全 文 ：檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶
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［责任编辑 顾雪竹］
［收稿日期］ 20140617(018)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(81260668)
［第一作者］ 畅静，硕士，Tel:15199167643，E-mail:305217907@ qq． com
［通讯作者］ * 田莉，博士，副教授，硕士生导师，从事中药民族药新制剂研究与开发，Tel:13201333388，E-mail:tianli109@ 126. com
离体外翻肠囊法研究安石榴苷的大鼠肠吸收特性
畅静1，田莉1，2* ，张慧慧1，高晓黎3
(1. 新疆医科大学 中医学院，乌鲁木齐 830011;
2. 新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，乌鲁木齐 830011;
3. 新疆医科大学 药学院，乌鲁木齐 830011)
［摘要］ 目的:考察安石榴苷的肠吸收特性。方法:采用离体外翻肠囊法考察石榴皮多酚中安石榴苷在不同肠段(十二
指肠、空肠、回肠、结肠)、不同质量浓度(153. 34，301. 70 mg·L －1)下、不同时间点(0，30，60，90，120 min)的肠吸收特性，采用
HPLC法［YMC-Triart C18色谱柱(4. 6 mm ×250 mm，5 μm);流动相 甲醇-0. 1%磷酸］测定样品浓度。结果:随着药液中安石榴苷
浓度的上升，肠吸收速率常数(Ka)也随之增加;安石榴苷在各个肠段的吸收无显著性差异，低浓度时，吸收速率常数回肠 ＞结
肠 ＞空肠 ＞十二指肠，高浓度时，空肠 ＞结肠 ＞回肠 ＞十二指肠;各肠段累积吸收量均随药物质量浓度的增加而增加，在高浓度
时，安石榴苷在二十指肠、空肠、回肠结肠的累积吸收量分别为(0. 60 ± 0. 10)，(0. 64 ± 0. 59) ，(0. 71 ± 0. 13) ，(0. 73 ± 0. 11)μg·
cm －2。结论:安石榴苷在大鼠肠道内不存在特殊的“吸收窗”，其吸收符合零级动力学方程。
［关键词］ 安石榴苷;离体外翻肠囊法;肠吸收;高效液相色谱法
［中图分类号］ Ｒ285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2014)24-0122-05
［doi］ 10． 13422 / j． cnki． syfjx． 2014240122
Ｒat Intestine Absorption Characteristics of Punicalagins with Isolated
Everted Intestine Model
CHANG Jing1，TIAN Li1，2* ，ZHANG Hui-hui1，GAO Xiao-li3
(1. College of Traditional Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China;
·221·
第 20 卷第 24 期
2014 年 12 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 24
Dec．，2014
2. Xinjiang Key Laboratory of Famous Prescription and Science of Formula，Urumqi 830011，China;
3. College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China)
［Abstract］ Objective:To study the intestine absorption of punicalagins． Method:The isolated everted
intestine model was used to study the absorption of different drug concentration (153. 34，301. 70 mg·L －1) in
different regions of rat intestine (duodenum，jejunum，ileum and colon)，and different time (0，30，60，90，
120 min)． The sample was determined with HPLC on an YMC-Triart C18 column (4. 6 mm × 250 mm，5 μm)
