全 文 ：第 2 9卷第8期
2 0 1 2 年 8 月
精 细 化 工
FINE CHEMICALS
Vol ． 2 9，No ． 8
Aug． 2 0 1 2
催化与分离提纯技术
收稿日期:2012 － 03 － 08;定用日期:2012 － 05 － 15
基金项目:陕西省科技发展计划项目(2010K01 － 15)
作者简介:杨玲引(1973 －) ，女，高级工程师，E － mail:shxqgy@ 126． com。
假奓包叶氨基酸提取纯化工艺及其氨基酸组成分析
杨玲引，蔡 静，刘华锋，侯丽芳，魏利军，冯 锐
(陕西省轻工业研究设计院 食品研究所，陕西 西安 710054)
摘要:用响应面法考察假奓包叶氨基酸提取最佳工艺并确定其氨基酸组成，以氨基酸提取率为评价指标，通过单
因素和响应面实验优化其工艺条件并进行氨基酸分析。在盐酸浓度 6. 1 mol /L，液料比〔即溶液用量(mL)与原
料质量(g)的比值，下同〕21. 6∶1，水解时间 22. 3 h，水解温度 100 ℃条件下，氨基酸的提取率为 11. 21%。再经活
性炭脱色、离子交换树脂纯化后得到假奓包叶氨基酸产品。氨基酸分析结果表明，假奓包叶氨基酸产品中总氨
基酸质量分数为 79. 7%，其中必需氨基酸的质量分数达 24%，可作为功能性食品或药品的营养添加剂应用。
关键词:假奓包叶;氨基酸;分离纯化工艺;氨基酸分析
中图分类号:TQ461 文献标识码:A 文章编号:1003 － 5214(2012)08 － 0765 － 05
Extraction and Purification of Amino Acid from the Leaves of
Discoleidion rufescens and Its Constituent Analysis
YANG Ling-yin，CAI Jing，LIU Hua-feng，HOU Li-fang，WEI Li-jun，FENG Rui
(Department of Food Research，Shaanxi Research and Design Institute of Light Industry，Xian 710054，Shaanxi，China)
Abstract:Amino acid was extracted from the leaves of Discoleidion rufescens by acid hydrolyzed protein
method and its constituents were ascertained． The single factor experiment and response surface
experiment were applied to determine the optimum production conditions with the evaluation of the ratio
of amino acid extraction． The results are as follows:the extraction rate of amino acid was 11. 21% under
these conditions:concentration of hydrochloric acid 6. 1 mol /L，ratio of liquid(mL)to material(g)
21. 6∶1，hydrolysis time 22. 3 h，hydrolysis temperature 100 ℃ ． Then，the product was subjected to
activated charcoal decoloration and ion exchange chromatography to give the final product． The
constituent analysis shows that the amino acid content in the product was 79. 7%，among which the
total essential amino acid mass fraction was 24% ． The product can be used as functional food or
nutritional additives for medical purposes．
Key words:Discoleidion rufescen;amino acid;extraction and purification technology;analysis of amino
acid
Foundation item:Supported by Science and Development Foundation of Shaanxi Province(2010K01 －
15)
假奓包叶又名桑珠、野桑叶，原植物为大戟科假
奓包叶属植物假奓包叶(Discoleidion rufescens)［1］，
