全 文 ：第 32 卷 第 3 期
2013 年 3 月
分析测试学报
FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis)
Vol. 32 No. 3
367 ～ 371
收稿日期:2012 － 11 － 07;修回日期:2012 － 12 － 03
* 通讯作者:曹玉华，博士，教授，研究方向:天然产物活性成分分析及分离技术，Tel:13382888922，E － mail:yuhuacao@ ya-
hoo. com. cn
毛细管电泳法测定石榴皮中鞣花酸与安石榴苷含量
纪白慧，杨笑笑，倪鑫炯，曹玉华*
(江南大学 化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122)
摘 要:建立了毛细管电泳紫外检测法测定石榴皮中鞣花酸和安石榴苷含量的方法，并对不同产地石榴中的
石榴皮鞣花酸和安石榴苷含量进行测定。研究了运行缓冲液 pH值和浓度、运行电压等对电泳的影响，得到
最优化的测定条件为:50 mmol /L的硼砂 －硼酸缓冲液(pH 8. 7)，分离电压 20 kV，电动进样 9 s /20 kV。在
最优条件下，检测波长 260 nm，上述两种组分可在 12 min 内完全分离。结果显示，鞣花酸和安石榴苷的线
性范围分别为 5. 0 × 10 －7～ 5. 0 × 10 －5 g /mL和 2. 0 × 10 －6～ 5. 0 × 10 －5 g /mL，检出限分别为 1. 0 × 10 －7 g /mL和
1. 3 × 10 －6 g /mL，峰面积的相对标准偏差(RSD，n = 7)分别为 2. 4%和 2. 2%，平均回收率分别为 101%和
98%。采用高效液相色谱法进行比对，t-检验表明两组数据无显著性差异。该法简便、快速、准确，已成功
应用于实际样品的测定。
关键词:毛细管电泳;石榴皮;鞣花酸;安石榴苷
中图分类号:O657. 8;TQ460. 72 文献标识码:A 文章编号:1004 － 4957(2013)03 － 0367 － 05
doi:10. 3969 / j. issn. 1004 － 4957. 2013. 03. 018
Determination of Ellagic Acid and Punicalagin in Pomegranate Peel
by Capillary Electrophoresis
JI Bai-hui，YANG Xiao-xiao，NI Xin-jiong，CAO Yu-hua*
(School of Chemical and Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
Abstract:A capillary electrophoresis(CE)with UV detection method was developed for the determi-
nation of ellagic acid and punicalagin in pomegranate peel，grown in different origins． Effects of
some important factors，such as pH value，concentration of running buffer，separation voltage and
injection time were investigated． The optimum conditions were as the follows:running buffer:50
mmol /L borax buffer(pH 8. 7)，separation voltage:20 kV，injection time:9 s /20 kV． Under the
optimum conditions，two analytes could be separated within 12 min at the detection wavelength of 260
nm． The good linearities between peak area and mass concentration were obtained in the ranges of
5. 0 × 10 －7 － 5. 0 × 10 －5 g /mL and 2. 0 × 10 －6 － 5. 0 × 10 －5 g /mL for ellagic acid and punicalagin，
with their detection limits of 1. 0 × 10 －7g /mL and 1. 3 × 10 －6g /mL，respectively． The relative stand-