with methanol-0. 1% phosphoric acid． Ｒesult:The intestine absorption rate constant increased along with the
increase in concentration of punicalagins． Absorption of index components for punicalagins in different intestinal
segments had no significant difference，at low concentration，the absorption rate constant is ileum ＞ colon ＞
jejunum ＞ duodenum，at high concentration，jejunum ＞ colon ＞ ileum ＞ duodenum;every intestine segments
cunmlative absorption increased along with concentration of punicalagins，at high concentration，every intestine
segments cunmlative absorption of punicalagins is (0. 60 ± 0. 10)，(0. 64 ± 0. 59) ，(0. 71 ± 0. 13) ，(0. 73 ±
0. 11)μg·cm －2 ． Conclusion:Absorption of punicalagins didnt be a special‘absorption window’，punicalagins
intestinal absorption followed the Zero-order kinetic equation．
［Key words］ punicalagins;isolated evened gut model;intestine absorption;HPLC
口服给药是临床最常见的给药途径，其主要吸
收部位在小肠。一种药物的口服生物利用度除了本
身理化性质的影响外，还取决于肠黏膜的构造及肠
内酶的屏障作用。因此，研究药物在肠内的吸收机
制和吸收部位，是口服药物研发的必要部分。
安石榴苷是新疆石榴皮多酚中的主要成分，具
有抗氧化、抗衰老、抗癌防癌、抗菌、润肤美容、降血
压和预防心脑血管疾病的生理活性［1-2］。本课题组
体外 MTT法结果表明，新疆石榴皮多酚精制物对
MCF-7(人乳腺癌细胞)，BEL-7404(人肝癌细胞)，
PC-3(人前列腺癌细胞)，Caco-2(人结肠癌细胞)，
A375(黑色素瘤细胞)，Hela(宫颈癌细胞)等 6 种
人源性肿瘤细胞的生长增殖均有不同程度的抑制作
用，且抑制率随时间延长而提高［3］。
安石榴苷分为安石榴苷 A和 B(α和 β异构体)，
是含有配糖基的鞣花酸多聚体，水溶性好，化学名为
2，3-(S)-六羟基联苯二甲酰基-4，6-(S，S)-并没食子
酸连二没食子酰-D-葡萄糖，分子式 C48H28O30，相对分
子质量 1 084. 72。鉴于安石榴苷吸收差，对其体内吸
收机制的相关文献及数据几乎空白，要确证抗肿瘤的
有效成分是原形药物还是代谢产物，以及如何提高多
酚类化合物的口服吸收率和临床疗效，就有必要弄清
其主要成分的吸收特性及其与药物效应间的关系，为
口服抗肿瘤的新药设计提供实验依据。本实验拟采
用离体外翻肠囊吸收模型研究大鼠对安石榴苷的肠
吸收特性，以了解其吸收机制和吸收部位，对确定药
物的剂型、指导临床合理用药具有重要意义，也有利
于提高石榴皮多酚的生物利用度，更好的发挥疗效。
1 材料
1. 1 仪器 高效液相色谱仪 LC-6AD，CBM-20A 色
谱工作站，SPD-20A 型紫外检测器，SIL-20A 型自动
进样器，CTO-10ASvp 型柱温箱(日本岛津公司)，
DKZ系列恒温振荡浴槽(上海恒科学仪器有限公
司)，XS105 型电子天平(德国，梅特勒-托利多)，
TDL-40B高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。
1. 2 药品与试剂 安石榴苷对照品(成都曼思特
生物科技有限公司，批号 MUST-13010903，HPLC≥
98%)，安石榴苷原料药(成都曼思特生物科技有限
公司，批号 MUST-13052405，HPLC≥98%)，屈臣氏
蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司北京饮料分
公司，批号 20140409)。甲醇为色谱纯，其他试剂均
为国产分析纯。