落叶乔木或灌木，高约 2 m，山坡、河边呈灌丛生长，
主产于陕西、甘肃、四川、湖北、湖南等地［2］。假奓
包叶在陕西秦巴山区分布较广，生长力旺盛，其叶因
具有丰富的营养和保健作用，常作为食品及动物饲
料在民间广泛应用，目前国内外对假奓包叶的研究
主要集中在形态学、化学成分等领域。朱华旭、闵知
大［3］、王军宪［4］等人研究表明，假奓包叶中含有黄
酮、三萜、甾体、香豆素、对苯醌、蒽醌等类化合物。
经课题组前期实验研究发现其氨基酸含量丰富，但
目前鲜见对假奓包叶中氨基酸进行研究的报道。因
DOI:10.13550/j.jxhg.2012.08.019
此，本文研究假奓包叶提取氨基酸，分析氨基酸组
成，为假奓包叶氨基酸的功能食品和药品的开发提
供一定的理论依据和技术支持。
1 实验部分
1. 1 材料与仪器
1. 1． 1 材料
所用假奓包叶采于陕西秦巴山区。无水乙醇、盐
酸、氨水、氢氧化钠、茚三酮、碘酸钾等试剂均为 AR。
茚三酮显色剂:茚三酮 0. 5 g、D-果糖 0. 3 g、磷
酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)10. 0 g 及磷酸二氢钾
(KH2PO4)6. 0 g(磷酸 pH = 6. 47 ～ 6. 64) ，定容至
100. 0 mL;碘酸钾稀释液:准确称取 1 g 碘酸钾固体
溶于蒸馏水中并稀释至 300 mL，再加 200 mL 体积
分数 95%乙醇溶液，混匀备用;薄层色谱展开剂:V
(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)= 4∶1∶5。
1. 1. 2 仪器
8900 型氨基酸分析仪，日本 Hitachi 公司;722
型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司;高
速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 假奓包叶氨基酸的制备
选取新采摘、无病虫害、叶片完整的假奓包叶，
洗净除去表面的灰尘污垢，于 50 ℃恒温烘干至恒
重、粉碎机粉碎，过 2 目筛，备用。
精确称取 500 g 经预处理的假奓包叶，加入 20
倍体积 pH = 9 的 NaOH 水溶液，置于 60 ℃恒温水
浴下提取 90 min，待溶液冷却至室温后，抽滤弃去沉
淀，取滤液浓缩得假奓包叶蛋白。
采用盐酸水解法对假奓包叶蛋白进行水解，加
入一定体积和浓度的盐酸溶液，在一定温度、时间下
进行提取［5］，将氨基酸提取液减压浓缩，除去盐酸，
于 50 ℃恒温干燥得氨基酸粗品，将氨基酸粗品用蒸
馏水溶解，配制成质量浓度为 20 g /L 溶液，加入质
量分数 1%的活性炭，于 80 ℃脱色 30 min，趁热抽
滤，静置室温后用 0. 2 μm微孔滤膜过滤，取 100 mL
溶液上 732 型阳离子树脂柱(15 mm × 200 mm) ，用
不同质量浓度的氨水梯度洗脱，收集茚三酮反应显
色部分［6］，浓缩、干燥得氨基酸产品。
1. 2. 2 氨基酸测定方法
取干燥过的谷氨酸，配制质量浓度分别为 10、
20、30、40、50、60 mg /L的谷氨酸标准溶液。采用茚
三酮显色法显色［7］，于波长 566 nm 处测其吸光度，
以氨基酸质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘
制标准曲线，得到线性回归方程为:
y = 9. 6257x － 0. 0247
线性相关系数 R2 = 0. 999 0。
1. 2. 3 假奓包叶氨基酸组成含量分析
将得到的氨基酸产品按 GB /T 5009. 124—2003
方法，利用氨基酸自动分析仪检测其中氨基酸的种
类和含量［8］。
2 结果与讨论
2. 1 盐酸浓度的选择
精确称取 5 g 经碱液提取的假奓包叶蛋白 5
份，分别加入 75 mL 盐酸，即固定液料比(mL /g)为
15∶1，并于 100 ℃加热回流 4 h 后抽滤，通过茚三酮
法检测其吸光度值，考察盐酸浓度对假奓包叶蛋白
水解液中氨基酸提取率的影响，结果见图 1。
图 1 HCl浓度对氨基酸提取率的影响
Fig． 1 Effect of HCl concentration on amino acid content
由图 1 可以看出，随着盐酸浓度的增加，水解液
中氨基酸的提取率增加，达到峰值时氨基酸提取率
逐渐下降，这可能是由于盐酸浓度过低导致水解不
完全，过高则产生其他副产物所致，因此，选择盐酸
浓度为 6 mol /L。
2. 2 液料比的选择
精确称取 5 g 经碱液提取的假奓包叶蛋白 5
份，加入 6 mol /L HCl 溶液，于 100 ℃加热回流 4 h
后抽滤，通过茚三酮法检测其吸光度值，考察水解所
需盐酸液料比对假奓包叶蛋白水解液中氨基酸提取
率的影响，结果见图 2。由图 2 可以看出，随着液料
比的增大，水解液中氨基酸的提取率逐步增加，液料
比为 20∶1 时，氨基酸提取率达到最大值，而液料比
