全 文 ：　制剂与炮制　
收稿日期:2008-08-02;　修订日期:2008-12-22
作者简介:赵　敏(1984-),女(汉族),陕西咸阳人 ,现任西安交通大学医
学院在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事天然产物化学成分研究工作.
＊通讯作者简介:王军宪(1953-), 男(汉族),陕西渭南人 , 现任西安交通
大学医学院教授 ,学士学位 ,主要从事天然产物化学成分研究工作.
假奓包叶抗菌活性部位提取工艺研究
赵　敏 ,张元媛 ,陈　晟 ,张　璐 ,王军宪＊
(西安交通大学医学院 ,陕西 西安　710061)
摘要:目的 筛选假奓包叶抗菌活性部位的最佳分离工艺。方法 以没食子酸为检测指标 ,采用 HPLC测定没食子酸的含
量 , 对假奓包叶的提取分离工艺进行研究。结果 最佳工艺为:以水作为溶剂 ,采用温浸法提取 ,原料粉碎为中粉 ,液料比
20∶1(g∶ml), 提取温度为 50℃, 提取时间 8 h,提取 1次。结论 该提取分离方法提高了假奓包叶的利用率 , 且简便可
行 , 提取物具有抗菌活性 ,可用于工业生产。
关键词:抗菌活性部位;　假奓包叶;　提取工艺
中图分类号:R284.2　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2009)09-2339-02
　　假奓包叶又名金沙叶 、艾桐 、老虎麻 ,原植物为大戟科假奓包
叶属植物假奓包叶 Discocleidionrufescens(Franch.)Paxet
Hoffm., 主产于陕西 、甘肃 、湖北 、湖南 、川贵等地 [ 1] 。民间以根皮
入药 , 具有清热解毒 、泄水消积的功效 , 用于治疗水肿 、食积 、毒
疮 、鹅掌风等症 [ 2] 。在对其化学成分研究中发现 , 该植物中含有
的结构类型包括黄酮类 、有机酸类 、三萜类和蒽醌类化合物等 ,其
中 , 没食子酸的含量较高 ,且该化合物具有抗菌 、杀锥虫 、抗肿瘤 、
清除自由基和抗氧化等药理活性 [ 3～ 6] 。故本研究以没食子酸含
量作为指标 , 对假奓包叶叶中的抗菌活性成分的提取工艺进行初
步研究和探讨。
1　仪器与试药
LC-2010A型高效液相色谱仪(日本岛津公司);AE240S型
电子分析天平(瑞士 METTLER公司);HS6150D超声振荡仪(天
津市恒奥科技发展有限责任公司);RE-52型旋转蒸发仪(上海
亚荣生化仪器厂);HH-4型数显恒温水浴锅(国华电器有限公
司);SHZ-D循环水真空泵(河南巩义市英峪予华仪器厂)。
假奓包叶采于陕西汉中地区 ,经西安交通大学医学院药学系
天然药物化学研究室王军宪教授鉴定为大戟科植物假奓包叶
Discocleidionrufescens(Franch.)PaxetHoffm.的叶;没食子酸对
照品(实验室自制 , 纯度 >98%);高效液相用甲醇为色谱纯;蒸
馏水自制;其余试剂均为分析纯。
2　方法与结果
2.1　含量测定
2.1.1　色谱条件 色谱柱为 DikmaDiamonsilC18柱(4.6 mm×
250mm, 5μm), 流动相为甲醇 -0.1%磷酸水溶液(5∶95),检测
波长为 269 nm;流速为 1.0 ml· min-1;柱温为 25℃。
2.1.2　对照品储备液的制备 精密称取没食子酸对照品 21.8
mg,置于 50ml的容量瓶中 ,用甲醇配成浓度为 0.436 mg· ml-1
的对照品储备液 , 备用。
2.1.3　供试品溶液制备 取干燥假奓包叶叶粗粉 1 g, 精密称
定 , 置具塞锥形瓶中 , 精密加入蒸馏水 20 ml, 50℃下温浸提取 8
h,放冷 , 摇匀 ,滤过 , 精密吸取续滤液 5 ml至蒸发皿中 , 蒸干 , 残
渣用甲醇转移并定容至 5 ml容量瓶内 , 摇匀 ,经 0.45 μm微孔滤
膜过滤 ,即得供试品溶液。
2.1.4　 标准曲线及线性关系考察 精密吸取对照品储备液
0.10, 0.80, 1.60, 2.50, 3.75, 5.00ml,分别置 10 ml量瓶中 , 加甲
醇定容至刻度 , 摇匀 , 分别精密吸取上述溶液各 10 μl, 注入高效
