全 文 ：收稿日期:2008-05-05
老鹳草提取物对人结肠癌细胞株裸鼠肝转移的影响
黄国栋 1 ,游　宇 1 ,黄媛华3 ,唐丽君 3 ,杨治芳 1 ,徐　龙1 ,黄道富 2 ,肖美珍 2
(1.南昌大学第一附属医院 ,江西 南昌 330006;2.湖南中医药大学附属衡阳医院 ,湖南 衡阳 421001;
3.湖南省人民医院 ,湖南 长沙 410002)
　　摘要　目的:建立人结肠癌细胞株裸鼠肝转移模型 , 研究老鹳草提取物对裸鼠肝转移模型的影响。方法:采用
BALB/C裸鼠 , Ls174t人大肠癌细胞株 , 脾脏切除脾脏种植法建立裸鼠肝转移模型。将 36只裸鼠随机分成模型对
照组 、老鹳草提取物组和羟基喜树碱阳性对照组 , 给予老鹳草提取物喂养 , 观察一般情况及肿瘤生长情况;采用巢
式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测裸鼠循环血中 pS2表达;标本作病理组织学检查。结果:①脾脏切除脾脏种
植法建立裸鼠结肠癌肝转移模型的成功率为 100%, 病理组织学证实肝转移癌细胞呈人结肠癌低分化腺癌特征;②
老鹳草提取物组裸鼠肿瘤数目及质量明显低于羟基喜树碱组(P<0.05);③老鹳草提取物组裸鼠血中 pS2表达为
7.598±0.046,明显高于羟基喜树碱组 3.794±0.020(P<0.05)。结论:老鹳草提取物可显著降低肝转移裸鼠血中
pS2表达 ,抑制裸鼠结肠癌肝转移的发展 ,且效果优于羟基喜树碱 ,可作为大肠癌术后预防复发和肝转移的治疗手
段之一。
关键词　老鹳草;结肠癌;肝转移;裸鼠;pS2;RT-PCR
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2009)01-0097-03
EffectsofGeraniumsibirumExtractsonLiverMetastases
inNudeMicewithColonicCancer
HUANGGuo-dong1 , YOUYu1 , HUANGYuan-hua3 , TANGLi-jun3 , YANGZhi-fang1 ,
XULong1 , HUANGDao-fu2 , XIAOMei-zhen2
(1.TheFirstAfiliatedHospitalofNanchangUniversity, Nanchang330006, China;2.TheAffiliatedHengyangHospital, HunnanUni-
versityofTraditionalChineseMedicine, Hengyang421001, China;3.ThePeople′sHospitalofHunanProvince, Changsha410002, Chi-
na)
Abstract　Objective:Toestablishnudemicemodelswiththelivermetastasesofcolonicadenocarcinomaandstudytheeffectsof
Geraniumsibirumextractsonthem.Methods:Nudemicelivermetastasesmodelofcoloniccancerwasestablishedwithhumancolonic
cancercellsline(Ls174t)inoculatedintomicespleen.36 nudemicewererandomlydividedinto3groups, containingcontrolgroup, Ge-
raniumsibirumextractsgroupandhydroxycamptothecinegroup.Theweightandsizeofthemiceandgrowthofthecarcinomawererecor-
ded.Allspecimenswereexaminedhistologically.pS2inbloodinnudemicewithlivermetastasisofcoloniccarcinomawasdetectedwith
nestedRT-PCR.Results:Theincidenceoflivermetastasiswas100% inthisintrasplenicinjectionmodel.Thepathologicalresults
showedthattumourcellsoflivermetastaseswerepoorlydiferentiatedhumancolonicadenocarcinoma.InGeraniumsibirumextracts
group, thetumornumberandtheweightoflivermetastasesweresignificantlylowerthanthoseinhydroxycamptothecinegroup(P<
0.05).Usingsemiquantitativeexamination, inGeraniumsibirumextractsgroup, therelativevalueofpS2expressioninbloodwassignifi-
cantlyhigherthanthatinhydroxycamptothecinegroup(P<0.05).Conclusion:Geraniumsibirumextractscanefectivelyinhibittheoc-
currenceoflivermetastasescarcinomaanddecreasethepositiveexpressionofpS2, italsohasbetterefectthanhydroxycamptothecine
sothatGeraniumsibirumextractsmaybecomethepotentialtherapeuticstrategyforlivermetatstasesofcoloniccancer.
