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乌饭树树叶水溶性黄酮的抑菌作用的研究
章海燕 , 王立＊ , 张晖
(江南大学食品学院 , 江苏无锡　214122)
　　摘　要:为了拓展栽培乌饭树树叶的有效利用途径。采用二倍稀释法和管碟法对乌饭树树叶粗黄酮提取
物进行体外抑菌试验 , 研究了乌饭树树叶黄酮的抑菌作用并和山梨酸钾的抑菌作用做了比较 , 并测定了温度 、
pH值和糖盐对其抑菌效果的影响。结果显示乌饭树树叶粗黄酮对细菌的抑制作用明显 , 但对霉菌和酵母的抑
菌效果不明显。其提取液的抑菌效果强于山梨酸钾的抑菌效果。 乌饭树树叶粗黄酮在偏酸性条件下抑菌效果
较好 , 随温度的升高其抑菌效果先增强后减弱。乌饭树树叶粗黄酮类化合物在抑菌作用上和糖盐有较强的协
同作用。在相同的时间内 , 提取液的浓度越高 , 抑菌率越高;相同浓度的提取液 , 作用时间越长 , 抑菌率也
就越高。因此 , 乌饭树树叶有作为药品和天然食品杀菌防腐剂开发的潜力。
关键词:乌饭树树叶;水溶性;黄酮;抑菌作用
中图分类号:TS202.1　　　文献标识码:A　　　文章编号:1006-2513(2010)05-0062-06
Studyonantimicrobialactivityofsolubleflavonoids
fromvacciniumbracteatumthunb.Leaves
ZHANGHai-yan, WANGLi＊ , ZHANGHui
(SchoolofFoodScienceandTechnology, JiangnanUniversity, Jiangsu, Wuxi214122, China)
Abstract:InordertoexpandtheeffectiveuseofcultivationVacciniumbracteatumThunb., theantibacterialactivityof
crudeflavonoidsfromVacciniumbracteatumThunb.leaveswasstudiedwiththedouble-dilutionandpipe-platemethods
invitro, studiedtheantimicrobialefectofcrudeflavonoids.Theresultsshowthatthecrudeflavonoidshaveobviousin-
hibitioneffectsonbacteria, andithadnoobviousinhibitionefectsonmildewandyeast.Theantimicrobialeffectofthe
crudeflavonoidsisahigherthanpotassiumsorbicacid.Itwasalsoprovedthatcrudeflavonoidscanmoreefectiveina-
cidiccondition, besidestheadditionofsugarorsaltcanimprovetheantimierobialactivity.SoVacciniumbracteatum
Thunb.leaveshaveadevelopmentpotentialasdrugsandnaturalfoodmicrobicideswithVacciniumbracteatumThunb.
leaves.Inthesameactiontime, thehighertheconcentrationoftheextraction, thehigheroftheinhibitionrateis.
Withthesameconcentrationofextraction, thehighertheactiontimewillbringhigherinhibitionrate.SoVaccinium
bracteatumThunb.leaveshaveadevelopmentpotentialasdrugsandnaturalfoodmicrobicideswithVacciniumbractea-
tumThunb.leaves.
Keywords:vacciniumbracteatumthunb.Leaves;watersoluble;flavonoids;antimicrobialactivity
在食品生产中 , 为确保食品品质及延长其保
质期 , 常采用高温方法对食品进行灭菌处理 , 但
有很多食品不宜用高温灭菌 , 因此 , 化学防腐剂