若过大，则会导致氨基酸和其他杂质发生副反应，增
加工业生产中的废水处理成本。因此，选择液料比
为 20∶1。
2. 3 水解温度的选择
精确称取 5 g经碱液提取的假奓包叶蛋白 5 份，
加入液料比为 20∶1，6 mol /L的 HCl溶液，于一定温度
下加热回流 4 h后抽滤，考察水解温度对假奓包叶蛋
白水解液中氨基酸提取率的影响，结果见图 3。
·667· 精 细 化 工 FINE CHEMICALS 第 29 卷
由图 3 可以看出，水解温度达到 100 ℃水解液
中氨基酸提取率基本达到最高，超过此温度后提取
率增大不明显，故选择水解温度为 100 ℃。
2. 4 水解时间的选择
精确称取 5 g 经碱液提取的假奓包叶蛋白 5
份，加入液料比为 20∶1，6 mol /L的 HCl溶液，于 100
℃下加热回流提取，考察水解时间对假奓包叶蛋白
水解液中氨基酸提取率的影响，结果见图 4。
图 4 水解时间对氨基酸提取率的影响
Fig． 4 Effect of hydrolysis time on amino acid content
由图 4 可以看出，随着水解时间的延长，水解液
中氨基酸的提取率逐渐提高，当到达 20 h 左右氨基
酸基本已被水解完全，再继续水解氨基酸的副反应
增多。同时实验过程中还采用了 TLC法每隔 4 h跟
踪监测蛋白水解程度，如图 5 所示，序号 1 ～ 6 分别
代表 4、8、12、16、20、24 h时取样的薄层色谱图。从
图 5 可以看出，在水解时间为 20 h 时，水解液中氨
基酸含量及成分最多，之后氨基酸含量则略有减少，
与茚三酮法检测结果一致，因此，选择对假奓包叶蛋
白水解时间为 20 h。
图 5 不同水解时间下水解液中氨基酸的 TLC检测结果
Fig． 5 TCL test result of amino acid concentration with different
time of hydrolysis
2. 5 响应面分析
2. 5. 1 Box-Bennken设计方案
在单因素实验基础上，根据 Boe-Bennken 的中
心组合实验设计原理［9］，选取对氨基酸提取率影响
较大的因素:盐酸浓度、液料比、水解温度进行响应
面优化实验，因素与水平设计见表 1，响应面分析方
案见表 2。
表 1 实验因素与水平表
Table 1 Factors and levels of the designed experiment
因素
水平
－ 1 0 1
液料比 /(mL /g) 15∶1 20∶1 25∶1
水解时间 /h 16 20 24
盐酸浓度 /(mol /L) 4 6 8
2. 5. 2 方差分析和回归方程
回归方程各项方差分析表见表 3。由表 3 可以
看出，回归方程所描述的因素与响应值之间的线性
关系显著，其 r = 19. 958020. 3718 = 0. 980，模型水平远远小
于 0. 05，此时回归方差高度显著，回归方程各项的
·767·第 8 期 杨玲引，等:假奓包叶氨基酸提取纯化工艺及其氨基酸组成分析
方差分析结果还可以看出方程的失拟项较小，表明
此方程与实验过程拟合良好，分析误差小，因此，可
利用所得回归方程对实验过程和结果进行分析预
测。各因素对响应值影响的显著性大小顺序为:盐
酸浓度 ＞液料比 ＞水解时间。经 Box-Bennken 实验
拟合得到的回归方程为:
Y = 0． 48 + 0． 029X1 + 0． 017X2 + 0． 037X3 － 9． 750 ×
10 －3X1X2 + 0． 010X1X3 － 0． 013X2X3 － 0． 062X
2
1 －
0. 024X22 － 0． 034X
2
3
表 2 响应面实验方案及响应值
Table 2 Box-Behnken design and data of the response
实验号 X1 X2 X3 响应值
1 － 1 － 1 0 7. 74
2 1 － 1 0 9. 16
3 － 1 1 0 8. 51
4 1 1 0 9. 12
5 － 1 0 － 1 7. 2
6 1 0 － 1 8. 16
7 － 1 0 1 8. 26
8 1 0 1 10. 07
9 0 － 1 － 1 7. 66
10 0 1 － 1 9. 22
11 0 － 1 1 9. 76
12 0 1 1 10. 22
13 0 0 0 10. 47
14 0 0 0 10. 47
15 0 0 0 10. 17
16 0 0 0 10. 63
17 0 0 0 10. 26
2. 5. 3 响应面图分析
各影响因素交互影响对氨基酸提取率的响应面
图见图 6。经比较可知，盐酸浓度对氨基酸提取率
的影响最为显著，表现为对应的曲线较为陡峭，而液
料比和水解时间则对应的曲线较为平滑，对氨基酸
提取率的影响则相对不显著，随条件的变化响应值
变化较小。因此，回归模型所预测的最佳工艺条件
为:X1 = 0. 320，X2 = 0. 575，X3 = 0. 055，经换算得，盐
酸浓度为 6. 11 mol /L，液料比为 21. 6∶1，水解时间为