Keywords　Geraniumsibirum;Coloniccarcinoma;Livermetastases;Nudemice;pS2;RT-PCR
　　大肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一 ,目前仍
以手术切除为首选治疗方法 ,但由于术后局部复发
和转移 ,其整体疗效仍不尽如人意 ,术后 5年生存率
在 50% ～ 55%之间 〔1, 2〕。近年来 ,通过西医和中医
药的综合治疗 ,患者的生存率有了明显提高〔3〕。
老鹳草的主要成分为鞣质 〔4〕 、黄酮类 、有机酸
及挥发油等 ,具有广谱抗菌 、抗病毒及抗氧化等多种
药理作用 〔5〕 ,目前笔者发现其对肿瘤也有一定的作
用。本实验通过建立裸鼠结肠癌肝转移模型 ,应用
pS2表达等观察指标 ,研究中药老鹳草提取物对裸
鼠结肠癌肝转移的防治作用 ,并以羟基喜树碱为阳
性对照 ,以期为其临床应用提供实验依据。
1　材料
1.1　动物　BALB/c(nu/nu)裸鼠(购自上海市肿
·97·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 1期 2009年 1月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2009.01.053
瘤研究所中科院上海实验动物中心),共 36只 ,雄
性 , 4 ～ 6周龄 ,体质量 18g±2g, SPF条件下饲养。
1.2 　药物及试剂　老鹳草提取物由南昌大学第一
附属医院中药制剂室制备(药材加 7.4%乙醇 ,浸泡
2 h,提取 2次 ,两次乙醇用量均为药材量的 12倍 ,
提取时间均为 30min,浓缩至生药浓度 2 g/mL);羟
基喜树碱(Hydroxycamptothecine, HCPT,湖北黄石飞
云制药公司 ,批号:H4202283);pS2抗体(美国 Santa
Cruz公司);免疫组化 、RT-PCR相关试剂(晶美有限
公司)。
1.3 　实验细胞　人结肠腺癌 Ls174t细胞株 ,购于
中科院上海细胞库。
2 　方法
2.1 　人结肠腺癌 Ls174t细胞株的培养 、制备　Ls
174t细胞悬液的制备采用 RPMI-1640完全培养基 ,
置于 37℃、5%CO2 培养箱内 , 取对数生长期的细
胞 ,用 0.25%胰蛋白酶(含 0.01% EDTA)消化 ,制
成细胞悬液 0.1mL,含细胞数 1×106个 ,台盼蓝测
定细胞活力在 95%以上 。
2.2 　荷瘤裸鼠动物模型的建立 〔6〕 　36只裸鼠随
机分为模型对照组 、老鹳草提取物组和羟基喜树碱
组(各 12只),经腹腔注射 1%戊巴比妥钠 0.15 ～
0.2mL(40mg/kg)麻醉 ,左肋缘下 0.5cm处打开腹
腔 ,用 4号针将 0.1mL细胞悬液缓慢注入脾脏下缘
的包膜下 ,注射后用 75%酒精棉球压迫出血点 , 5
min后将脾脏切除 ,腹壁全层缝合 ,置于 SPF动物房
中喂养 。老鹳草提取物组每天腹腔内注射老鹳草提
取物(5mg/kg),模型对照组裸鼠腹腔内注射生理
盐水 10 mL/kg。羟基喜树碱组腹腔内注射羟基喜
树碱 2.5 mg/kg。各组均每周腹腔注射 1次 ,连续 3
周(药物剂量参照人体剂量的 10倍左右给予)。
2.3 　观察指标
2.3.1　一般观察及标本处理:密切观察裸鼠的生
长变化 ,每天记录裸鼠体质量 、摄食量及活动。喂养
3周后处死 ,检查肝转移癌结节数目 ,摘取并称重 。
肝脏标本经 10%福尔马林固定 ,石蜡包埋切片 ,免
疫组化检测 pS2的表达。免疫组化按即用型一步快
速免疫组化 MaxvisionTM试剂盒说明书操作。
2.3.2　RT-PCR检测 pS2基因表达:裸鼠处死前心
脏采血 ,另取 10只正常裸鼠血液标本作正常对照 ,
分别置于肝素抗凝管内 ,混匀 。单核细胞制备采用
密度梯度离心法 ,总 RNA提取采用 Trizol抽提法 。
应用 Gibco公司生产的逆转录试剂盒合成 cDNA,具
体操作步骤按制造商提供方法进行 。引物合成:按
文献报道方法合成 pS2引物和 β -actin引物。用
RT-PCR检测 pS2、PAFmRNA基因表达:取 10 μg
总 RNA进行逆转录 ,取 1 μL逆转录产物进行 PCR
扩增 , pS2 正义引物序列为:5′-CCATGGAGCA-
CAAGGTGACCTG-3′,反义序列为:5′-GGGAAGCCA-
CAATTTATTCT-3′, β -actin正义引物序列为:5′-
TGGGACGATATGGAGAAGAT-3′, 反义序列为:5′-
ATTGCCGATAGTGATGACCT-3′。扩增产物用 1.5%
琼脂糖凝胶电泳 、EB显色用 TanonGIS-1000数码凝
胶图象分析系统分析 ,扩增长度分别为 124 bp, 521
bp。将产物的表达信号与内参比较 ,求出比值 ,进行
统计学处理。
2.4　统计学处理　实验数据以 x±s表示 , t检验
