全 文 ：第 21卷　第 3期
2002年 9月
延安大学学报 (自然科学版 )
Journal o f Yanan Univ er sity ( Natural Science Edition)
Vol. 21　 No. 3
Sept. 2002
陕北野生羊肚菌母种分离研究初报
任桂梅 , 高小朋 , 陈国梁
(延安大学 生物科学系 ,陕西 延安 716000 )
摘　要: 报道了用陕北野生羊肚菌子实体的组织和孢子分离母种的研究过程和结果。
关键词: 陕北野生羊肚菌 ;组织 ;孢子 ;分离 ;母种
中图分类号: Q939. 9　　　　文献标识码: A　　　　文章编号: 1004-602X( 2002) 03-0065-03
　　羊肚菌又名羊肚蘑、羊肚菜等 ,隶属于真菌中子
囊菌亚门 ( Ascomyco tina)盘菌目 ( Pezizales)羊肚菌
科 ( Mo rchel laceae ) ,羊肚菌属 (Morchel la ) [ 1]。它是
世界上最珍贵的稀有食用菌之一 ,其肉质鲜嫩 ,香甜
可口 ,属于高级营养滋补品。含有丰富的蛋白质、碳
水化合物、多种维生素及 20种氨基酸 ,特别是有机
锗的含量很高 ,在医学上也有重要价值。[2 ]值得一提
的是羊肚菌含有 C-3-氨基-L-脯氨酸 ,α-氨基异丁
酸 , 2, 4-二氨基异丁酸 ,使其具有独特的风味 [ 3]。故
与其相关的研究一直是食用菌学的热门课题。 目前
羊肚菌尚不能进行大面积、商业化的人工栽培。因
此 ,国际市场价格居高不下。 其产品主要来自野生
菌。在羊肚菌发生期 ,商贩云集产区 ,纷纷高价收购 ,
剌激了人们对野生羊肚菌的滥采乱挖 ,不仅破坏了
植被 ,而且影响了野生羊肚菌正常繁衍生息。陕北也
是羊肚菌的产区 ,其纯种的分离尚未见报道。为此 ,
笔者在 1997年至 1998年资源调研 [4 ]的基础上 ,于
2000年 4月至 2001年 5月用陕北野生羊肚菌子实
体的组织和孢子进行了母种分离研究的探索 ,并分
离到几株纯种 ,其中两株人工瓶栽长出子实体。现将
研究过程和结果报道于后。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
1. 1. 1　供试培养基: 分离、纯化分别用 PDA和综
合 PDA培养基 ;复壮用综合 PDA加 1%的 x因子
培养基 ;瓶栽用木屑培养基加 5%的 y因子。
1. 1. 2　供试羊肚菌子实体:褐色和乳白近浅黄色子
实体。
1. 1. 3　其它器具和设备: 9 cm培养皿 (无菌 ) , 500
ml广口瓶 (无菌 ) , 18× 200 mm试管 ,罐头瓶 ,无菌
手术 (眼科 )剪 ,无菌水、棉花、滤纸 , 75%的乙醇 ,接
种锄等母种分离常用设备和器具。
1. 2　方法
1. 2. 1　培养基制备:常规方法倒培养皿 ,置斜面 ,分
装广口瓶 (约 20 m l并挂悬钩 )和罐头瓶 ,灭菌备用。
1. 2. 2　子实体的采集:
1. 2. 2. 1　子实体的采集时间 ,次数与编号:子实体
的采集时间选择于羊肚菌的盛产期 ,每年的 4月下
旬至 5月上旬 (其中 2000年采子实体两次 , 2001年
采三次 )。采后除去表面异物及菌 柄基部泥土等 ,编
号后用无菌纸包裹装盒内 ,速回实验室供分离用。
1. 2. 2. 2　分离用子实体的选择:将带回实验室的子
实体依色泽分别选择丛生或对生 ,单生的菌盖凹窝
深而小 ,直径在 3～ 5 cm、没有虫蛀 ,柄基部最好没
有孔裂 (口 )的作分离材料。
1. 2. 3　分离方法与接种
1. 2. 3. 1　孢子分离法:子实体表面先用 75%的乙
醇棉球擦一遍 ,然后用无菌水冲洗 ,无菌滤纸吸水 ,
无菌棉球吸干余水。如此重复三次后 ,将子实体的菌
盖朝下 ,无菌操作悬挂于广口瓶中 ,经适温培养 ,收
集孢子后 ,取出子实体 ,继续培养 ,使孢子萌发并长
收稿日期: 2002- 6- 14
基金项目: 陕西省教育厅专项基金资助 ( 01 JK098)。
作者简介: 任桂梅 ( 1955— ) ,女 ,陕西清润县人 ,副教授。
成菌丝体。
1. 2. 3. 2　组织分离法与接种:组织分离法子实体表
面分消毒处理和不消毒处理两种方法。a.消毒处理 ,
