全 文 ：Science and Technology of Food Industry 研究与探讨
2014年第22期
安石榴苷的纯化及对金黄色葡萄球菌
抑菌作用的研究
徐云凤，李光辉，封雨晴，吕晓英，吴 倩，夏效东*
（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌 712100）
摘 要：采用超声波辅助法从石榴皮中提取单宁类物质，并用Amberlite XAD-16大孔吸附树脂进行柱层析，以甲醇梯
度洗脱法进行纯化，经高效液相色谱对其组分进行分析后，以安石榴苷含量最高的组分对金黄色葡萄球菌进行抑菌
实验，分别测得抑菌圈直径和最小抑菌浓度，并检测了安石榴苷对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响。液相结果表明，
随着洗脱剂浓度的升高，安石榴苷的含量呈现先升高后降低的趋势，最高含量达79.6%；抑菌结果表明，安石榴苷纯
化物对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌效果，最小抑菌浓度为0.1mg/mL，安石榴苷纯化物以剂量依赖的形式抑制金黄
色葡萄球菌的生长。
关键词：石榴皮，安石榴苷，纯化，高效液相色谱，抑菌作用
Purification of punicalagin and its antibacterial activity against
Staphylococcus aureus
XU Yun-feng，LI Guang-hui，FENG Yu-qing，LV Xiao-ying，WU Qian，XIA Xiao-dong*
（College of Food Science and Engineering，Northwest A&F University，Yangling 712100，China）
Abstract：Pomegranate peel tannins were extracted by ultrasonic-assisted extraction and purified by Amberlite
XAD -16 macroporous resin. Gradient methanol was used as elution solution. Then the components were
determined by high performance liquid chromatography（HPLC） analysis. The eluate with the highest content of
punicalagin was used for the antimicrobial asssays. Inhibition zone diameters and the minimal inhibitory
concentration （MIC） were investigated. The effect of punicalagin on the growth of Staphylococcus aureus was
also monitored. HPLC showed that the purity of the eluate increased at first then decreased with the increasing
concentration of ethanol. The highest purity among the different eluates was 79.6% . Antimicrobial study
demonstrated that punicalagin exhibited good inhibitory effects against Staphylococcus aureus，the MIC was
determined as 0.1mg/mL. Punicalagin inhibited the growth of Staphylococcus aureus in a dose-dependent
manner.
Key words：pomegranate peel；punicalagin；purification；HPLC；antimicrobial activity
中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2014）22-0110-04
doi：10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.016
收稿日期：2014－02－17
作者简介：徐云凤（1989-），女，博士，主要从事天然植物提取物抑菌
方面的研究。
* 通讯作者：夏效东（1981-），男，教授，主要从事食品安全及营养方
面的教学与研究。
基金项目：国家自然科学基金（项目批准号31101347）。
石榴（Punica granatum L．）是一种药食两用的植
物资源，不仅营养丰富，而且具有多种医疗保健功
效[1]。石榴皮为石榴加工产业的副产物，因其富含多