或确切概率法 , P<0.05为有统计学意义 。
3　结果
3.1　一般情况　接种初期 ,老鹳草提取物组和羟
基喜树碱组裸鼠均活跃如常 ,体形无改变;2w后 ,老
鹳草提取物组裸鼠大部分生长良好 ,未发现恶液质;
而羟基喜树碱组裸鼠大部分出现消瘦 ,精神差 ,摄食
减少 。老鹳草提取物组裸鼠前后体质量增长值显著
高于羟基喜树碱组(P<0.05);老鹳草提取物组和
羟基喜树碱组裸鼠肝表面均发现 0.2 ～ 0.7 cm的灰
白色肝转移癌结节 ,肝转移率均为 100%。老鹳草
提取物组转移数目明显少于羟基喜树碱组 ,且癌结
节质量也明显低于羟基喜树碱组(P<0.05);其癌
质量 /肝质量比值亦明显小于模型对照组 (P<
0.05)。
3.2　老鹳草提取物对裸鼠接种人结肠癌细胞肝转
移模型移植瘤生长情况的影响　结果如表 1所示 ,
与模型对照组相比 ,老鹳草提取物和羟基喜树碱均
可抑制移植瘤体的体积增长(P<0.01),但老鹳草
提取物组效果更明显(P<0.01)。
　表 1　　各组裸鼠移植瘤体积的比较( x±s, n=12)
组别 剂量 /(mg/kg)实验前瘤体体积 /mm3
实验后瘤体体积 /
mm3
模型对照组 - 52.83±16.22 171.01±91.34
羟基喜树碱组 2.5 62.31±12.91 92.81±40.73＊＊
老鹳草提取物组 5 58.73±11.11 63.31±27.93＊＊#
　　注:与模型对照组相比 , ＊＊P<0.01;与羟基喜树碱组相比 , #P<
0.05
3.3　裸鼠接种人结肠癌细胞肝转移模型肝脏标本
内 pS2阳性细胞数的比较　与羟基喜树碱组(实验
后)比较 ,老鹳草提取物组移植瘤体的 pS2表达显
著增高(P<0.05),见表 2。
3.4　移植瘤组织内 pS2 mRNA检测结果比较　结
果见表 3和图 1,与模型对照组实验后比较 ,实验组
移植瘤体的 pS2表达显著增高(P<0.01)。
·98· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 1期 2009年 1月
　表 2　　　　　各组裸鼠移植瘤内 pS2的
阳性细胞数( x±s, n=12)
组别 剂量 /(mg/kg) pS2(实验前) pS2(实验后)
模型对照组 - 12.83±0.22 14.01±0.04
羟基喜树碱组 2.5 12.24±0.15 17.43±0.02＊
老鹳草提取物组 5 12.79±0.03 27.52±0.04＊＊#
　　注:与模型对照组相比 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;与羟基喜树碱
组相比 , #P<0.05
　表 3　　　　各组裸鼠移植瘤内 PS2mRNA
检测结果比较( x±s, n=12)
组别 剂量 /(mg/kg) pS2(实验前) pS2(实验后)
模型对照组 - 2.83±0.022 3.801±0.024
羟基喜树碱组 2.5 2.642±0.034 3.794±0.020
老鹳草提取物组 5 2.790±0.037 7.598±0.046＊＊
　　注:与模型对照组相比 , ＊＊P<0.01
图 1　移植瘤组织内 pS2mRNA检测结果比较
1.模型对照组　2.老鹳草提取物组裸鼠(实验前)　3.羟
基喜树碱组裸鼠(实验前)　4.老鹳草提取物组裸鼠(实验
后)　5.羟基喜树碱组裸鼠(实验后)　M.DNAladdermark
4 　讨论
裸鼠体内肝转移模型建立的主要方法有盲肠壁
种植法和脾脏切除脾脏种植法 。本实验采用目前较
为公认的脾脏切除脾脏种植法 ,该法运用单细胞悬
液注入脾脏 ,再由脾脏经血液进入肝脏 ,由于脾脏本
身是一个免疫器官 ,癌细胞必须逃脱淋巴细胞 、巨噬
细胞等的攻击后才能到达肝脏形成转移〔7, 8〕 ,因此
采用该法造模 ,更接近临床病人结肠癌肝转移的过
程 。本研究成功地建立了人结肠癌细胞株裸鼠肝转
移模型 ,肝转移率达 100%,病理组织学检查显示 ,
裸鼠肝转移癌灶呈人结肠癌低分化腺癌表现。 pS2
属于三叶草因子家族 ,正常表达于胃组织 ,异位表达
于胃肠道炎症和大量癌组织中 。其表达受多种因素
调节〔9〕。 pS2在恶性组织中的广泛表达 〔10〕 ,表明它
在组织的恶变过程中发挥着一定作用 ,可能会成为
癌的一个标记物 〔11〕。本实验通过检测人结肠癌裸
鼠移植瘤中 pS2的表达发现 ,与羟基喜树碱组(实
验后)相比 ,老鹳草提取物可使移植瘤的 pS2表达
增高 ,差异有统计学意义(P<0.05)。表明老鹳草
提取物能抑制移植瘤的生长 。本实验建立的裸鼠肝
转移模型中 ,人结肠癌细胞在裸鼠肝转移过程中并
不改变原有生物学特性 ,即裸鼠肝转移模型循环血
中 pS2表达阳性 ,表明 pS2表达可作为检测肝转移
模型成功的指标之一。此项实验研究结果为临床结
肠癌患者的诊治提供了理论基础 ,也为老鹳草抗肿
瘤的应用提供了实验依据。
参 考 文 献
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