全 文 ：doi:10. 7629 /yxdwfz201701018 ·实验研究·
高效液相色谱法测定大鼠血浆中安石榴苷的
含量及其药动学研究
严欢1，刘晓燕1，铁偲1，2，贺金华1
1. 新疆维吾尔自治区药物研究所 维吾尔药重点实验室，乌鲁木齐 830004;
2. 中国医学科学院北京协和医科大学药物研究所
摘要:目的 建立高效液相色谱法测定大鼠血浆中安石榴苷的含量，并用于药代动力学研究。方法 血浆样品采用色
谱甲醇处理，以大黄素作为内标，Agilent XDB － C18(250 mm × 4. 6 mm，5 μm)色谱柱，流动相为甲醇(A)－ 0. 1%三
氟乙酸水溶液(B)梯度洗脱，流速为 1. 0 ml /min，检测波长为 260 nm，柱温为 30 ℃。采用大鼠单剂量静注 13 mg /kg
的安石榴苷，HPLC法测定安石榴苷的血药浓度，并采用 DAS 2. 0 软件计算药代动力学参数。结果 方法学实验结果
表明内源性杂质不干扰安石榴苷和内标的测定，线性范围 0. 02 016 ～ 1. 00 800 mg /ml。方法精密度、准确度、稳定性
和回收率均符合生物样品测定的要求。结论 本方法操作简便、灵敏、专属性强，方法学考证符合生物样品测定的要
求，并成功用于安石榴苷在大鼠体内的药代动力学研究。
关键词:安石榴苷;高效液相色谱法;药动学
中图分类号:Ｒ285 文献标识码:A 文章编号:1003 － 6245(2017)01 － 0062 － 05
Development and validation of an HPLC method for determination of
punicalagin in rat plasma and application to a pharmacokinetic study
YAN Huan* ，LIU Xiaoyan，TIE Cai，HE Jinhuan
* Xinjiang Institute of Material Medica，Key Laboratory of Uighur Medicine，Urumqi830004，China
Abstract:Objective To establish the high － performance liquid chromatography method for determination of punicalagin in or-
der to study the pharmacokinetics of punicalagin in rats. Methods Punicalagin and emodin(internal standard，IS)were extrac-
ted by methanol(for HPLC)extraction and separated on a Agilent XDB － C18(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)column，with metha-
nol and water(containing 0. 1% trifluoroacetic acid)，gradient elution. The flow rate of 1. 0 ml /min and detected at 387 nm，the
column temperature was 30 ℃. After validating，the developed method was used for evaluating pharmacokinetics of punicalagin in
rats following intravenous administration of a dose(13 mg /kg)of punicalagin. The pharmacokinetic parameters were calculated by
the software DAS 2. 0. Ｒesults The methodological study showed endogenous impurities did not interfere the determination of pu-
nicalagin，and the internal standard and a good linear relationship were found within 0. 02 016 ～ 1. 00 800 mg /ml. The precision，
accuracy，stability and mean recoveries met the requirements of biological sample measurement. Conclusion This HPLC meth-
od for determination of punicalagin was proved to have sufficient selectivity，sensitivity and reproducibility and was successfully
applied to the pharmacokinetic study of punicalagin in rats.