在食品中的应用越来越广泛 。而化学防腐剂如山
收稿日期: 2010-03-08　　　　　＊通讯作者
基金项目:江苏省自然科学基金 (BK2010146);校科研启动项目基金;江南大学预研基金项目。
作者简介:章海燕 (1986-), 女, 安徽省滁州人 , 江南大学食品学院在读硕士研究生, 主要从事功能性色素的研究。
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梨酸 、 苯甲酸的盐类等 , 虽起到了一定的防腐效
果 , 但是 , 其使用量受到限制[ 1] 。随着生活水平
的提高 , 绿色食品的风行 , 人们愈来愈关注食品
的安全问题 , 对化学防腐剂的顾虑越来越重 [ 2] 。
本研究的目的在于为食品行业找到一种天然无毒
的可食用防腐剂 。乌饭树主要生长在丘陵地带和
海拔 400 ～ 1400m的山坡林内和灌木丛中 , 在我
国分布很广 , 蕴藏量很大 , 但一直以来都没有得
到足够的重视和应用 , 对资源造成了很大的浪
费 [ 3] 。有资料显示乌饭树树叶黄酮类化合物有抑
菌作用 , 但未见具体的科学报道。若能将乌饭树
树叶黄酮类化合物成功开发成一种新型天然食品
防腐剂 , 就不仅能为中国食品工业界提供一种具
有自主知识产权的天然防腐剂 , 更能为长久以来
一直被忽略和浪费的乌饭树提供用武之地 [ 4] 。由
于丙酮和甲醇有毒 , 一般采用乙醇浸提乌饭树树
叶中的黄酮类物质 。乙醇浸提的选择性好 , 渗透
性强 , 浸出率较高 , 但其生产成本相对较高 , 醇
提取得到的黄酮一般水溶性比较差 , 会影响黄酮
在一些以水体系为主的食品中的应用 , 例如饮料
等 。因此 , 笔者选择水作为提取溶剂从乌饭树树
叶中提取黄酮并研究其抑菌活性 , 为乌饭树树叶
水溶性黄酮类化合物的利用奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
1.1.1　主要原料与菌种
乌饭树树叶 , 2009年 3月购于江苏溧阳 。大
肠杆菌 (Escherichiacoli)、 金黄色葡萄球菌
(Staphylococcusaureus)由本校食品学院食品营养
与安全实验室提供。枯草芽孢杆菌 (Bacilussub-
tilis)由本校食品学院微生物实验室提供。黑曲
霉 (Aspergilusniger)、 米 曲 霉 (Aspergilus
oryzae)、酿酒酵母 (Saccharomgcescerevislac)由
本校食品科学与技术国家重点实验室提供 。
1.1.2　主要仪器设备
全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅 , YXQ-
LS30SI型 , 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;
净化工作台 , SW-CJ-2F型 , 苏州净化设备有
限公司;气浴恒温恒湿箱 , SHZ-82A型 , 上海
荣华仪器设备有限公司;恒温恒湿培养箱 , SPX
-150C型 , 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;
电子天平 , AL104型 , 梅特勒 -托利多化学仪器
有限公司;循环水式真空泵 , SHZ-3型 , 上海
沪西分析仪器厂;旋转蒸发仪 , RE– 52型 , 上
海沪西分析仪器厂 。其它常用设备未列出 。
1.2　实验方法
1.2.1　乌饭树树叶粗黄酮提取物的制备
取一份 25g乌饭树树叶粉末 (过 60目筛),
置于烧杯中加入 500mL无菌水 , 浸泡 2h, 然后抽
滤。取全部滤液旋转蒸发浓缩至 50mL, 用 95%
的乙醇沉淀多糖 、蛋白等一些水溶性的物质 , 离
心后得到的上清液经旋转蒸发去乙醇后剩下的物
质即为乌饭树树叶水溶性黄酮的粗提取液 。
1.2.2　培养基的制备[ 5]
细菌牛肉膏蛋白胨固体培养基:牛肉膏 3g,
蛋白胨 10g, NaCl5g, 琼脂 15g, 蒸馏水 1000mL,
调节 pH7.2 ～ 7.4, 121℃下灭菌 15min备用 。
细菌牛肉膏蛋白胨液体培养基:NaCl5g, 蛋
白胨 10g, 牛肉膏 3g, 加水至 1000mL, 分装到
500mL三角瓶中 , 121℃下灭菌 15min备用。
霉菌马铃薯培养基 (PDA培养基):去皮马
铃薯 200g, 蔗糖 (或葡萄糖)20g, 琼脂 20g, 水
1000mL。将 马 铃薯 去 皮 , 切成 小 块 , 加水