其方法同孢子分离法。 接种时用无菌眼科剪从菌盖
顶端开始剪取绿豆大小的三块菌盖组织无菌操作接
种于同一培养皿内 ,另取三块菌柄组织接于另一皿
内。 b.不消毒处理 ,用无菌眼科剪分别剪取菌盖和
菌柄·内·壁无菌组织 (如绿豆大小 )各三块分别接种培养皿 ,上述两种处理方法每次菌盖和菌柄各接两个
培养皿。
1. 2. 3. 3　培养:接种后的广口瓶和培养皿均置 18
～ 20℃室内避光培养。每隔 12 h观察一次孢子和组
织块中菌丝萌发 ,污染情况和菌落大小等 ,并详细记
录之。
1. 2. 4　纯化:
1. 2. 4. 1　孢子分离母种的纯化 ,待孢子萌发并形成
絮状菌丝体后 ,无菌操作用接种锄挑取广口瓶内无
污染的菌丝体与少量培养基一起接种于培养皿内
(每个广口瓶接种三个平皿 )进行纯化培养。
1. 2. 4. 2　组织分离母种的纯化:组织块中的菌丝萌
发 ,菌落直径达 2～ 3 cm时 ,无菌技术挑取菌落边缘
没有被污染的少许菌丝体及其培养基接于另一培养
皿内 (每皿接 3个 ) ,适温下进行纯化培养并定时观
察记录。
1. 2. 5　纯化母种的复壮:将上述分离并经纯化培养
后的母种 ,无菌操作接种于斜面复壮培养基中进行
复壮培养 (同时用综合 PDA培养基作对照 )。 适温
温养后 ,观察记录复壮情况。
1. 2. 6　罐头瓶栽培小试验: [2 ]将复壮后的菌种分别
接种于经高压灭菌的木屑加 y因子培养基 (表面覆
盖一层约 1 cm腐殖土 )的罐头瓶内。室温 18～ 22℃
避光培养发菌 ,次年室外出菇。
2　结果与分析
2. 1　分离结果与分析
2. 1. 1　孢子分离母种和结果。 经 40～ 48 h的适温
培养后 ,可见孢子萌发成肉眼可见的菌丝。 72 h后
在培养基表面长成絮状 ,但污染较严重 (污染面积约
占培养基总面积的 40% (细菌污染居多 )。
2. 1. 2　组织分离母种的结果:子实体接种前处理与
不处理 ,组织中菌丝体萌发的快慢、污染、菌落直径
达 2 cm左右所用时间的长短等等均是不同的 ,详见
表 1统计。
表 1　陕北野生羊肚菌组织分离母种结果统计　　　　　　　　　　　　单位: 个%
子实体
接种时 观测项目
菌　株　编　号
M延- 1 M延- 2 M延 - 3 M延- 4 M延 - 5 M延- 6 M延 - 7 M延- 8 M延- 9
消　毒　处　理
接种块数 (个 ) 24 24 24 24 24 36 36 36 36
污染数 (个 ) 8 6 7 6 8 9 7 5 9
污染率 (% ) 33. 33 25. 0 28. 33 25. 0 41. 7 25. 0 19. 44 13. 89 25. 0
菌丝萌发时间 ( h) 48- 60 48- 60 48- 60 48- 60 60- 72 60- 72 60- 72 48- 60 48- 60
菌落直径达 2. 0 cm
的时间 ( h ) 84- 96 84- 96 84- 96 84- 96 96- 108 96- 108 96- 108 84- 96 84- 96
菌丝生长状况 浓密 浓密 浓密 浓密 先疏后浓 先疏后浓 先疏后浓 不浓 较浓
与色泽 不白 较白 不白 不白 纯白 纯白 纯白 棕褐色 不白
没
有
消
毒
处
理
接种块数 (个 ) 24 24 24 24 24 36 36 36 36
污染数 (个 ) 4 3 4 5 4 5 6 4 2
污染率 (% ) 16. 67 12. 5 16. 67 20. . 8 16. 67 13. 9 16. 67 11. 11 5. 56
菌丝萌发时间 ( h) 36- 48 36- 48 36- 48 36- 48 48- 60 48- 60 48- 60 36- 48 36- 48
菌落直径达 2. 0
cm的时间 ( h) 72- 84 72- 84 72- 84 72- 84 84- 96 84- 96 84- 96 72- 84 72- 84
菌丝生长状况 浓密 浓密 浓密 浓密 先疏后浓 先疏后浓 先疏后浓 不浓 较浓
与色泽 不白 较白 不白 不白 纯白 纯白 纯白 棕褐色 不白
　　由上表统计结果可见 ,子实体在接种前表面处
理与不处理 ,在组织块处均存在不同程度的污染。总
体来看 ,不处理的污染率低于处理。该试验结果表
