全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2015)05 － 2209 － 04 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2015． 05． 068
收稿日期:2014 － 11 － 15
基金项目:国家食用菌产业技术体系金针菇毛木耳育种与菌种
繁育岗位、毛木耳和药用菌栽培岗位、成都综合试验站;四川食
用菌创新团队;四川省财政基因工程项目(2012LWJJ-003)
作者简介:贾定洪(1977 －) ，男，四川梓潼人，助理研究员，主要
从事食用菌分子生物学和遗传育种研究，* 为通讯作者。
毛木耳子实体发育相关 cDNA差异显示分析
贾定洪1，2，彭卫红1，郑林用1，2，甘炳成1，黄忠乾1，王 波1*
(1．四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066;2．四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川 成都 610064)
摘 要:以毛木耳菌丝、耳基和耳片为供试材料，采用 3’-cDNA限制性片段展示方法，获得 3 个阶段 cDNA表达谱，对大于 100 bp
的 18 个 cDNA片段使用 blastx程序与非冗余蛋白数据库(non-redundant protein sequence)进行同源性比对。结果表明，有 6 个序列
能够分别与 NCBI数据库中的新孢子虫假定蛋白、水霉菌 Aphanomyces invadans蛋白 TAＲ1、微绿球藻核糖体 ＲNA反义转录序列、双
孢蘑菇、糙皮侧耳、皱木耳假定蛋白匹配蛋白质相匹配，并且 E 值≤5 × 10 －8，表明序列匹配良好，实验方法可行，能够作为毛木耳
等食用菌功能基因研究手段之一。
关键词:毛木耳;子实体;cDNA
中图分类号:S646． 6 文献标识码:A
Analysis of Gene Expression by Display of Differential
Developmental cDNAs from Auricularia nigricans
JIA Ding-hong1，2，PENG Wei-hong1，ZHENG Lin-yong1，2，GAN Bing-cheng1，HUANG Zhong-qian1，WANG Bo1*
(1． Soil and Fertilizer Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610066，China;2． Key Laboratory of Bio-re-
source and Bio-environment，College of Life Sciences，Sichuan University，Sichuan Chengdu 610064，China)
Abstract:Hypha，primordium and fruiting body of Auricularia nigricans were used to study their gene expression by display of differential de-
velopmental 3’end-cDNAs． And 18 cDNA fragments(≥100 bp)were translated and used to align non-redundant protein sequences in NCBI
with blastx． Ｒesults showed that six sequences were significantly aligned to the proteins of Nannochloropsis gaditana transcript antisense to ri-
bosomal rna protein，Agaricus bisporus hypothetical protein AGABI1DＲAFT_49393，Pleurotus ostreatus hypothetical protein PLEOSDＲAFT_
23300，Auricularia delicata hypothetical protein AUＲDEDＲAFT_115833，Aphanomyces invadans protein TAＲ1，Neospora caninum hypo-
