较,
猴头组红细胞等各项指标无显著性差异(p>0.05),
格列奇特组红细胞数量显著减少(p<0.05),血红
蛋白含量极显著降低(p<0.01),白细胞、血小板
的数量无显著性差异(p>0.05)(表 2)。
表 2 鲜猴头菌口服液对糖尿病大鼠血常规的影响( x ±SD)
Table 2 Effects of Hericium erinaceus oral liquid on the haematological
traits of diabetic rats ( x ± SD)
组别
Groups
红细胞
RBC
(1012/L)
白细胞
Leucocyte
(109/L)
血小板
Platelet
(109/L)
血红蛋白
Hemoglobin
(g/L)
正常组
Normal
control
7.40±0.18 17.63±3.61 462.67±36.00 136.50±12.26
阴性对照组
Negative
control
7.75±0.31 10.95±1.17△ 235.25±69.48△△ 148.00±4.97
猴头组
H. erinaceus
7.74±0.76 11.23±3.48 327.89±123.17 141.75±12.62
格列奇特组
Gliclazide
6.50±0.93* 12.40±2.25 224.00±42.79 114.25±17.80**
注:与正常组相比较,△ p<0.05,△△ p<0.01;与阴性对照组相比较,
* p<0.05,** p<0.01.
Note: Compared with the normal control group, △ p<0.05, △△ p<0.01;
compared with the negative control group, * p<0.05, ** p<0.01.
3 讨论
记忆是大脑皮层的高级功能之一,它是学习
之后对行为及经验的保持和再现过程(Clifford et
al. 2006)。一般把记忆分为 3 个阶段,包括获得、
巩固和再现。本研究采用跳台和避暗实验初步考察
了鲜猴头菌口服液对小鼠记忆获得过程的影响。实
验结果说明,给予鲜猴头菌口服液后,小鼠潜伏期
显著延长,学习和记忆获得能力显著提高,相关结
果与阳性对照药物——脑复康的效果相近,这与已
有的研究结果基本一致(Kawagishi & Zhuang
2008;Mai et al. 2010)。其中一种可能的解释是
猴头菌多糖等功效成分增加了脑和肝脏中的超氧
化物歧化酶(SOD)含量,而 SOD 可清除有害自
由基,保护细胞免受损伤,延缓细胞衰老,也可能
是因为猴头具有促进 NGF 的合成,而 NGF 是外周
和中枢神经生长及功能维持不可缺少的蛋白质,它
对中枢和外周神经的生长、发育和正常状态的维持
及损伤后的保护有着重要作用(Hirokazu et al.
2002)等原因,从而利于智力衰退的预防和治疗。
环磷酰胺 Cy 是一种较理想的免疫抑制剂(Fen
et al. 2007;Michal et al. 2009)。本研究向小鼠单次
腹腔注射 150mg/kg 体重的环磷酰胺,实验结果显示
小鼠的脾脏和胸腺的脏器指数(即脏器的湿重与体
重的比值)、巨噬细胞的吞噬作用(具体数据未列
出)和 DTH 迟发型变态反应均受到了显著的抑制。
在给予鲜猴头菌口服液后,免疫抑制小鼠的脏器指
数上升,DTH 反应和巨噬细胞的吞噬作用显著增强。
据文献报道,猴头菌具有良好的免疫调节功效,是
因为其所含的猴头菌多糖是由 β-型葡萄糖组成的 β-
(1→3)葡聚糖(李师鹏和安利国 2001),它能刺
激 T 细胞分泌 IFN-γ,TNF-α,IL-2 和 IL-6 等细胞因
子,诱导机体免疫反应的发生(Ka et al. 2010);此
外,它还是一种免疫激活剂,能激活 NK 细胞、B 细
胞和巨噬细胞,提高巨噬细胞的吞噬作用(Sung et al.
2009;Jong et al. 2009),从而提高机体的免疫活性。
链脲佐菌素 STZ 是一种广谱抗生素,具有抗
菌、抗肿瘤的特性,但却有致糖尿病的副作用。其
是通过对胰岛细胞的毒性作用而用于实验动物糖
尿病的诱导(Alejandro & Martha 2002)。本研究
选用 SD 雄性大鼠单次腹腔注射 STZ 50mg/kg 体重
制造糖尿病模型。结果说明,糖尿病大鼠模型稳定
可用,且在给予鲜猴头菌口服液后,糖尿病大鼠的
体重显著增加,同时血糖浓度、24h 尿液量、饮水
量和饮食量均呈现出下降的趋势(具体数据未列
出);通过血常规指标的测定,发现阳性对照药物
格列奇特片在降低机体内血糖的同时也降低了血
液中红细胞和血小板的数量以及血红蛋白的含量,
长期服用此药可能会为糖尿病患者带来贫血症等
Vol.30 No.1 91
菌物学报
多种副反应,反观鲜猴头菌口服液在对糖尿病的治
疗过程中未对血常规指标产生任何副作用。目前,
虽然未能彻底地阐明猴头菌的有关降糖机理,但研
究者们认为是猴头菌中的多糖成分能够修复由STZ
损伤的胰岛 β 细胞,刺激胰岛 β 细胞分泌胰岛素,
从而改善了机体内的高血糖现象(Li et al. 2006;
Hye et al. 2005),对糖尿病起到治疗的功效。
综上所述,鲜猴头菌口服液属于无毒物质,它
具有益智保健功效,同时对糖尿病引起的多种典型
症状有治疗和改善的功效,且不会对机体产生副作
用,这为将其开发成为保健食品资源提供了初步的
科学依据。
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