明:用 75%的乙醇、无菌水 ,无菌滤纸、无菌棉球等
处理子实体表面 ,难以达到完全无菌的目的 ,因此污
染仍然较高。而子实体表面不处理 ,取其菌盖和菌柄
内部无菌组织 ,接种的污染率相对能低些。但后者对
于子实体的要求也较高。由于 75%的乙醇渗透性较
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好 ,对组织块中菌丝的影响亦较大 ,组织块中菌丝的
萌发时间和菌落直径达约 2. 0 cm所用的时间 ,处理
较不处理要长 24 h左右。
2. 2　纯化的结果与分析
2. 2. 1　孢子分离母种的纯化 ,孢子分离母种污染较
严重 ,一般需经 3～ 5次平板纯化 ,方可得纯种。
2. 2. 2　组织分离母种的纯化: 组织分离母种时 ,污
染多发生在接块周围 ,且为细菌污染 ,纯化相对较简
单。纯化时只要选择没有被污染的菌落边缘的菌丝
体作接种材料 ,一般经 2～ 3次平板纯即可得到纯
种。笔者以此共得 9个纯化菌株。
2. 3　纯化母种的复壮:供试 9菌株在复壮培养基上
的菌丝体长势、长速均较综合 PDA培养基 (对照 )
浓密和快。这表明复壮培养基中添加的 x因子对菌
丝的生长可提供较全面的营养能达到复壮菌丝的作
用。
2. 4　罐头瓶栽培小试验结果: 栽培的 40瓶中 ,有 5
瓶先后长出较小的子实体 ,其余 35瓶未长子实体 ,
原因尚不清楚。该试验结果表明:分离到的纯种可用
于人工栽培 (室外 )。
3　小结与讨论
笔者通过两年先后五次采集野生羊肚菌新鲜子
实体进行母种分离 ,纯化、复壮试验 ,认为组织分离
母种的子实体表面不作消毒处理可以得到纯种。 分
离的成败 ,关键是子实体的选择。供试子实体不仅要
新鲜、没有虫蛀 ,而且还应具有 (菌盖、菌柄 )壁厚 ,菌
柄基部没有孔口和裂缝等。换言之 ,子实体腔应保持
无菌状态 ,取选无菌内壁组织作分离材料成功的概
率较高。 此外 ,接种块组织不宜过大 (过大易剪穿盖
壁和柄壁 ,造成接块污染 )和过小 (过小组块中的菌
丝尚未萌发即干 ,无法分离到母种 )。
人工瓶栽试验仅用四株菌种 ,其余五个菌株的
人工栽培试验结果待后报道。另外 ,陕北野生羊肚菌
纯种的其它特性进行研究之中。
组织分离纯种时 , 75%乙醇作表面消毒剂对组
织块中菌丝萌发有一定的影响 (因其穿透力等作
用 ) ,条件允许时建议用 0. 1%～ 0. 2%的升汞溶液
作表面消毒剂较好。
参考文献:
[ 1]杨新美 .中国食用菌栽培学 [ M ].北京:农业出版社 , 1988, 573.
[ 2]李素玲 ,尚春树 ,刘虹 ,等 .羊肚菌子实体栽培育初报 [ J].食用菌 , 1999( 4): 8— 10.
[ 3]薛知文 ,陶树兴 ,黄维玉 .食用菌学 [ M ].西安:陕西师范大学出版社 , 1992, 2— 3.
[ 4]任佳梅 ,权洪生 .陕北南泥湾羊肚菌资源调查初报 [ J].延安大学学报 (自然科学版 ) , 1999( 2) , 58— 61.
〔责任编辑　徐文梅〕
An initlal essay on the research of seperating parebred
Northern Shannxi Morchella
REN Gui-mei, GAO Xiao-peng, CHENG Guo-liang
( Bio- scientific Department of Yanan Universi ty Yanan Shannxi 716000, China )
Abstract: This essay is th e first one on the process and the result of the research on seperating the mother
- specie f rom purebred No rthern Shannxi Morchella spp. wi th i ts ti ssue and spo re.
Key words: Morchel la spp; tissue; spo re; seperation; mo ther- specie
67第 3期　　　　　　　　　　　　　　任桂梅 ,等:陕北野生羊肚菌母种分离研究初报