1000mL煮沸半小时 , 用双层纱布过滤 , 取其滤液
加糖 , 加琼脂 , 并加水补足 1000mL, 灭菌备用 。
酵母培养基 (YPD培养基):溶解 10g酵母
膏 , 20g蛋白胨 , 15g琼脂粉于 900mL水中 , 高
压 121℃下灭菌 15min, 葡萄糖 10g加入 100mL水
中灭菌后和上述溶合液混合 , 调节 pH=6.5左
右。因为葡萄糖 、 酵母膏 、 蛋白胨溶液的混合物
在高温下可能会发生化学反应 , 导致培养基成分
变化 , 所以要分别灭菌后再分装 。
1.2.3　菌种活化[ 6]
分别将金黄色葡萄球菌 、 大肠杆菌 、 枯草芽
孢杆菌 、 黑曲霉 、 米曲霉 、 酿酒酵母接种于相应
的固体培养基上 , 细菌于 37℃下培养 24h, 真菌
于 28℃下培养 48h, 进行活化培养。
1.2.4　菌悬液的制备
取活化培养好的菌株 , 霉菌用无菌生理盐水
将菌苔洗下 , 细菌和酵母则是接种到相应的液体
培养基里进行培养 , 然后采用菌落计数法制成孢
子 、 菌体悬浮液 , 使菌悬液菌数为 1×106个 /mL,
64　
孢子悬浮液菌数都为 1×106个 /mL。
1.2.5　管碟法检定
管碟法又称为牛津杯法 , 将制作的平板培养
基 , 加入 0.1mL的菌悬液用涂布器涂匀 , 放置
5min后 , 用无菌镊子摄取已经干热灭菌的牛津
杯 , 轻轻平置于平板表面 , 每皿等距放入 3个牛
津杯 , 每一菌种做 3个平皿 , 用无菌微量注射器
加入乌饭树树叶粗黄酮提取物 0.25mL, 用无菌生
理盐水做对照 。细菌置于 37℃培养箱进行培养 ,
24h测定抑菌圈直径 , 真菌置于 28℃培养箱进行
培养 , 48h测定抑菌直径 [ 7] , 统计结果 。
1.2.6　乌饭树树叶粗黄酮提取物和山梨酸钾的抑
菌活性的比较
采用固体平板培养基稀释法测定 [ 8] 。取无菌
试管 10支 , 在后 9支分别加入 1.0mL无菌蒸馏
水 , 取粗黄酮提取物液 1.0mL移人 1号试管 , 混
匀后 , 取出 1.0mL混合液转入 2号试管 , 依次操
作 。至 9号管取出 1.0mL弃去 , 使粗黄酮提取物
液稀释成 1、 1/2、 1/4、 1/8、 1/16、 1 /32、 1/
64、 1/128、 1 /256的不同浓度。 1 ～ 9号管中均含
有 1mL不同稀释度的提取物液 , 10号管为无药物
对照。然后在每支试管中加入融化至 55℃的固体
琼脂培养基 (9mL)充分混匀 , 倾注平板 (10mL
平皿), 平板凝固后 , 接 0.1mL的菌液于 37℃
(细菌)或 28℃ (真菌)下培养 24h或 48h。以
培养基中完全没有菌生长时的最低浓度为 MIC。
根据 MIC初步确定抑菌浓度范围。山梨酸钾对供
试菌的 MIC测定方法同上 。
1.2.7　不同 pH对乌饭树树叶粗黄酮提取物的抑
菌活性的影响
选用金黄色葡萄球菌 、 大肠杆菌和枯草杆菌
为供试菌种 , 用酸碱液调节提取液的 pH值 , 制
成 pH值分别为 4、 5、 6、 7、 8、 9的提取液 。用
1.2.5中的方法测定上述不同 pH的提取液的抑菌
效果。
1.2.8　不同温度处理对乌饭树树叶粗黄酮提取物
抑菌活性的影响
取乌饭树树叶粗黄酮提取液分别在 60℃、
80℃、 100℃、 120℃条件下处理 20min, 冷却后
按照 1.2.5的方法测定上述各提取液的抑菌效果 。
1.2.9　乌饭树树叶粗黄酮提取物溶液与盐和糖的
协同抑菌作用
向提取液中分别加入一定浓度的食盐 (3%、
5%、 7%)和葡萄糖 (10%、 20%、 30%), 并
用无菌水作对照 , 按照前面抑菌圈测定的方法分
别测定对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小。
1.2.10　乌饭树树叶粗黄酮提取物对微生物作用
时间与抑菌率的关系
以金黄色葡萄球菌为代表来测定不同浓度
(5%, 10%, 20%)的提取液对其作用时间与抑
菌率关系 。用无菌水将乌饭树树叶粗黄酮原液稀
释成各种浓度后 , 各取 1mL并分别与 0.1mL经适
当稀释的金黄色葡萄球菌菌悬液混合 , 充分摇
匀。当作用时间 1、 3、 6、 9h时 , 分别用牛肉膏
蛋白冻琼脂培养基倾注双碟平皿 。另取 1mL无菌
水与 0.1mL上述金黄色葡萄球菌菌液相混合后 ,
也用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倾注平皿 , 以作对
照。以上各皿均 37℃, 24h培养 , 取出分别数菌