thetical protein NCLIV_068840，and all E values ≤5 × 10 －8 ． This indicated that the experimental method was feasible and could be used
as a tool for the function gene study of mushroom such as Auricularia nigricans．
Key words:Auricularia nigricans;Fruiting body;cDNA
毛木耳(Auricularia nigricans)耳片厚质地较柔
软，营养丰富，性平味甘，有滋润强生、清肺益气、补
血活血、镇痛止痛等功效，是我国大宗食用菌品种之
一［1］。我国栽培毛木耳根据产品质量分为黄背木
耳和白背木耳，黄背木耳主要分布在四川河南山东
安徽和江苏等地，白背木耳分布在福建［2］。
目前毛木耳研究已在种质资源鉴定［3 ～ 5］、药理
药效［6 ～ 8］、育种［9 ～ 11］、栽培［12 ～ 15］、加工［16 ～ 18］和病虫
害防治［19 － 21］等方面取得了长足发展，但在毛木耳子
实体发育相关基因研究方面却少有报道。而在系统
发育过程中，高等生物在不同的组织细胞中仅有 10
% ～20 %的少部分基因被选择性表达，这种选择性
表达是在发育过程中细胞分化的结果，它将最终控
制生物的形状和生理过程［22］，在毛木耳栽培上就表
征体现在耳片大小、产量、色泽、口感等方面。因此，
比较物种在不同发育阶段的基因差异表达，将是研
究基因在不同时期发挥生理功能的重要手段，是毛
木耳功能基因研究的重要基础。
实验拟通过 3’-cDNA限制性片段展示方法，获
得毛木耳在菌丝、耳基和耳片等 3 个阶段 cDNA 差
异表达谱，并通过克隆和 Blast 分析，对其功能进行
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2015 年 28 卷 5 期
Vol. 28 No. 5
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
初步分析和注释，为毛木耳子实体发育相关基因研
究提供依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 供试材料 实验菌株从漳州市农科所的毛
木耳菌株 43028 的组织分离获得，其黄色野生型菌
株编号为 WA1，白色突变菌株编号为 WA2，现保藏
于四川省农业科学院土壤肥料研究所。为了分析毛
木耳子实体发育相关基因，取黄色野生型菌株的袋
栽菌丝(YH)、耳基(YP)、耳片(YF)以及白色突变
菌株的袋栽菌丝(WH)、耳基(WP)、耳片(WF)作为
供试材料(图 1)。
1． 1． 2 试剂 本试验 ＲNA 提取试剂盒为 simply P
total ＲNA extaction kit，购自 Bioflux;ds cDNA合成采
用 PrimeScriptTM Double Strand cDNA Synthesis Kit，
购自宝生物工程 (大连)有限公司;Taq DNA 聚合
酶、TaqⅠ内切酶、T4 连接酶、dNTP 购自 MBI Fer-
mentas 公司;上、下游引物由生工生物工程(上海)
有限公司合成;pEASY-T1 载体购自全式金生物技
术有限公司。
1． 2 方法
1． 2． 1 cDNA 合成 毛木耳菌丝、耳基、耳片等材
料的 ＲNA提取及 ds cDNA 合成按照试剂盒说明书
进行。1st cDNA 合成使用 Oligo (dT)18V:5’-AT-
TCAAGCAAAGACGGTTGTTAGAAGGAAAGAAAG
(T)18 V-3’引物进行 ＲT-PCＲ。
1． 2． 2 TaqⅠ酶切及接头连接 将合成的 ds cDNA
用 TaqⅠ内切酶按照说明书方法进行酶切，酶切产物
图 1 毛木耳黄色野生型及白色突变菌株耳基、耳片
Fig． 1 Primordium and fruiting body of yellow Auricularia nigricans
wild-type strain WA1 and its white mutant WA2
在加入 TaqⅠ接头进行连接，接头序列为 TaqⅠa-
dapter:5’- TTATG ACG GGT GTT ACA GGT GGA
GG-3’和 Adapter Cp:5’P-CG CCT CCA CCT GTA
ACA CCC TGA-3’，连接体系如下:总体积为 50 μl，