Key words:Punicalagin;HPLC;Pharmacokinetic study
基金项目:新疆维吾尔自治区卫生厅青年基金项目(2014Y21);
乌鲁木齐市科学技术计划项目(Y141310026)
作者简介:严欢(1981 －)，女，副研究员，研究方向:维吾尔药分析
及药代动力学
通讯作者:贺金华，E － mail:3182410@ qq. com
安石榴苷是石榴皮多酚中最主要的特征性成分，
具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎等多种药理
学功效［1］。安石榴苷结构中含有多个酚羟基，是含有
配糖基的鞣花酸多聚体，水溶性好，可溶于甲醇、乙
醇、乙腈等多种有机溶剂，在酸、碱、光照或高温等
条件下不稳定，可逐步降解成安石榴林和鞣花酸等，
具有可水解单宁的一切理化性质［2 － 4］。安石榴苷化学
名为 2，3 －(S)－六羟基联苯二甲酰基 － 4，6 －(S，
S)并没食子酸连二没食子酰 － D －葡萄糖，分子式为
C48H28O30，相对分子质量为 1 084. 72，存在一对同
分异构体，分别为 α －安石榴苷和 β －安石榴苷，并
且二者能够相互转换［5 － 6］。
安石榴苷体内吸收机制的相关文献及数据很少，
如何提高多酚类化合物的吸收率和临床疗效，就有必
要弄清其主要成分的吸收特性及其与药物效应间的关
系，为新药开发提供实验依据［7 － 9］。本实验拟采用静
脉给药方式，研究大鼠对安石榴苷的体内吸收特性，
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以了解其吸收机制和吸收部位，对确定药物的剂型、
指导临床合理用药具有重要意义［10 － 11］。
1 材料与方法
1. 1 仪器与试剂 U3000 双三元高效液相色谱仪(美
国 Thermo公司);UPT － 11 － 10T 型纯水机(成都超
纯科技有限公司);BP211D型电子天平(德国 Satorius
公司);TDL － 4 型低速离心机(上海安亭仪器设备有
限公司)。
安石榴苷对照品，批号:MUST15031807，纯度:
98. 12%，由成都曼斯特生物科技有限公司提供;化
学结构式见图 1。
图 1 安石榴苷化学结构式
大黄素对照品，批号:110756 － 201110，由中国
食品药品检定研究院提供。乙腈、甲醇为美国 Fisher
公司产色谱纯;其它试剂均为分析纯。水为重蒸馏水。
试液配制方法均采用 2010版药典附录规定的方法。
1. 2 实验动物 Sprague － Dawley(SD)大鼠(SPF
级)，雄性，体重 80 ～ 100 g，10 只，购自新疆维吾
尔自治区实验动物研究中心，许可证号:SCXK(新)
2011 － 0001。
1. 3 色谱条件 色谱柱:Agilent XDB － C18 色谱柱
(250 mm × 4. 6 mm，5 μm);流动相:甲醇(A)－
0. 1%三氟乙酸水溶液(B)，梯度洗脱:0 ～ 10 min，2
∶98(V∶V);10 ～ 20 min，13∶ 87(V∶ V);20 ～ 21 min，
13∶ 87(V∶ V);21 ～ 35 min，85 ∶ 15(V∶ V);35 ～ 40
min，85∶15(V∶ V);40 ～ 45 min，2∶ 98(V∶ V);波长
为 260 nm，柱温为 30 ℃，流速为 1. 0 ml /min。
1. 4 对照品溶液的制备 精密称取大黄素对照品 5
mg，加色谱甲醇定容至 5 ml 量瓶中，摇匀，即得内
标溶液。
1. 5 供试品的制备 取血浆样品 100 μl，加入内标
溶液 5 μl、50%磷酸溶液 5 μl 和色谱甲醇 90 μl，涡
旋混合均匀;在低温 4 ℃，以 3. 0 × 104 r /min离心 10
min，取上清液，进样 10 μl分析。
1. 6 方法学考察
1. 6. 1 专属性 分别取 100 μl 空白血浆、100 μl 空
白血浆 +安石榴苷 +内标、100 μl 给药后大鼠血浆，
按照 1. 5 项下方法处理样品后，按 1. 3 项下色谱条件
进样测定。
1. 6. 2 标准曲线与定量限 取空白血浆，分别加入
安石榴苷对照品溶液，配制浓度分别为 0. 02、0. 04、