酚类物质，在食品、医药等领域显示出了极大的应用
价值[2-4]。在传统中药中，石榴皮被广泛用于治疗多种
感染类疾病，如痢疾、腹泻、寄生虫感染以及呼吸系
统感染等[5]。目前的体外研究表明，石榴皮中的鞣质
因其能凝固微生物体内的原生质及对多种酶的影
响，对多种细菌、真菌有抑制作用[6]。安石榴苷是石榴
皮鞣质类成分的主体，约占石榴皮的10%[7]，其含量
远远高于鞣花酸等其他鞣质成分，并且同鞣花酸相
比，安石榴苷具有较好的水溶性，因而近年来引起了
人们广泛的注意。Eliana等[8]研究表明，石榴皮抑制两
种念珠菌属的活性成分为安石榴苷。Ira Glazer等[9]则
报道了石榴皮水提物可以显著抑制腐败真菌的生
长，其抗菌活性与石榴总多酚的含量相关，安石榴苷
为其主要的抗菌鞣质类活性成分。
植物多酚的分离纯化方法包括层析法、有机溶剂
萃取法、膜分离法、沉淀分离法等，以大孔吸附树脂
为填料的柱层析法是常用的方法之一[10]。大孔树脂
具有选择性强、吸附容量大、吸附速度快、解吸容易、
成本低等优点，在天然产物分离纯化中呈良好的发
展趋势[11]。因此，本研究采用大孔吸附树脂纯化的方
110
研究与探讨
2014年第22期
Vol . 35 , No . 22 , 2014
15 20 25 30 35 40 50 60 100
安石榴苷质量分数（%） 4.4 3.8 11.5 28.6 62.3 79.6 57.0 28.0 6.4
甲醇浓度（%）
表1 不同组分的纯化物中安石榴苷的含量
Table 1 The content of punicalagin from different compotents
法对石榴皮丙酮提取物进行纯化，并采用高效液相
色谱法进行检测，以期得到较高纯度的安石榴苷，随
后研究了安石榴苷纯化物对金黄色葡萄球菌的体外
抑菌作用，为石榴皮功能成分的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
石榴 产自陕西省西安市临潼区的峄城，洗净，
手工取皮，将皮置于50℃下烘干，粉碎后过60目筛，
粉末置于棕色瓶中，于4℃冰箱中保存；供试菌株 金
黄色葡萄球菌ATCC 25923；安石榴苷（纯度98%，
CAS编号65995-63-3） 成都曼思特生物科技有限
公司；磷酸（优级纯） 天津市科密欧化学试剂有限公
司；乙腈（色谱纯） 美国TEDIA公司；Amberlite XAD-
16大孔吸附树脂 美国SIGMA公司；LB琼脂、LB肉
汤 北京陆桥技术有限责任公司；其他试剂 分析纯。
高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；
DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验
仪器有限公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆
山市超声仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发器 上
海亚荣生化仪器厂；LGJ型冷冻干燥机 北京亚泰科
隆仪器技术有限公司；AL204型电子天平 上海梅特
勒-托利多仪器有限公司；Waters 600E高效液相色谱
仪 美国WATERS公司；牛津杯（外直径8mm、内直
径6mm、高度10mm） 北京先驱威锋技术开发公司；
细菌培养箱 上海福玛实验设备有限公司；紫外分
光光度计、酶标仪 美国BIO-RAD公司。
1.2 实验方法
1.2.1 石榴皮单宁的提取 用60%的丙酮作为提取
溶剂，在40℃下，采用超声波辅助法进行提取，超声
时间为10min，超声功率80W，料液比为1∶10。提取完
毕，用真空泵抽滤，使滤液与滤渣分离，将滤渣在相
同条件下进行二次提取，合并提取液，将提取液于
50℃下旋转蒸发至无丙酮味，得到浓缩液。
1.2.2 安石榴苷的纯化 大孔吸附树脂的预处理参
照朱静等[12]的方法。纯化方法为采用湿法装柱（柱长
径比为6∶1），上样量为200mL浓缩液/500g树脂，然后
用大量水洗脱去糖（约4L），直到流出液澄清为止，接
下来用不同浓度的甲醇进行梯度洗脱，甲醇浓度依次
为15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、100%，
每个浓度各800mL，最后又用另外800mL纯甲醇将柱
子彻底洗脱干净，分别收集洗脱液，于50℃旋转蒸发，
再进行真空冷冻干燥，得到浅棕色粉末状的纯化物[13]。
1.2.3 液相色谱分析
1.2.3.1 标准样品及待测样品溶液的配制 分别准
确称取安石榴苷标准品及待测样品0.005g，用水溶
解，并用容量瓶定容至10mL，配制成0.5mg/mL的储备
液，-20℃保存。上样前用0.45μm滤膜过滤。
1.2.3.2 色谱条件和洗脱程序 色谱柱为Waters C18
柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温30℃，紫外检测器，波
长378nm，流动相为0.1%的磷酸水溶液（A液）和0.1%