1. 3 动物 Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌性，体重
(200 ± 10)g，由新疆医科大学动物实验中心提供，
合格证号 SCXK(新)2011-0004。
2 方法与结果
2. 1 含量测定
2. 1. 1 色谱条件与系统适用性 YMC-Triart C18色
谱柱(4. 6 mm × 250 mm，5 μm);流动相甲醇(A
相)-0. 1%磷酸(B 相)梯度洗脱;梯度洗脱程序:
0 ～ 10 min，0. 1%磷酸 95 ～ 85;10 ～ 20 min，0. 1%磷
酸 85 ～ 70;20 ～ 30 min，0. 1% 磷酸 70 ～ 95;柱温
30 ℃;检测波长 370 nm;流速 1 mL·min －1;进样量
10 μL。理论塔板数按安石榴苷的 α-苷和 β-苷峰面
·321·
畅静，等:离体外翻肠囊法研究安石榴苷的大鼠肠吸收特性
积总和计算不低于 2 000。
2. 1. 2 安石榴苷药液的配制 用屈臣氏蒸馏水配
制 Krebs-Ｒingers 肠营养液，使其每 1 L 含 NaCI
7. 8 g，KCl 0. 35 g，NaH2PO4 0. 32 g，NaHCO3 1. 37 g，
葡萄糖 1. 4 g(葡萄糖在临用前添加)。精密称取安
石榴苷原料药适量，共 2 份，分别用 Krebs-Ｒinger’s
肠营养液超声溶解，得到质量浓度分别为 153. 34，
301. 70 mg·L －1的安石榴苷药液。
2. 1. 3 对照品溶液的制备 精称安石榴苷对照品
适量，用甲醇溶解，Krebs-Ｒinger’s液定容至刻度，制
成 883 mg·L －1的安石榴苷对照品溶液。
2. 1. 4 方法学考察
2. 1. 4. 1 专属性考察 分别对空白肠营养液、空白
肠营养液 +对照品液、离体肠吸收样品、对照品液进
样 10 μL，见图 1。安石榴苷对照液与安石榴苷肠营
养液特征峰保留时间一致，空白肠营养液在此保留
时间无干扰，证明此方法可行。
A. 空白肠营养液;B. 空白肠营养液 +对照品液;
C. 离体肠吸收样品;D. 对照品液;1. α-苷;2. β-苷
图 1 大鼠离体外翻肠囊法安石榴苷的 HPLC
2. 1. 4. 2 标准曲线的制备 精密吸取上述安石榴
苷对照品各 0. 1，1，2，4，6，8，10，14 μL，按 2. 1. 1 项
色谱条件进样，记录峰面积。以峰面积(A)对进样
量(X，μg)进行回归，得回归方程 A = 401 037 X －
15 487(Ｒ2 = 0. 999 3)，结果表明安石榴苷进样量在
0. 088 3 ～ 12. 362 μg呈良好的线性关系。
2. 1. 4. 3 精密度与稳定性试验 将配制好的安石
榴苷对照品溶液按 2. 1. 1 项色谱条件重复进样 5
次，每次 10 μL，记录峰面积，计算精密度峰面积
ＲSD 1. 1%，说明仪器精密度良好。取十二指肠于
15 min时的离体肠外翻样品，于 0，30，60，90，20 min
分别进样 10 μL，记录峰面积。ＲSD 3. 7%，结果表
明样品在 2 h内基本稳定。
2. 1. 4. 4 回收率试验 取安石榴苷对照品液用
Krebs-Ｒinger’s 肠营养液配制高、中、低(180，84，
61 mg·L －1)3 个质量浓度溶液，按 2. 1. 1 项下色谱
条件，分别进样 3 次，记录峰面积，计算高、中、低浓
度的安石榴苷对照液的回收率分别为 97. 43%，
100. 56%，109. 77%，平均回收率为 102. 59%，ＲSD
5. 1%。符合测定要求。
2. 2 离体外翻肠囊法试验［4］ 大鼠随机分为 2 个
剂量组，每组 4 只，实验前 15 h 禁食，自由饮水。
10%水合氯醛腹腔麻醉(3 mL·kg －1)，待大鼠失去
知觉后打开腹腔，分别迅速取出约 10 cm 长的十二
指肠、空肠、回肠、结肠(十二指肠段从幽门开始，空肠
段离幽门 15 cm处开始，回肠段自盲肠上行 20 cm开
始，结肠段从盲肠后端开始，长度以试验结束后的实
测值为准)。小心将大鼠肠管同肠系膜剥离，放入 37
℃ Krebs-Ｒinger’s 溶液中，冲洗，直到没有内容物流
出，小心剥离肠段表面肠系膜和脂肪。冲洗干净后翻
转，用手术线分别将翻转后的各肠段结扎成 10 cm长
的小囊，每个小囊中加入 2 mL 空白 Krebs-Ｒinger’s
肠营养液。平衡 5 min 后，将翻转小肠囊分别放入
4 个 装 有 8 mL 安 石 榴 苷 质 量 浓 度 分 别 为
153. 34，301. 70 mg·L － 1的含药 Krebs-Ｒinger’s肠
营养液且维持 37 ℃恒温水浴的玻璃试管中，恒
流泵通空气以保持离体肠管活性。试验结束后