液相色谱仪 ,测定峰面积 , 以没食子酸对照品浓度(mg· ml-1)为
横坐标 ,峰面积积分值为纵坐标 , 绘制标准曲线 , 回归方程为 Y=
3 ×107X+508 65(r=0.999 6), 表明没食子酸的浓度在 0.004
～ 0.218 0 mg· ml-1与峰面积呈良好的线性关系。
2.1.5　精密度实验 精密吸取上述 “ 2.1.4”项浓度为 0.109 0
mg· ml-1的对照品溶液 ,重复进样 5次 , 10 μl/次 , 平均峰面积为
386 573, RSD为 0.44%,说明仪器精密度良好。
2.1.6　重复性实验 取同批号的假奓包叶叶样品 5份 , 依法制
备供试品溶液 ,按拟定的色谱条件进行测定 , 并按外标法计算 , 结
果测定没食子酸的平均含量为 0.427%, RSD为 2.17%。
2.1.7　稳定性实验 取没食子酸对照品溶液 , 分别在 0, 2, 4, 6,
8, 12, 24 h进样 1次 , 依法测定 , 平均峰面积为 3 105 072, RSD为
0.60%,说明没食子酸稳定性较好。
2.1.8　加样回收率实验 精密称取假奓包叶叶粗粉 1 g(相当于
没食子酸约 0.2 mg), 准确加入 0.2 mg没食子酸对照品 , 按
“ 2.1.3”项下方法制备供试品 5份 ,分别进样 10μl, 测定峰面积 ,
计算加样回收率。结果平均回收率为 100.6%, RSD为 1.68% 。
2.2　提取工艺 首先对提取溶剂和提取方法进行了筛选 ,并在此
基础上采用正交法对提取工艺进行优选。选取 5个对提取率影
响较大的因素(粉碎度 、液料比 、温度 、时间和次数)、每个因素选
择 3个水平进行考察 , 按 L18(37)表安排实验 , 以没食子酸的含量
为实验指标 ,筛选抗菌部位的最佳提取工艺。
2.2.1　提取溶剂的选择 取 1g假奓包叶粗粉 3份 ,精密称定 , 分
别置 100 ml圆底烧瓶中 , 各加入蒸馏水 、 95%乙醇 、 70%酸性乙
醇(用盐酸调 pH值为 2)30 ml,置水浴锅中回流提取 2 h,提取 1
次。提取完毕 , 过滤 ,精密吸取续滤液 5 ml置蒸发皿中 , 在 80℃
水浴中蒸干 , 用甲醇溶解残余物 , 转移并定容至 5 ml容量瓶中 ,
经微孔滤膜过滤后 , 按 “ 2.1”项下含量测定方法测定其含量 , 并
按以下公式计算没食子酸的产率。
没食子酸的产率(%)=没食子酸含量(mg· ml-1)×体积(ml)药材重量(mg) ×100%
2.2.2　提取方法的选择 取 1g假奓包叶粗粉 3份 ,精密称定 , 置
100 ml圆底烧瓶中 ,依次加入蒸馏水 30 ml, 分别采用冷浸法(常
温)、温浸法(40℃)、煎煮法提取 , 提取时间均为 2 h, 提取 1次。
提取完毕 ,过滤 , 精密吸取各续滤液 5 ml置蒸发皿中 , 在 80℃水
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.9 时珍国医国药 2009年第 20卷第 9期
浴中蒸干 , 用甲醇溶解残余物 , 转移并定容至 5 ml容量瓶中 , 经
微孔滤膜过滤后 , 按 “ 2.1”项下含量测定方法测定其含量 , 并按
“ 2.2.1”项下公式计算没食子酸的产率(%)。
2.2.3　正交实验 根据数次预试结果 , 采用温浸法(40 ～ 60℃),
以水作为溶剂提取假奓包叶叶中的抗菌活性部位。为了进一步
优选最佳的提取工艺 ,采用正交实验 L18(37)设计安排实验 ,以没
食子酸的产率为指标 ,具体考察药材粉碎度 、液料比(g∶ml)、温
浸温度 、时间及次数 5个因素 ,每个因素选 3个水平 , 具体因素水
平见表 1。
表 1　正交实验因素水平
水平 A粉碎度
B
液料比 /g∶ml
C
温浸温度 /℃
D
提取时间 t/h
E
提取次数
1 细 20∶1 40 2 1
2 中 30∶1 50 4 2
3 粗 40∶1 60 8 3
精密称取干燥的假奓包叶 1 g,共 18份 , 按正交实验设计表
(见表 2)温浸提取。 提取液过滤 , 分别精密量取各次提取液 5,