DNA酶切混合液 20 μl，5 μmol /L TaqⅠ接头 2． 0
μl，T4 DNA连接酶 2 U /μl 1 μl，10 × buffer 5． 0 μl，
ddH2O2 2 μl，22 ℃连接 3 h。
取连接产物 10 μl，按 1 ∶ 5 比例用 TE buffer 稀
释后用于扩增反应，其余的连接产物于 － 20 ℃保存
备用。
1． 2． 3 PCＲ扩增及特征片段克隆 取连接产物进
行预扩增和选择性扩增，预扩增引物为 cDNAF:5’-
ACGGGTGTTACAGGTGGAGG-3’和 cDNAＲ2:5’-
GACGGTTGTTAGAAGGAAAGAAAGT-3’，选择性扩
增引物为 cDNA 5’端的 A:5-CGGTTGTTAGAAG-
GAAAGAAAGT-3及 3’端的 TaqⅠ接头序列设计选
择性扩增引物 Sga:5-TGTTACAGGTGGAGGCGA-
GA-3，Sgg:5-TGTTACAGGTGGAGGCGAGG-3，Sgt:
5-TGTTACAGGTGGAGGCGAGT-3的组合。PCＲ 产
物用 4． 5 %聚丙烯酰胺凝胶电泳，切取特征条带加
入 30 μl 1 × TE(pH 8． 0)，沸水浴 20 min，离心后取
上清液 PCＲ扩增，琼脂糖电泳切胶纯化后 TA克隆，
将克隆菌液送交上海立菲生物技术有限公司(广
州)测序。
1． 2． 4 序列分析 获得的原始 DNA 序列用
DNAStar 分析软件进行拼接并翻译成氨基酸序列，
将氨基酸序列提交至 NCBI 数据库进行 BLAST 同
源性搜索，根据序列同源性大小推测该 cDNA 片段
所代表的基因功能［23］。
2 结果与分析
2． 1 ＲNA 提取及 ds cDNA 合成
ＲNA提取采用 Bioflux 公司 simply P total ＲNA
extaction kit试剂盒，1 %琼脂糖凝胶电泳检测，发现
rＲNA条带完整清晰(图 2)，表明 ＲNA 提取质量较
高。ds cDNA 合成采用 PrimeScriptTM Double Strand
cDNA Synthesis Kit说明书进行，合成产物柱纯化后
备用。
2． 2 PCＲ扩增
合成的双链 cDNA 用 TaqⅠ内切酶酶切，酶切
片段用接头连接后进行预扩增，同时摸索扩增条件，
结果发现，当退火温度控制在 62 ℃时，预扩增效果
最佳，此时能得到较高亮度的弥散带，扩增片段长度
大多分布在 50 ～ 750 bp。选择性扩增采用 cDNA 5’
端的 A和 3’端 Sga、Sgg和 Sgt组合。选择性引物组
合进行 PCＲ 扩增，通过对黄色野生型及白色突变菌
0122 西 南 农 业 学 报 28 卷
5000 bp
2000 bp
3000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M:DL2000 plus;wh:白色菌丝;wp:白色耳基;wf:白色耳片;yh:
黄色菌丝;yp:黄色耳基;yf:黄色耳片
M:DL2000 plus;wh:white hypha;wp:white primordium;wf:white
fruiting body;yh:yellow hypha;yp:yellow primordium;yf:yellow
fruiting body
图 2 黄色野生型及白色突变菌株菌丝、耳基、耳片 ＲNA
电泳图
Fig． 2 Agarose gel electrophoresis of total ＲNA extracted from hy-
pha，primordium and fruiting body of yellow Auricularia nig-
ricans wild-type strain WA1 and its white mutant WA2
株菌丝、耳基、耳片样品进行选择性扩增，片段大小
120 ～ 2200 bp，白色突变菌株与黄色野生型菌株以
及菌丝、耳基、耳片样品间表达谱都存在明显差异
(图 3)。
2． 3 差异片段克隆、测序及功能分析
对表达量较高及特异表达的转录衍生片段
(Transcript-derived fragment，TDF)进行回收、克隆和
测序，最终获得 94 条差异表达 cDNA，其中克隆序
列大于 50 bp 的序列有 33 个，大于 100 bp 的有 18
个。对大于 100 bp的这些序列使用 blastx程序与非
冗余蛋白数据库(non-redundant protein sequence)进
行同源性比对。结果发现有 6 个序列能够与 NCBI