0. 10、0. 20、0. 40、1. 00 mg /ml含药血浆样品，作为
每日的标准曲线，按“血浆样品处理”操作。
1. 6. 3 精密度试验 取 100 μl 大鼠空白血浆共 15
份，平均分为日内、日间 2 组，加入配制的高、中、
低质量浓度的安石榴苷溶液 50 μl，制成质量浓度分
别为 20、100 和 500 μg /ml的含药血浆样品，再按照
2. 3 项下方法处理，日内组每天连续测定 5 次，日间
组每天测定 1 次，连续 5 d，记录安石榴苷和内标的
峰面积，根据标准曲线计算其质量浓度。
1. 6. 4 加样回收率试验 取 100 μl 大鼠空白血浆共
15 份，平均分为高、中、低质量浓度 3 组，按上述
方法制成含药血浆样品，再按照 2. 3 项下方法处理，
HPLC测定，记录安石榴苷和内标的峰面积，根据标
准曲线计算其质量浓度。
1. 6. 5 稳定性试验 取 100 μl 大鼠空白血浆，分别
为室温稳定性、反复冻融稳定性、长期稳定性 3 组，
按上述方法制成含药血浆样品，每组每个质量浓度平
行制备 3 份。20 ℃室温放置 4 h，检测其室温稳定
性; － 20 ℃冰箱中反复冻融 3 次，检测其反复冻融
稳定性; － 80 ℃冰箱中冷冻 3 个月，检测其长期稳
定性。所有样品按照 2. 3 项下方法处理，HPLC测定，
记录峰面积并按标准曲线计算药物质量浓度。
1. 7 大鼠体内的药代动力学实验 以生理盐水为溶
剂，制备质量浓度为 1. 04 mg /ml 的安石榴苷药液，
超声使其完全溶解。选取健康雄性 SD大鼠 10 只，体
质量在(200 ± 50)g 范围内，尾静脉注射给药，给药
量为 13 mg /kg。给药后 1. 5、4、10、20、40、60、
90、120、150、180、240、360、480、720 和 1 440
min通过眼底静脉丛取血约 0. 5 ml，置于 1. 5 ml肝素
钠抗凝管中，以 3 000 r /min 离心 10 min，吸取上层
血浆，按照 1. 5 项下方法处理，再按 1. 3 项下条件进
样，进行 HPLC分析，记录峰面积并按标准曲线计算
药物质量浓度。除去未打进尾静脉的大鼠，其余所得
数据使用 DAS 2. 0 软件进行药代动力学拟合计算，获
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得安石榴苷单体给药时曲线与相关药代动力学参数。
实验后活体动物做人道处理，20% 乌拉坦 0. 8
ml /100 g腹腔注射麻醉，至触听不到心跳与呼吸征，
确认死亡后动物尸体 － 20 ℃密封冻存，按时做生物
类医疗废弃物登记，焚烧深埋无害化处理。处理方案
经本单位实验动物伦理委员会审查并通过。
2 结 果
2. 1 专属性 结果表明，血浆中内源性物质不干扰
安石榴苷和大黄素内标的测定，且二者峰形良好。色
谱图见图 2。
图 2 专属性考察色谱图
注:A. 空白血浆;B. 空白血浆中加入安石榴苷和内
标;C. 大鼠静脉注射安石榴苷 20 min 后的血浆样品
加入内标溶液;1. α － 安石榴苷;2. β － 安石榴苷;
3. 内标
2. 2 标准曲线与定量限 以血浆中待测物浓度(x)
为横坐标，待测物与内标的峰面积比值(y)为纵坐
标，进行回归运算，求得回归方程:y = 1. 7 372x －
0. 031，r = 0. 9 988(见表 1)。
表 1 标准曲线实验结果(n = 3)
No
进样
名称
峰面积 /mAU* min
安石榴
苷 －α
安石榴
苷 －β 样 内标
含量
C/(mg
/ml)
A对 /A
内标
0 空白 0. 0000 0. 0000 0. 0000 33. 1826 0. 00000 0. 0000
1 标准曲线 －1 0. 1931 0. 6771 0. 8702 37. 5825 0. 02016 0. 0232
2 标准曲线 －2 0. 3498 1. 1429 1. 4927 39. 1312 0. 04032 0. 0381
3 标准曲线 －3 1. 0746 3. 2072 4. 2818 35. 5899 0. 10080 0. 1203
4 标准曲线 －4 3. 0145 7. 1856 10. 2001 31. 1911 0. 20160 0. 3270