22. 3 h，在此条件下，氨基酸提取率为 11. 44%。
表 3 方差分析表
Table 3 Analysis of variance
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
模型 19. 95803 9 2. 217558 37. 51534 ＜ 0. 0001 ＊＊
X1 2. 88 1 2. 88 48. 72213 0. 0002 *
X2 0. 945313 1 0. 945313 15. 99224 0. 0052 *
X3 4. 605613 1 4. 605613 77. 91502 ＜ 0. 0001 ＊＊
X1 X2 0. 164025 1 0. 164025 2. 774878 0. 1397
X1 X3 0. 180625 1 0. 180625 3. 055707 0. 1239
X2 X3 0. 3025 1 0. 3025 5. 117516 0. 0581
X12 6. 898526 1 6. 898526 116. 7052 ＜ 0. 0001 ＊＊
X22 1. 000658 1 1. 000658 16. 92854 0. 0045 *
X32 2. 048447 1 2. 048447 34. 65442 0. 0006 *
残差 0. 413775 7 0. 059111
失拟误差 0. 278575 3 0. 092858 2. 747288 0. 1768
纯误差 0. 1352 4 0. 0338
总和 20. 3718 16
注:P值 ＜ 0. 05 为显著，标记为“* ”;P值 ＜ 0. 0001 为高度显著，
标记为“＊＊”。
2. 5. 4 验证实验
为验证响应面法预测的实验结果的可靠性，采
用最佳工艺条件对假奓包叶进行氨基酸提取实验，
考虑到实验条件及实际操作便利，将工艺条件修正
为:盐酸浓度 6. 1 mol /L，液料比为 21. 6∶1，水解时间
22. 3 h，在此条件下进行 3 次验证实验，氨基酸的提
取率分别为 11. 23%、11. 24%、11. 17%，平均提取
率为 11. 21%，与预测值基本相同，重复性良好，说
明响应面法优化结果可靠，可以用来拟合假奓包叶
氨基酸的提取工艺过程。
图 6 各影响因素交互影响对氨基酸提取率的响应面图
Fig． 6 Reciprocal effects of the factors on the extraction ratio
2. 6 氨基酸组成分析
将通过纯化后得到的假奓包叶氨基酸产品，经
氨基酸分析检测仪分析其所含氨基酸的组成和质量
分数，结果见表 4。
·867· 精 细 化 工 FINE CHEMICALS 第 29 卷
表 4 氨基酸产品的分析结果
Table 4 Analysis results of amino acid
序号 名称 质量分数 /%
1 天门冬氨酸 Asp 4. 6706
2 苏氨酸 Thr 2. 0364
3 丝氨酸 Ser 1. 7213
4 谷氨酸 Glu 7. 5939
5 甘氨酸 Gly 3. 0732
6 丙氨酸 Ala 3. 5908
7 缬氨酸 Val 4. 5622
8 蛋氨酸 Met 1. 4348
9 异亮氨酸 Ile 4. 7955
10 亮氨酸 Leu 8. 6381
11 酪氨酸 Tyr 1. 8219
12 苯丙氨酸 Phe 2. 8443
13 赖氨酸 Lys 4. 6501
14 组氨酸 His 1. 2192
15 精氨酸 Arg 0. 6342
16 脯氨酸 Pro 26. 4362
总和 79. 7227
由表 4可以看出，得到的氨基酸产品中氨基酸总
含量较高，质量分数可达 79. 7%，其中脯氨酸(Pro)质
量分数为 26. 44%，占氨基酸总含量的 33. 2%，亮氨
酸(Leu)和谷氨酸的含量也较高，其质量分数分别为
8. 63%和 7. 59%，几种人体必需氨基酸总质量分数在
24%以上，处于较高的水平。因此，此氨基酸产品可
以作为以脯氨酸、亮氨酸、谷氨酸为主要营养素的多
种氨基酸补充食品或药品添加剂。
3 结论
通过响应面实验优化，确定了假奓包叶氨基酸
提取的优化工艺条件为:盐酸浓度为 6. 1 mol /L，液
料比 21. 6∶1，水解时间 22. 3 h，水解温度为 100 ℃，
氨基酸的提取率为 11. 21%。经纯化后氨基酸组成
分析结果表明，假奓包叶氨基酸产品的总氨基酸质
量分数为 79. 7%，其中，脯氨酸质量分数为
26. 44%，亮氨酸、谷氨酸的质量分数分别为 8. 63%
和 7. 59%，人体必需氨基酸质量分数在 24%以上，
假奓包叶氨基酸中含有丰富的氨基酸种类和含量，
可作为以脯氨酸、亮氨酸、谷氨酸为主要营养素的多
种氨基酸补充食品或药品添加剂。
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·967·第 8 期 杨玲引，等:假奓包叶氨基酸提取纯化工艺及其氨基酸组成分析