处死大鼠，剪下被考察的肠段，测量其长度(L)和
内径(r)。
分别在 0，30，60，90，120 min 时间点，用针管分
别吸取各个肠囊中内液 0. 2 mL 置于 0. 5 mL 的 Ep
管内作为样品，并加入等体积、新鲜且 37 ℃恒温的
Krebs-Ｒinger’s肠营养液，继续试验。每个浓度各进
行 4 次实验。离体肠外翻样品在 4 ℃ 条件下
13 000 r·min －1。离心 20 min，取上清液约 150 μL置
·421·
第 20 卷第 24 期
2014 年 12 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 24
Dec．，2014
样品瓶内插管中，进样 10 μL，记录峰面积。
2. 3 不同肠段指标成分的吸收状况 根据式 1 计
算不同质量浓度下安石榴苷在各时间点的单位肠管
面积累积吸收量 Q(μg·cm －2):
Q =
Cn × 2 +∑
n － 1
i = 1
Ci × 0. 2
A (1)
Cn，第 n个取样点测得的药物浓度;Ci，第 i 个
取样点测得的药物浓度;A，离体肠管面积;Q，单位
面积累积吸收量。
以 Q(μg·cm －2)时间(h)作图进行零级、一级、
Higuchi方程拟合，以决定系数为拟合优劣的判断标
准。见表 1。通过 3 种不同动力学方程模拟，得到
相关系数 Ｒ2 值。根据 Ｒ2 值可知，零级动力学方程
拟合度相对而言优于一级方程和 Higuchi 方程。安
石榴苷肠吸收符合零级动力学方程。斜率即为单位
面积单位时间内的肠吸收速率(Ka)。
表 1 安石榴苷在各拟合方程中的吸收速率常数(Ka，珋x ± s，n = 4)
肠段
安石榴苷
/mg·L －1
Ka /mg·h －1·cm －2
零级方程 Ｒ2 一级方程 Ｒ2 Higuchi方程 Ｒ2
十二指肠 153. 34 0. 055 ± 0. 030 0. 864 0 0. 109 ± 0. 068 0. 855 3 0. 113 ± 0. 061 0. 797 5
301. 70 0. 136 ± 0. 043 0. 841 6 0. 286 ± 0. 156 0. 772 5 0. 275 ± 0. 087 0. 767 3
空肠 153. 34 0. 075 ± 0. 020 0. 887 1 0. 114 ± 0. 033 0. 877 5 0. 154 ± 0. 041 0. 840 3
301. 70 0. 220 ± 0. 335 0. 949 3 0. 035 ± 0. 004 0. 960 2 0. 452 ± 0. 687 0. 922 8
回肠 153. 34 0. 134 ± 0. 070 0. 802 1 0. 244 ± 0. 155 0. 783 7 0. 270 ± 0. 138 0. 732 6
301. 70 0. 163 ± 0. 032 0. 796 1 0. 467 ± 0. 182 0. 754 4 0. 332 ± 0. 067 0. 732 4
结肠 153. 34 0. 092 ± 0. 079 0. 806 1 0. 168 ± 0. 177 0. 803 2 0. 184 ± 0. 154 0. 765 8
301. 70 0. 213 ± 0. 067 0. 739 9 0. 585 ± 0. 306 0. 701 1 0. 427 ± 0. 134 0. 659 3
2. 4 不同肠段的吸收速率比较 以零级动力学方
程吸收速率 Ka 为准，比较不同浓度各肠段吸收速
率，见表 2。对吸收速率常数 Ka 值各肠段之间进行
组间比较，不同质量浓度均无显著性差异。低浓度
时，吸收速率常数回肠 ＞结肠 ＞空肠 ＞十二指肠，高
浓度时，空肠 ＞结肠 ＞回肠 ＞十二指肠。
表 2 安石榴苷不同质量浓度下各肠段在零级动力学方程的 Ka(珋x ± s，n = 4)
安石榴苷
/mg·L －1
Ka /mg·h －1·cm －2
十二指肠 空肠 回肠 结肠
153. 34 0. 055 ± 0. 030 0. 075 ± 0. 020 0. 134 ± 0. 070 0. 092 ± 0. 079
301. 70 0. 136 ± 0. 043 0. 220 ± 0. 335 0. 163 ± 0. 032 0. 213 ± 0. 067
2. 5 安石榴苷肠吸收程度的判断 以取样终点
(即 2 h时)肠囊内安石榴苷的质量浓度与肠囊外初
始质量浓度比值可粗略判断安石榴苷的吸收程度。
在 2 h时测定的各个肠段样品质量浓度与初始浓度
的比值均 ＜ 10%，表明各个肠段对安石榴苷的吸收
并不理想。分别对不同肠段进行比较，相对于其他
肠段，回肠吸收程度相对较好，十二指肠吸收较差。
见表 3。