的磷酸乙腈溶液（B液），线性梯度洗脱，流速为
1.0mL/min，进样量10μL。梯度洗脱程序：0~10min 5%
~40% B，10~20min 40%~55% B，20~25min 55%~
60% B，25~30min 60%~90% B，30~35min 90%~5%
B，35~45min 5% B。
1.2.4 抑菌效果研究
1.2.4.1 菌悬液的制备 将细菌从-80℃冰箱取出
后，划线接种于LB琼脂培养基上，使之活化，再用
无菌棉签将细菌抹下，涮至无菌生理盐水中，将菌
悬液吸光度调至OD600等于0.5，稀释100倍（约含菌
106CFU/mL），备用。
1.2.4.2 抑菌活性测定 抑菌活性采用牛津杯法测
定[14]。取100μL上述菌悬液，涂布于LB琼脂平板上，用
无菌镊子取经高压蒸汽灭菌的牛津杯，平置于已涂布
菌液的培养皿表面，轻轻按压，每个培养皿放置3只
牛津杯，分别注入200μL质量浓度分别为4、2、1mg/mL
的安石榴苷纯化物溶液，每个浓度做3个平行实验，置
于37℃恒温箱内培养24h后，测量抑菌圈直径大小。
1.2.4.3 最小抑菌浓度实验 采用琼脂稀释法，向灭
菌后冷却至50℃的LB培养基中加入安石榴苷纯化
物，使其终浓度分别为4、2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、
0.05、0.025、0.0125mg/mL，各倒入两个培养皿中做平
行实验。待冷却凝固后，分别在琼脂表面滴加2μL上
述菌悬液，每个平板上滴加三滴，待干燥后将平板置
于37℃恒温培养箱中倒置培养24h，观察细菌生长情
况。以不加安石榴苷纯化物的平板为阳性对照，确定
无菌生长的最低稀释浓度为最小抑菌浓度。
1.2.4.4 生长曲线的测定 将安石榴苷纯化物溶于
无菌的LB肉汤中，配成0.2mg/mL的溶液，采用对半稀
释法稀释得到0.1、0.05、0.025mg/mL的溶液。将细菌
接种于LB肉汤中，培养至OD600约等于0.2，实验组往
96孔板中分别加入100μL不同浓度的纯化物溶液和
100μL菌悬液，对照组加入100μL不同浓度的纯化物
溶液和100μL无菌LB肉汤，分别做三个平行，每隔一
小时用酶标仪测定600nm下的吸光度，实验结果以实
验组吸光度减去对照组吸光度表示。
2 结果与分析
2.1 液相色谱检测安石榴苷的含量
图1说明，在1.2.3所指定的色谱条件下，样品基
本达到了基线分离，效果良好。其中，α和β为安石榴
苷的两个同分异构体。
根据保留时间进行定性，根据不同组分的峰面积
与标准品（已知浓度）的峰面积的比值进行定量，结果
如表1所示。可以看出，安石榴苷α、β同分异构体的质
量分数合计最高可达79.6%；最高纯度的安石榴苷（组
分6）是采用40%的甲醇洗脱下来的；随着洗脱剂浓度
111
Science and Technology of Food Industry 研究与探讨
2014年第22期
600.00
400.00
200.00
0.00
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
M
V
图1 安石榴苷标准品（a）及石榴皮纯化物（b~k）的液相色谱图
Fig.1 Chromatograms of punicalagin（a）and purified
pomegranate peel extracts（b~k）
注：纯化物色谱图（b~k）与甲醇浓度的对应关系如下，
b：15%，c：20%，d：25%，e：30%，f：35%，g：40%，h：50%，i：60%，
j：100%，k：第二次100%。
a
时间（min）
α
β
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
M
V
b
时间（min）
α
β
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
M
V
c
时间（min）
α
β
120.00
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
M
V
d
时间（min）
α
β
300.00
200.00
100.00
0.00
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
M
V
e
时间（min）
α
β
800.00
600.00
400.00
200.00
0.00
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
M
V
f
时间（min）
α
β
1000.00
800.00
600.00
400.00
200.00
0.00
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
M
V
g
时间（min）
α
β
600.00
400.00
200.00
0.00
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
M
V
h
时间（min）
α
β