5 标准曲线 －5 6. 0633 14. 9677 21. 0310 34. 3182 0. 40320 0. 6128
6 标准曲线 －6 15. 1675 36. 6668 51. 8343 29. 7364 1. 00800 1. 7431
结果表明，安石榴苷浓度在0. 02 016 ～1. 00 800 mg /
ml范围内，待测物与内标的峰面积线性关系良好。在含
药血浆样品浓度为 0. 02 016 mg /ml 时，S /N = 10，故
0. 02 016 mg /ml为安石榴苷的定量限(见图 3)。
图 3 标准曲线实验结果(n = 3)
2. 3 精密度试验 结果表明，日内和日间精密度
ＲSD均小于 10%，精密度良好，符合生物样品的质
量控制要求，结果见表 2。
表 2 精密度试验结果
浓度
/(μg /ml)
日内 日间
测定值
/(μg /ml)
ＲSD
/%
测定值
/(μg /ml)
ＲSD
/%
n
20. 16 19. 39 ± 0. 49 2. 54 19. 64 ± 0. 45 2. 29 5
100. 80 98. 20 ± 1. 58 1. 61 99. 11 ± 1. 02 1. 02 5
500. 40 496. 81 ± 4. 23 0. 85 498. 61 ± 3. 30 0. 66 5
2. 4 加样回收率试验 结果表明，与相同质量浓度、
不经处理的安石榴苷溶液所测得的质量浓度相比，提
取回收率为 95. 34% ～98. 81%，符合生物样品的质量
控制要求，结果见表 3。
表 3 加样回收率试验结果
浓度 /(μg /ml) 加样回收率 /% ＲSD /% n
20. 16 95. 34 ± 2. 16 2. 54 5
100. 80 97. 02 ± 1. 47 1. 61 5
500. 4 98. 81 ± 1. 02 0. 85 5
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2. 5 稳定性试验 结果表明，稳定性的 ＲSD 值均小
于 3%，结果见表 4。
2. 6 大鼠体内的药代动力学实验 分析主要药动学
参数并结合药时曲线可知，安石榴苷单次尾静脉给药
后，体内药代动力学过程符合三室模型;给药后血药
质量浓度迅速达到最大值，为 19. 500 mg /L;曲线下
面积 AUC0 ～ τ为 3 634. 067 mg /(L·min)，AUC0 ～∞为 3
963. 794 mg /(L·min);药物半衰期在 69. 315 min;
血浆清除率 CL 为 3. 280 L /(min·kg);同一时间点
的各组数据之间差异不大，所有重要参数的 ＲSD 均
小于 20%。结果见图 4 和表 5。
表 4 稳定性试验结果
浓度
/(μg/ml)
25 ℃(4 h) 反复 3 次冻融 － 20 ℃(3 个月)
前
/(μg /ml)
后
/(μg /ml)
ＲSD
/%
前
/(μg /ml)
后
/(μg /ml)
ＲSD
/%
前
/(μg /ml)
后
/(μg /ml)
ＲSD
/%
n
20. 16 19. 39 19. 83 1. 59 19. 39 19. 85 1. 66 19. 39 19. 04 1. 29 3
100. 80 98. 20 98. 04 0. 91 98. 20 100. 17 1. 40 98. 20 99. 06 0. 62 3
500. 40 496. 81 495. 12 0. 33 496. 81 500. 04 0. 46 496. 81 494. 87 0. 28 3
图 4 大鼠静注 13 mg /kg安石榴苷后的
药时曲线(n = 6)
表 5 大鼠静注 13 mg /kg安石榴苷后的
主要药代动力学参数(n = 6，x－ ± s)
参数 数值
Cmax /(mg /L) 19. 500
AUC0 ～ τ /(mg /L·min) 3634. 067
AUC0 ～ ∞ /(mg /L·min) 3963. 794
t1 /2 /min 69. 315
Vz /(L /kg) 1338. 802
CL /(L /min·kg) 3. 280
3 讨 论
3. 1 含量测定方法学考察 在考察安石榴苷溶解性
时发现，安石榴苷水溶性好，可溶于甲醇、乙醇、乙