ard deviations(RSD，n = 7) for the peak areas of ellagic acid and punicalagin were 2. 4% and
2. 2%，respectively． The average recoveries were 101% for ellagic acid and 98% for punicalagin．
It is found by t-test that there were no significant differences between this method and the HPLC meth-
od． The proposed method was simple，rapid and accurate，and was successfully applied in the de-
termination of the analytes in pomegranate peel samples．
Key words:capillary electrophoresis;pomegranate peel;ellagic acid;punicalagin
石榴(Punica granatum L．)为石榴科石榴属植物，在我国已有两千多年的历史。经过长年的培育和
优选，目前在我国已形成了陕西临潼、安徽怀远、四川会理、云南蒙自等较有影响力的种植地区。石
榴皮含有丰富的鞣质类物质，包括鞣花酸、没食子酸、安石榴苷、安石榴林等，占干重量的 10% ～
20%，是石榴皮的重要组成成分［1］。中国药典规定干燥石榴皮中所含鞣质不得低于 10. 0%［2］。石榴皮
鞣质成分是影响石榴皮及其提取物质量的主要因素，大量现代药理研究表明石榴皮鞣质可有效预防和
治疗心脑血管疾病［3］，在治疗肿瘤、神经退化、DNA损伤等方面具有显著效果［4 － 6］。因此，建立石榴
分析测试学报 第 32 卷
皮中鞣质含量的测定方法有着重要意义。
鞣花酸作为石榴皮鞣质最具代表性的单体，
国内外对其在抗癌、抗炎、抑制自由基等方面已
有较深入的研究［7 － 10］，而安石榴苷是石榴皮鞣质
类成分的主体，其含量远远高于鞣花酸等其他鞣
质成分，故 Jimenez 等［11］认为可用鞣花酸和安石
图 1 鞣花酸(A)和安石榴苷(B)的结构式
Fig. 1 The structure of ellagic acid(A)and punicalagin(B)
榴苷的含量来评价石榴皮的质量。目前，许多研
究主要通过 Folin － Ciocalteu法对石榴皮中总鞣质
进行含量测定［12 － 14］，专属性不强，而对石榴皮
中特征性鞣质成分的分析测定主要为高效液相色
谱法［15 － 18］。周本宏等［19］采用高效毛细管电泳法
测定了石榴皮酸解后其鞣花酸的含量，Juang
等［20］分别采用高效液相色谱法(HPLC)、毛细管
区带电泳(CZE)和微乳毛细管电泳(MEKC)同时
测定柯子中的 14 种可水解单宁，但 HPLC 和 CE
分别需要 60 min 和 25 min 才能将鞣花酸和安石
榴苷与其他成分分离，所需分析时间较长。利用
毛细管电泳同时测定石榴皮中多种鞣质成分的研
究，目前尚未见报道。本文采用毛细管电泳法测
定了石榴皮中鞣花酸和安石榴苷的含量(鞣花酸
和安石榴苷的结构见图 1)，并与高效液相色谱法进行对比，以寻求高效、准确和简便的测定方法，为
石榴品种的优选及开发研究提供可靠的依据。
1 实验部分
1. 1 仪器与试剂
TH-3000 高效毛细管电泳仪(河北保定天惠分离科学研究所);Waters 1525-2489 型高效液相色谱仪
(美国 Waters公司);JA2003 电子分析天平(上海分析天平仪器厂);超声波清洗器(无锡通超电子公
司);RE-52C旋转蒸发器、循环水式多用真空泵(河南省巩义市站街光亚仪器厂)。
石榴:产地云南蒙自、陕西临潼、四川会理、安徽怀远(购自江苏无锡市大润发等超市);无水乙
醇、浓盐酸、硼酸、硼砂、氯化钠(分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司);甲醇(色谱纯，上海
国药集团化学试剂有限公司);鞣花酸、安石榴苷标准品(上海安谱科学仪器有限公司)。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 标准溶液的制备 精密称取鞣花酸和安石榴苷适量，以甲醇溶解，分别配制成 5. 0 × 10 －4 g /mL
和 1. 0 × 10 －3g /mL的标准品储备液，于 4 ℃冰箱中避光保存。进行毛细管电泳测定时再以运行缓冲液
稀释至所需浓度。
1. 2. 2 供试样品的制备 将不同产地石榴皮冷水洗净，置于 40 ℃恒温鼓风干燥箱中烘干，粉碎机粉
碎。精密称取干燥石榴皮粉末 5. 0 g，以 pH 3. 0 的 60%乙醇溶液超声提取 3 次(料液比 1 ∶ 15)，每次