落数 , 并计算抑菌率。
抑菌率 =对照皿菌落数 -试验皿菌落数对照皿菌落数 ×100%
2　结果与讨论
2.1　抑菌圈试验测定乌饭树树叶粗黄酮的抑菌能
力
表 1　乌饭树树叶粗黄酮对供试菌的抑菌效果 (n=6)
Tab.1　Thebacteriostaticeffectofthecrude
flavonoidsfromVacciniumbracteatumThunb.leaves
onthetestedmicrobacteria(n=6)
菌种
抑菌圈直径 /mm
水提粗黄酮
大肠杆菌 22.3±0.75
金黄色葡萄球菌 24.63±0.6
枯草芽孢杆菌 18.47±0.9
黑曲霉 -
米曲霉 -
酿酒酵母 -
注:“ -” 表示没有明显的抑菌效果。
试验结果显示 , 乌饭树树叶粗黄酮提取物对
金黄色葡萄球菌 、 枯草杆菌和大肠杆菌等有害细
65　
菌抑制作用较强 , 尤其值得关注的是对金黄色葡
萄球菌的显著抑制作用 , 这不仅可以用于食品的
抑菌 , 也可能开发成治疗药物 。众所周知 , 金黄
色葡萄球菌感染后 , 需要长时间 、大剂量 、 多种
抗生素交替使用才能彻底治愈 。如果进一步研究
发现乌饭树树叶粗黄酮提取物对金黄色葡萄球菌
有特效 , 这无疑是对人类的重要贡献 。
2.2　乌饭树树叶粗黄酮提取物和山梨酸钾的抑菌
活性的比较
乌饭树树叶水提黄酮原液中黄酮含量为
16.456mg/mL, 山梨酸钾溶液中山梨酸钾的含量
为 108.83mg/mL。
表 2　乌饭树树叶粗黄酮和山梨酸钾的最小抑菌浓度
Tab.2　TheMICofthecrudeflavonoidsfrom
VacciniumbracteatumThunb.leaves
菌种
最低抑菌浓度 (mg/mL)
水提粗黄酮 山梨酸钾
大肠杆菌 2.06 15.75
金黄色葡萄球菌 1.03 7.875
枯草芽孢杆菌 4.12 15.75
从表 2可知 , 乌饭树树叶水提黄酮的抑菌效
果高于山梨酸钾 , 且乌饭树树叶的食疗价值和作
为天然食品防腐剂的作用将使它具有较好的开发
前景。
2.3　不同 pH值对乌饭树树叶粗黄酮提取物的抑
菌活性的影响
由表 3可知 , 不同 pH对乌饭树树叶黄酮提
取物的抑菌作用有一定的影响 , 对 3种细菌的抑
制作用都表现为在偏酸性条件下抑菌效果较好。
由上述结果可知 pH=4时乌饭树树叶粗黄酮提取
物抑菌活性最好。当 pH值大于等于 7时乌饭树
树叶粗黄酮提取物的抑菌效果就不明显了 。这可
能是因为在碱性条件下黄酮的有效结构受到破
坏 , 从而影响其抑菌作用。
表 3　不同的 pH处理对乌饭树树叶粗黄酮
提取物抑菌活性的影响
Tab.3　TheimpactofdifferentpHonthebacteriostatic
effectofthecrudeflavonoidsfromVaccinium
bracteatumThunb.leaves(n=6)
pH值
菌种
大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草杆菌
pH=4 22.85±0.51 21.83±0.99 23.25±0.77
pH=5 15.05±0.69 15.9±0.53 22.07±0.71
pH=6 7.35±0.81 9.28±0.8 10.08±0.56
pH=7 - - -
pH=8 - - -
pH=9 - - -
注:表中的数据单位为 mm, “ -” 表示没有明显的抑菌效
果。
2.4　不同温度处理对乌饭树树叶粗黄酮提取物抑
菌活性的影响
表 4　不同的温度处理对乌饭树树叶粗黄酮提取物抑菌活性的影响
Tab.4　Theimpactofdifferenttemperaturesonthebacteriostaticeffectofthecrude
flavonoidsfromVacciniumbracteatumThunb.leaves(n=6)
菌种
抑菌圈直径 (mm)
60℃ 80℃ 100℃ 120℃
大肠杆菌 23.93±0.64 27.43±0.85 25.42±0.81 24.75±0.95
金黄色葡萄球菌 25.3±1.15 27.55±0.85 25.73±0.54 24.93±0.87
枯草芽孢杆菌 19.57±0.88 24.27±0.73 20.75±0.76 18.63±1.14
由表 4可知 , 不同处理温度对乌饭树树叶黄
酮提取物的抑菌作用有一定影响 , 随着对乌饭树
树叶黄酮提取物溶液处理温度的升高其抑菌作用
明显呈先上升后下降的趋势。这可能是因为:一