腈等多种有机溶剂，但在酸、碱、光照或高温等条件
下不稳定，可逐步降解成安石榴林和鞣花酸等。溶剂
比较试验得出:甲醇中溶解最好;摸索色谱条件时发
现，相比于流动相，以纯甲醇作溶剂得出的安石榴苷
和内标峰形更好，拖尾值更接近于 1。
在考察了吐温 － 80、羧甲基纤维素钠、DMSO、
丙二醇等助溶剂后，发现体积分数 1%的 DMSO 不但
可以显著提高安石榴苷的溶解度，而且无溶血现象，
对动物安全无害，又不会影响对药物的检测，是非常
适合的助溶剂。
比较了甲醇 －磷酸系统、甲醇 － 0. 1%甲酸系统
和甲醇 －三氟乙酸系统，最终选择了色谱峰型较好的
甲醇 －三氟乙酸系统。经过优化最终确定色谱条件:
Agilent XDB －C18色谱柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm);流
动相:甲醇(A)－0. 1%三氟乙酸水溶液(B)。梯度洗脱:
(0 ～10 min，2∶98(V∶V);10 ～20 min，13∶87(V∶V);20
～21 min，13∶87(V∶V);21 ～35 min，85∶15(V∶V);35 ～
40 min，85∶15(V∶V);40 ～45 min，2∶98(V∶V)。波长为
260 nm，柱温为30 ℃，流速为1. 0 ml /min。本实验建立
了安石榴苷血药浓度测定方法，该方法专属性强，灵敏
度高。
3. 2 安石榴苷血浆药动学实验 应用安石榴苷血药浓
度测定方法进行安石榴苷的药代动力学研究:大鼠单〗
剂量静注 13 mg /kg的安石榴苷后，体内药代动力学过
程符合三室模型，主要药代动力学参数 Cmax、
AUC(0 ～ t)、AUC(0 ～ ∞)、t1 /2、Vz、CL分别为 19. 500 mg /
L、3 634. 067 mg /(L·min)、3 963. 794 mg /(L·min)、
( 下转 68 页)
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菌的关键，其影响因素可导致鼠疫菌生化结果的准确
性和可靠性［8］。鼠疫菌能分解许多碳水化合物，有的
能分解多种糖(醇)，生成酸和气体，有的虽能分解，
但只产酸不产气，还有的不能分解。此特点可作为鉴
定鼠疫菌的依据之一［9］，本次选取对鼠疫菌有典型特
征的阿胶糖、鼠李糖、麦芽糖、密二糖、甘油 5 种糖
(醇)，其生化特性为 141 菌株:阿胶糖(+)、鼠李
糖(－)、密二糖(－)、麦芽糖(+)、甘油(+);EV
76:甘油(－)，其它发酵结果同 141 菌株［10］。本研
究结果表明只有不同剂量和不同 pH值的糖(醇)类培
养基对鼠疫菌发酵结果具有一定的影响，尤其是剂量
为 0. 5%和 pH值为 7. 2 ～ 7. 4 的糖(醇)类培养基对鼠
疫菌发酵结果影响较为明显，可引起阿胶糖和甘油迟
缓发酵，对其它 3 种糖类正常发酵。不同灭菌方法、
不同浓度鼠疫菌悬液、不同培养液稀释的鼠疫菌对 5
种糖(醇)类培养基发酵结果均为正常。本文实验结
果表明，剂量为 1%和 pH 值为 7. 6 的糖(醇)培养基
是鼠疫菌发酵的理想选择值。因此，对鼠疫糖(醇)
培养基的各因素进行筛选、优化是保证鼠疫菌正常发
酵之关键。
参 考 文 献
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( 上接 65 页)
69. 315 min、1 338. 802 L /kg、3. 280 L /(min· kg)。
研究结果显示，安石榴苷单次给药在 1. 5 min 左右即
达到了最大浓度，其最大浓度为 19. 5 mg /L，半衰期
为 69. 315 min，12 h左右已检测不到血清含量。这些
数据表明，安石榴苷单次给药后被迅速吸收达最大浓
度，并发挥作用，对今后安石榴苷的组织分布、相关
制剂以及新药临床研究等具有重要意义［12］。
参 考 文 献
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(收稿日期:2016 － 05 － 11)
·86· 医学动物防制 2017 年 1 月第 33 卷第 1 期 J Med Pest Control，Jan 2017，Vol. 33，No. 1