40 min，合并滤液，以甲醇定容至 250 mL。准确取 100 μL经甲醇稀释至 1 mL后得样品溶液。
1. 2. 3 毛细管电泳测定条件 熔融石英毛细管 50 μm × 65 cm(有效长度 55 cm )，运行缓冲液:50
mmol /L硼砂 －硼酸缓冲液(pH 8. 7);分离电压 20 kV，温度 20 ℃，电动进样 9 s /20 kV，紫外检测波
长 260 nm。毛细管使用前依次用 0. 1 mol /L NaOH、水和运行缓冲液各冲洗 10 min，两次分析间隔用
0. 1 mol /L NaOH、水和运行缓冲液冲洗 5 min以提高重现性。
1. 2. 4 高效液相色谱测定条件 色谱柱:Lichrospher C18柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm);流动相:A相为
2%冰醋酸，B相为甲醇;体积流量:1. 0 mL /min;检测波长:260 nm;进样量:10 μL。梯度洗脱程序:
0 ～10 min，80%A，10 ～20 min，80%～10%A，20 ～22 min，10 ～55%A，22 ～28 min，55%～80%A。
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第 3 期 纪白慧等:毛细管电泳法测定石榴皮中鞣花酸与安石榴苷含量
2 结果与讨论
图 2 pH值对迁移时间的影响
Fig. 2 Effect of pH value on migration time
2. 1 电泳条件的选择
2. 1. 1 运行缓冲液的 pH 值 缓冲液的 pH 值直接
影响毛细管表面的电势，从而影响电渗流的速度，同
时溶液的 pH 值也决定样品中各组分分子的解离程
度，从而影响组分的迁移时间和分离度。实验考察了
缓冲液 pH值在 8. 2 ～ 9. 2 范围时对分离的影响，结果
如图 2 所示。实验发现在 pH 8. 2 ～ 9. 2 范围内两种组
分均能达到基线分离，且随着缓冲液 pH 值的增大，
分析时间延长。从分子结构来看，鞣花酸和安石榴苷
为多酚类物质，结构中带有多个酚羟基，呈弱酸性，
pH值升高会促进酚羟基的离解，负电荷增加，反向
电泳速度增加，表观迁移速度变小，出峰时间延长。
由于安石榴苷的分子中有 16 个酚羟基结构，鞣花酸
只有 4 个，故安石榴苷具有较大的电离度，其电离后所带的负电荷数大于鞣花酸，反向迁移速度大，
因此其出峰时间比鞣花酸慢。而在实际样品测定时，当 pH值小于 8. 7 时所测组分与相邻共存组分重叠
严重。综合考虑分离度和分析时间，选择 pH 8. 7 的缓冲液。
2. 1. 2 缓冲液的浓度 缓冲液浓度决定溶液的粘度、扩散系数以及毛细管内壁的 ξ电位，是影响分离
度的重要因素。在 pH 8. 7 条件下，研究了缓冲液浓度为 20 ～ 60 mmol /L 时对两种组分迁移时间的影
响。随着缓冲液浓度的增加，被分析物的迁移时间延长，这是因为离子强度增大导致毛细管内壁的 ze-
ta电位降低，电渗流减小，迁移速度变慢，从而导致分析时间延长。但缓冲溶液浓度过低时体系稳定
性变差，且提取物中各组分不能实现基线分离。综合考虑选择 50 mmol /L的硼砂 －硼酸缓冲液。
2. 1. 3 工作电压与进样时间 实验研究了工作电压在 16 ～ 24 kV范围内对各组分迁移时间的影响。结
果表明，提高分离电压可使迁移时间减小，缩短分析时间。但分离电压过高时，会出现焦耳热、峰重
叠等现象，导致被分析物与其他共存物不能有效分离。综合考虑分离度、分析时间、峰展宽等因素，
选择 20 kV作为分离电压。
在 20 kV分离电压下，考察了进样时间在 3 ～ 15 s范围内对两组分测定的影响。实验发现，进样时
间超过 9 s，峰拖尾现象严重，这是因为进样时间过长，进样量增大，引起样品在毛细管的扩散，导致
峰形展宽，故选择进样时间为 9 s。
2. 2 毛细管电泳法测定方法学考察
配制一系列质量浓度的鞣花酸和安石榴苷的混合标准溶液，在最佳分离条件下进行测定，以峰面
积(y)对分析物的质量浓度 x(g /mL)进行线性回归分析，其线性范围、回归方程、相关系数以及检出
限(S /N = 3)见表 1。对鞣花酸和安石榴苷质量浓度分别为 2 × 10 －5 g /mL 和 4 × 10 －5 g /mL 的标准混合
溶液连续进样 7 次进行分析，考察实验的重现性。结果表明，鞣花酸和安石榴苷迁移时间的相对标准
偏差(RSD)分别为 1. 0%、2. 1%，峰面积的 RSD分别为 2. 4%和 2. 2%，说明方法的重现性好。
表 1 鞣花酸和安石榴苷的回归方程、线性范围、相关系数和检出限
Table 1 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients(r)and detection limits of ellagic acid and punicalagin