数据库中的蛋白质相匹配，并且 E 值都等于或小于
5 × 10 －8，表明序列与蛋白质数据匹配良好、可信。
其中，仅在白色突变菌株原基阶段表达的有 38-1、
411-3 转录片段，分别与新孢子虫假定蛋白和水霉
菌 Aphanomyces invadans蛋白 TAＲ1 匹配;在白色突
变菌株原基、耳片阶段表达的 cDNA片段(511-1)
M wh wh wh wp wp wp wf wf wf yh yh yh yp yp yp yf yf yf
M:100 bp Plus DNA Ladder;wh:白色菌丝;wp:白色耳基;wf:白
色耳片;yh:黄色菌丝;yp:黄色耳基;yf:黄色耳片
M:100 bp Plus DNA Ladder;wh:white hypha;wp:white primordi-
um;wf:white fruiting body;yh:yellow hypha;yp:yellow primordi-
um;yf:yellow fruiting body
图 3 A /Sga 引物对选择性扩增产物的聚丙烯酰胺电泳图
Fig． 3 PAGE gel electrophoresis of selectively amplified products by
the primer pair A /Sga
与微绿球藻核糖体 ＲNA反义序列匹配;在黄色野生
型及白色突变菌株菌都表达的 cDNA 片段 26-1、26-
2、22-2 分别与双孢蘑菇假定蛋白、糙皮侧耳假定蛋
白、皱木耳假定蛋白匹配，具体见表 1。
3 讨 论
3’-cDNA限制性片段展示方法最初由 Prashar
Y．报道出来，该方法通过对样品 3’-cDNA限制性片
段进行 PCＲ 扩增展示，可以发掘出样品间的差异
mＲNA，从而找到与样品性状相关的 cDNA，为性状
分析提供参考。Prashar Y．应用此方法分析了 T 细
胞在激活 4 h 后的基因表达情况，找到了 700 条有
价值条带，其中约有 3 % ～4 %代表 mＲNAs出现上
调，2 %的条带发生下调［24］。本实验对该方法进行
了适当改良，并对毛木耳子实体发育过程中表达量
表 1 6 个转录衍生片段与 NCBI已有蛋白质同源性比较
Table 1 Homologous comparison of translated sequences of six TDFs in NCBI
编号
Code
片段大小(bp)
Fragment
length
E值
E values
匹配蛋白
Aligned
proteins
生长阶段
Growth
stage
511-1 234 5 × 10 －18 微绿球藻核糖体 ＲNA反义转录本 白色突变菌株原基、耳片
26-1 245 4 × 10 －18 双孢蘑菇假定蛋白 AGABI1DＲAFT_49393 黄色野生型及白色突变菌株原基、耳片
26-2 113 5 × 10 －8 糙皮侧耳假定蛋白 PLEOSDＲAFT_23300 黄色野生型及白色突变菌株菌丝、原基、耳片
22-2 318 2 × 10 －38 皱木耳假定蛋白 AUＲDEDＲAFT_115833 黄色野生型及白色突变菌株原基、耳片
411-3 234 6 × 10 －14 水霉菌 Aphanomyces invadans蛋白 TAＲ1 白色突变菌株原基
38-1 481 1 × 10 －65 新孢子虫假定蛋白 NCLIV_068840 白色突变菌株原基
11225 期 贾定洪等:毛木耳子实体发育相关 cDNA差异显示分析
较高及特异表达的转录衍生片段进行回收、克隆和
测序，筛选获得了差异表达序列，这些数据将为毛木
耳生长发育基因研究提供参考。
本研究采用 3’-cDNA限制性片段展示方法，获
得了毛木耳在菌丝、耳基和耳片等 3 个阶段 cDNA
表达谱，通过克隆、测序和 Blastx 分析，获得了功能
注释数据，表明这一研究方法可行，能够作为毛木耳
等食用菌功能基因研究手段。实验中也发现了更多
的未匹配 cDNA，其功能需要进一步研究。在研究
过程中，查询基因功能数据时发现食用菌类相关数
据较少，需要更多的研究充实数据以支撑食用菌功
能基因研究发展。
本方法相对目前的 ＲNA 测序等技术，具有经
济、快速等优点，但也存在通量低、数据信息量少等
缺点，实验室可以斟酌使用。
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(责任编辑 李 洁)
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