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方面 , 随着处理温度的增加 , 乌饭树树叶粗黄酮
提取物溶液中水分蒸发造成浓度增大 , 而且随着
温度的升高乌饭树树叶黄酮提取物溶解度增大 ,
从而使其抑菌作用增强;另一方面 , 当温度高于
80℃后会破坏黄酮提取物的结构 , 因此抑菌作用
又有所降低 。
2.5　黄酮提取物溶液与盐和糖的协同抑菌作用
先测定一定浓度的食盐 (3%、 5%、 7%)
和葡萄糖 (10%、 20%、 30%)单独对金黄色葡
萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用 , 然后将上述浓度
的食盐或葡萄糖分别加入提取液中再测定混合后
的溶液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作
用 , 步骤同 1.2.5, 实验结果如下。
表 5　不同盐 、 糖浓度单独作用的抑菌效果
Tab.5　Theantibacterialeffectofdifferentsalt,
sugarconcentration
不同盐 、 糖浓度
抑菌圈直径 (mm)
金黄色葡萄球菌 大肠杆菌
3%食盐 - -
5%食盐 - -
7%食盐 - -
10%葡萄糖 - -
20%葡萄糖 - -
30%葡萄糖 - -
注:“ -” 表示没有明显的抑菌圈
表 6　乌饭树树叶粗黄酮提取液与盐的协同抑菌作用
Tab.6　Thecolaborativebacteriostaticeffectofsaltandthecrudeflavonoidsfrom
VacciniumbracteatumThunb.leaves(n=6)
菌种
抑菌圈直径 (mm)
黄酮粗提物+3%食盐 黄酮粗提物 +5%食盐 黄酮粗提物 +7%食盐
金黄色葡萄球菌 25.37±0.64 26.4±0.71 28.3±0.66
大肠杆菌 23.78±0.75 25.03±1.04 26.52±0.79
表 7　乌饭树树叶粗黄酮提取液与糖的协同抑菌作用试验
Tab.7　ThecolaborativebacteriostaticeffectofsugarandthecrudeflavonoidsfromVaccinium
bracteatumThunb.leaves(n=6)
菌种
抑菌圈直径 (mm)
黄酮粗提物 +10%葡萄糖 黄酮粗提物 +20%葡萄糖 黄酮粗提物 +30%葡萄糖
金黄色葡萄球菌 26.28±0.75 27.25±0.6 27.8±0.55
大肠杆菌 25.8±0.61 26.75±0.49 28.13±0.65
从表 5、 6和表 7中可以看出 , 一定浓度的
糖 、盐单独对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都没有
抑制作用 , 而将一定浓度的糖或盐加入到溶液里
时 , 溶液的抑菌作用明显加强 , 添加的糖和盐的
浓度越大 , 抑菌率随之增大 , 这表明乌饭树叶粗
黄酮提取液与糖 、 盐有较强的协同作用 , 其作用
机理应该与糖和盐本身也是食品的防腐剂有关 。
2.6　乌饭树树叶粗黄酮提取物对微生物作用时间
与抑菌率的关系
由图 1可知 , 在相同的时间内 , 提取液的浓
度越高 , 抑菌率越高;相同浓度的提取液 , 作用
时间越长 , 抑菌率也就越高 。
67　
注:△表示乌饭树树叶粗黄酮浓度为 20%;□表示浓度为 10%;◇表示浓度为 5%
图 1　提取时间与提取率的关系
3　结论
3.1　乌饭树树叶水提粗黄酮对细菌的抑制作用明
显 ,但对霉菌和酵母的抑菌效果不明显。乌饭树树叶
水提粗黄酮对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度
(MIC)为 1.03mg/mL, 对大肠杆菌的 (MIC)为
2.06mg/mL,对枯草芽孢杆菌的(MIC)为 4.12mg/mL。
3.2　乌饭树树叶水提粗黄酮在偏酸性条件下抑菌
效果较好 , 其抑菌效果随温度的升高先增强后减
弱 。
3.3　乌饭树树叶水提粗黄酮类化合物和糖盐有较
强的协同抑菌作用。
3.4　乌饭树树叶水提粗黄酮的抑菌效果强于山梨
酸钾的抑菌效果 。
3.5　在相同的时间内 , 粗黄酮提取液的浓度越
高 , 抑菌率也就越高;相同浓度的提取液 , 作用
时间越长 , 抑菌率也就越高。
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