200.00
100.00
0.00
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
M
V
i
时间（min）
α
β
60.00
40.00
20.00
0.00
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
M
V
j
时间（min）
α
β
100.00
50.00
0.00
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
M
V
k
时间（min）
αβ
的升高，安石榴苷的含量呈现先升高后降低的趋势。
2.2 抑菌效果
2.2.1 抑菌圈直径 据图2所示，安石榴苷纯化物
（组分6）对金黄色葡萄球菌可以产生明显的抑菌圈，
表明安石榴苷具有良好的抑菌效果。从表2可以看
出，抑菌圈直径大小与纯化物浓度成正相关，4mg/mL
浓度下的抑菌圈直径达20.2mm。
2.2.2 最小抑菌浓度 通过琼脂稀释法，测得安石
榴苷纯化物浓度在0.1mg/mL时，无细菌生长，即最小
抑菌浓度为0.1mg/mL。
2.2.3 生长曲线 纯化物对细菌生长的影响如图3
所示。从图3中可以看出，对照组的金黄色葡萄球菌
转接后迅速进入对数生长期，5~12h达到稳定期，而
加入安石榴苷纯化物后，金黄色葡萄球菌的生长受
到抑制，菌体数目虽有增加，但并没有达到正常的生
长高峰，之后趋于稳定。安石榴苷以剂量依赖的的形
式抑制金黄色葡萄球菌的生长，0.1mg/mL下抑制作
用明显，0.0125mg/mL下几乎没有影响。
3 讨论
3.1 Amberlite XAD-16是一种非离子型多聚吸附树
图2 不同浓度纯化物下的抑菌圈直径
Fig.2 Inhibition zone diameter by different concentrations of
purified extracts
注：A为4mg/mL，B为2mg/mL，C为1mg/mL。
AB
C
浓度（mg/mL）
直径（mm） 20.2±0.8 17.2±1.0 13.3±0.6
4 2 1
表2 抑菌圈直径大小
Table 2 The size of inhibition zone diameter
0.36
0.32
0.28
0.24
0.20
0.16
0.12
0.08
0.04
0.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
OD
60
0
图3 不同浓度的纯化物对细菌生长曲线的影响
Fig.3 Growth curves with different concentrations of
purified extracts
时间（h）
0.1
0.05
0.025
0.0125
CK
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研究与探讨
2014年第22期
Vol . 35 , No . 22 , 2014
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纯化物浓度
（mg/mL）
细菌生长情况 - - - - - - - - + ++ ++ ++
4 2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0.1 0.05 0.025 0.0125 CK
表3 纯化物的抑菌效果
Table 3 Antibacterial effects of purified extract
注：“－”表示无细菌生长，“＋”表示有较少细菌生长，“++”表示有较多细菌生长。
脂，可用于吸附极性溶剂中的疏水分子，国内外均有
采用Amberlite XAD-16纯化石榴皮多酚的报道[12-13，15]，
本研究选择了XAD-16大孔吸附树脂对安石榴苷进
行纯化，以甲醇为洗脱剂，采用梯度洗脱的方法，取
得了良好的纯化效果。
3.2 安石榴苷纯化物对金黄色葡萄球菌具有良好
的抑菌效果。Al-Zoreky等[16]曾报道石榴皮甲醇提取
物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2mg/mL；
Braga等 [17]则报道了1%（v/v）的石榴皮提取物可完全
抑制金黄色葡萄球菌在肉汤的生长。然而，由于提取
物中酚类物质含量不同，所用受试菌株有差异以及
采用的抑菌方法有区别等，导致不同研究者之间的
实验结果很难进行直接对比。
4 结论
采用Amberlite XAD-16大孔吸附树脂进行梯度
洗脱纯化，可以获得较高纯度的安石榴苷，最高含量
达79.6%；安石榴苷纯化物对金黄色葡萄球菌具有良
好的抑菌效果，最小抑菌浓度为0.1mg/mL，并且安石
榴苷纯化物以剂量依赖的形式抑制金黄色葡萄球菌
的生长。本研究为安石榴苷应用于天然药抑菌剂、食
品防腐剂等提供理论和实验基础。随着石榴中活性
成分研究的不断深入，石榴的开发利用前景将会越
来越广阔。
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