10, 15 ml至蒸发皿中 , 蒸干 ,残余物用甲醇转移并定容至 5 ml容
量瓶内。按 “ 2.1”项下的含量测定方法测定样品溶液中没食子
酸的浓度(mg· ml-1), 并按 “ 2.2.1”项下公式计算没食子酸的产
率(%)。具体实验安排 、结果和方差分析见表 2 ～ 3。
表 2　L18(37)正交实验安排及结果
序号 因素水平A B C D E
没食子酸
产率(%)
1 1 1 1 1 1 0.190
2 1 2 2 2 2 0.273
3 1 3 3 3 3 0.280
4 2 1 1 2 2 0.364
5 2 2 2 3 3 0.425
6 2 3 3 1 1 0.138
7 3 1 2 1 3 0.271
8 3 2 3 2 1 0.171
9 3 3 1 3 2 0.343
10 1 1 3 3 2 0.302
11 1 2 1 1 3 0.227
12 1 3 2 2 1 0.242
13 2 1 2 3 1 0.340
14 2 2 3 1 2 0.196
15 2 3 1 2 3 0.312
16 3 1 3 2 3 0.270
17 3 2 1 3 1 0.269
18 3 3 2 1 2 0.218
K1 0.252 0.290 0.284 0.207 0.225 K2 0.296 0.260 0.295 0.273 0.283 K
3 0.257 0.256 0.226 0.327 0.298R 0.044 0.034 0.069 0.120 0.073
表 3　正交实验方差分析
因素 偏方平方和 自由度 F值 显著性
粉碎度(A) 0.007 2 7.000
液料比(B) 0.004 2 4.000
温浸温度(C) 0.016 2 16.000
温浸时间(D) 0.043 2 43.000 ＊
温浸次数(E) 0.018 2 18.000
误差 0.001 2 1.000
　　＊P<0.05,具有显著性差异
从表 2的实验结果分析可以看出 , 在实验考察范围内 , 各因
素对没食子酸含量的影响程度大小次序为:D>E>C>A>B。
提取时间对提取液中没食子酸产率影响最大 ,液料比对产率的影
响最小。从表 3的正交实验方差分析可以看出 ,在实验考察范围
内 , 仅提取时间因素各水平间具有显著性差异。结合实际操作 ,
最终确定以没食子酸为指标的抗菌部位提取的最佳工艺条件是
A2B1C2D3E1 , 即以水作为溶剂 , 采用温浸法提取 , 原料粉碎度为
中粉 , 液料比为 20∶1, 提取温度为 50℃, 提取时间 8 h, 提取 1
次。
2.2.4　提取物抗菌作用验证 采用扩散法对所得提取物的体外
抗菌活性进行检测。以金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作为供试
菌 , 用打孔器将定量滤纸制成直径 6 mm的圆形小纸片 , 经高压
灭菌处理 , 37℃烘干后 ,备用。采用划线法将供试菌株密集接种
于营养琼脂平板 ,取一张滤纸片蘸取样本 , 紧贴于已接种过供试
菌的平板表面 ,做好标记。置 4℃下作用 12 h, 于 37℃, 48 h培养
后测定抑菌环直径。结果显示 ,该提取物的抑菌环直径均在 8 ～
10 mm之间 , 具有一定的体外抗菌活性。
3　讨论
有文献报道用酸醇提取药材中的多酚类物质 [ 7] , 故我们也
将这种方法列入至提取溶剂的考察中。结果发现 ,酸水提取液中
的没食子酸含量较低 ,表明没食子酸在酸性条件下不稳定 , 不宜
在酸性条件下提取。实验同时也考察了碱性条件下没食子酸的
稳定性 ,取浓度为 0.126 7 mg· ml-1的没食子酸对照品甲醇溶
液 , 用 4%NaOH调 pH为 12, 密塞后于 60℃下静置 0.5 h, 测定静
置前后没食子酸的含量 ,结果显示静置后无法测出没食子酸的色
谱峰 , 说明没食子酸在碱性下不稳定 , 不宜在碱性条件下提取。
在预试和正交实验的基础上 ,我们初步筛选出假奓包叶中抗
菌活性部位的提取工艺 ,通过体外抗菌实验验证 , 证实其具有一
定的抑菌活性。该方法简便可行 ,可用于工业生产。
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