表 3 取样终点时样品质量浓度与初始质量浓度比值(珋x ± s，n = 4)
安石榴苷
/mg·L －1
质量浓度比 /%
十二指肠 空肠 回肠 结肠
153. 34 3. 335 ± 0. 008 5. 684 ± 0. 013 7. 987 ± 0. 017 6. 954 ± 0. 035
301. 70 4. 034 ± 0. 005 4. 296 ± 0. 038 4. 790 ± 0. 005 5. 332 ± 0. 011
分别对不同浓度下各个肠段的累计吸收量(表
4)作随机区组方差分析，以 P ＜ 0. 05 为差异性判断
标准。结果表明，在同一浓度条件下统计结果表明
各个肠段的累计吸收量均无显著性差异，说明安石
榴苷在小肠内不存在特殊“吸收窗”。随着药液浓
度的增加，肠吸收速率常数亦随之增加。
·521·
畅静，等:离体外翻肠囊法研究安石榴苷的大鼠肠吸收特性
表 4 安石榴苷不同质量浓度下各肠段不同时间点单位面积累积吸收量(Q，珋x ± s，n = 4)
肠段
安石榴苷
/mg·L －1
Q /μg·cm －2
30 min 60 min 90 min 120 min
十二指肠 153. 34 0. 434 ± 0. 071 0. 442 ± 0. 070 0. 468 ± 0. 074 0. 517 ± 0. 078
301. 70 0. 395 ± 0. 063 0. 407 ± 0. 060 0. 465 ± 0. 085 0. 602 ± 0. 102
空肠 153. 34 0. 278 ± 0. 024 0. 299 ± 0. 027 0. 327 ± 0. 016 0. 393 ± 0. 040
301. 70 0. 326 ± 0. 155 0. 348 ± 0. 174 0. 498 ± 0. 380 0. 643 ± 0. 587
回肠 153. 34 0. 280 ± 0. 021 0. 299 ± 0. 023 0. 326 ± 0. 030 0. 495 ± 0. 123
301. 70 0. 450 ± 0. 118 0. 491 ± 0. 142 0. 518 ± 0. 159 0. 713 ± 0. 130
结肠 153. 34 0. 255 ± 0. 031 0. 271 ± 0. 024 0. 278 ± 0. 023 0. 406 ± 0. 149
301. 70 0. 388 ± 0. 026 0. 405 ± 0. 027 0. 446 ± 0. 044 0. 730 ± 0. 114
3 讨论
口服药物需要在体内吸收后才能发挥药效，胃
肠道是吸收的主要场所，药物能否通过胃肠道的理
化屏障和生化屏障取决于药物的理化性质(如分子
大小、极性、亲脂性及剂型等)和胃肠道的外排系统
(如 P-糖蛋白等)对药物的处置。离体外翻肠囊法
在药物吸收及肠壁转运机制等方面得到了广泛应
用，具有操作简便、快速、重复性好等优点。本实验
发现，随着时间的增长，肠囊活性逐渐降低导致其膜
通透性增加，透过肠壁的药液量也随之增加。故因
把实验时间控制在 2 h 以内，以确定肠囊的生理
活性。
实验结果表明，同一肠段的安石榴苷药液浓度
越大，其吸收速率越大，随着时间的增加，通过肠壁
的安石榴苷的量也越多，并且在 2 h 内无吸收饱和
现象，故推断其肠吸收方式可能为被动扩散。根据
对各个肠段取样终点(2 h)时累计吸收量进行分析，
安石榴苷在同一浓度下各个肠段的累计吸收量均无
统计学差异，即安石榴苷在大鼠肠道内不存在特殊
“吸收窗”。
总体来看，安石榴苷在大鼠肠道内均有吸收，在
肠道中可能是通过被动转运进入体内的，但整体吸
收效果较差，可能与安石榴苷的分子量大，结构较
大，进入体内后不易被吸收入血［5］、极性或者肠道
P-gp的底物有关。有必要在采用 P-gp 抑制剂抑制
肠道药物外排作用实验来加以验证。下一步将采用
在体肠灌流法进一步研究其肠吸收特性，为其剂型
的选择提供参考依据。
本文对于安石榴苷色谱条件的选择，由于对照
品在 258 nm 和 370 nm均有紫外吸收，但因为在此
梯度洗脱条件下，样品峰在 258 nm处出现杂质峰干
扰，故选择 370 nm为检测波长。安石榴苷的一对同
分异构体(α，β)呈现双峰，反相 HPLC 在判断此类
异构体方面有独到之处，故本实验采用 C18反相硅胶
柱进行色谱分析。
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［责任编辑 聂淑琴］
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第 20 卷第 24 期
2014 年 12 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 24
Dec．，2014