Compound Regression equation
Linear range
ρ /(g·mL －1)
r
Detection limit
ρ /(g·mL －1)
Ellagic acid y = 1. 00 × 103 x + 296 5. 0 × 10 －7～ 5. 0 × 10 －5 0. 999 7 1. 0 × 10 －7
Punicalagin y = 4. 80 × 103 x + 137 2. 0 × 10 －6～ 5. 0 × 10 －5 0. 998 9 1. 3 × 10 －6
2. 3 样品测定
2. 3. 1 样品测定 按“1. 2. 2”方法处理 4 种不同产地的石榴皮，制备得到 4 种样品溶液。准确吸取
样品溶液 450 μL，以运行缓冲液配制成 5 mL试液，在最优条件下进行毛细管电泳法测定，结果见表
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2，标准品和样品的毛细管电泳图见图 3。结果表明，4 个产地中，鞣花酸和安石榴苷的含量大小顺序
为云南 ＞陕西 ＞安徽 ＞四川，其中云南蒙自石榴中鞣花酸和安石榴苷的含量均为最高。
表 2 不同产地石榴皮中鞣花酸和安石榴苷含量测定结果(n = 3)
Table 2 Analytical result of ellagic acid and punicalagin in pomegranate peel grown in different origins between two methods
Origin
Ellagic acid w /(mg·g － 1) Punicalagin w /(mg·g － 1)
CE HPLC CE HPLC
Anhui 8. 25 7. 62 125 119
Shaanxi 8. 62 8. 53 164 161
Yunnan 10. 9 9. 51 177 174
Sichuan 4. 66 6. 58 83. 4 76. 5
图 3 混合标准品溶液(A)和石榴皮样品(B)的毛细管电泳图
Fig. 3 Electropherograms of the mixed standard solution(A)and typical sample of pomegranate peel(B)
1． ellagic acid;2． punicalagin
2. 3. 2 回收率实验 精密称取 3 份已知鞣花酸和安石榴苷含量分别为 8. 25 mg /g 和 125 mg /g 的某产
地石榴皮粉末 1. 0 g，每份精密加入鞣花酸标准品 8. 0 mg、安石榴苷标准品 125. 0 mg，按“1. 2. 2”方
法制备样品，进行加标回收实验，每个样品平行测定 3 次，鞣花酸和安石榴苷的回收率分别为 101%和
98%，RSD分别为 1. 8%和 2. 1%，方法准确、可靠。
2. 4 HPLC验证
2. 4. 1 HPLC标准曲线 配制一系列质量浓度的鞣花酸和安石榴苷的混合标准溶液，按 “1. 2. 4”高
效液相色谱条件进行测定，以峰面积(y)对分析物的质量浓度(x，g /mL)进行线性回归分析，得到标准
曲线。回归方程分别为安石榴苷 y = 9. 12 × 104x － 8. 02 × 105，鞣花酸 y = 3. 00 × 105x － 1. 25 × 106，相关
系数分别为 0. 999 9 和 0. 999 8。
2. 4. 2 CE与 HPLC测定结果比较 采用 HPLC测定 4 种产地石榴皮中的鞣花酸和安石榴苷含量，测
定结果如表 2 所示。进一步对 CE和 HPLC两种方法测定的数据进行 t检验［21］，给定 α = 0. 05，查表得
t计算值均小于 t表，故两种方法无显著性差异。
3 结 论
本文建立了同时检测石榴皮提取物中鞣花酸和安石榴苷两种成分的 CE 方法。通过与 HPLC 法对
比，t-检验表明两组数据无显著性差异，两种方法的相关系数均大于 0. 998，准确性良好。此外，相对
于 HPLC法，CE法的操作更简单，且进样体积小、分析时间短、试剂消耗少、毛细管柱易清洗，可为
石榴皮提取物的分离提供快速、高效、准确的分析方法。
我国的石榴产量高，拥有丰富的果皮资源。然而，不同的地域有着不同的生长环境，从而产生了
石榴品质间的差异，除此以外，储存条件、采摘时间、成熟程度等也会导致两者含量可能具有一定的
差别。通过实验发现，4 个产地的石榴中，云南蒙自石榴皮中的鞣花酸和安石榴苷含量更为丰富，具
有很好的研究开发价值。
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第 3 期 纪白慧等:毛细管电泳法测定石榴皮中鞣花酸与安石榴苷含量
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