全 文 ：2011 年 12 月
第 32 卷 第 6 期
首 都 医 科 大 学 学 报
Journal of Capital Medical University
Dec． 2011
Vol． 32 No． 6
［doi:10． 3969 / j． issn． 1006-7795． 2011． 06． 021］ ·基础研究·
鸡血藤黄酮类有效部位对人非小细胞肺癌 A549 细胞凋亡与
线粒体膜电位的影响
王 燕1 李 萍1 林 燕1 赵京霞1 刘 欣1 何 薇1 梁代英1 罗晓琴2 王笑民2*
(1． 北京市中医研究所，北京 100010;2． 首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010)
【摘要】 目的 探讨鸡血藤黄酮类有效部位(spatholobus suberectus column extract，SSCE)对人非小细胞肺癌 A549 细胞凋亡及线
粒体膜电位的影响。方法 采用细胞增生试剂盒 cell counting kit-8，观察 SSCE对 A549 细胞增生的影响;通过 Annexin V-PI双染
法结合 Hoechst33324 染色检测 SSCE对 A549 细胞凋亡的影响;应用 Mitotracker Red及 JC-1 染色，检测 SSCE对细胞线粒体及线
粒体膜电位的影响。结果 浓度高于 40 mg /L的 SSCE对 A549 细胞生长有抑制作用，且具有浓度时间依赖性。SSCE作用 24 h
后，A549 细胞呈现典型的凋亡现象:膜磷脂酰丝氨酸外翻;细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光;线粒体由棒状变成颗粒
状，并向细胞核聚集;线粒体膜电位下降。结论 SSCE可以诱导人非小细胞肺癌 A549 细胞发生凋亡，改变线粒体形态且降低其
线粒体膜电位。
【关键词】 鸡血藤;A549;细胞凋亡;线粒体
【中图分类号】 R 284． 3
Effect of spatholobus suberectus column extract on apoptosis and mitochondrial
transmembrane potential of non-small cell lung cancer A549 in vitro
WANG Yan1，LI Ping1，LIN Yan1，ZHAO Jing-xia1，LIU Xin1，HE Wei1，LIANG Dai-ying1，LUO Xiao-qin2，
WANG Xiao-min2*
(1． Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100010，China;2． Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Capital
Medical University，Beijing 100010，China)
【Abstract】 Objective To investigate the effect of spatholobus suberectus column extract(SSCE)on apoptosis and mitochondrial
transmembrane potential of non-small cell lung cancer A549 in vitro． Methods Cell counting kit-8 was used to investigate the effect of
SSCE on the proliferation of A549，apoptotic morphological changes were observed by Annexin V-PI double-staining technique，nuclear
changes were observed by Hochest33342 staining，mitochondrial changes were observed by Mitotracker red staining，and mitochondrial
membrane potential was examined by JC-1 staining． Results The concentration of 40 mg /L，SSCE could suppress the proliferation of
A549 cells in a dose and time-dependent manner． After cultured with SSCE for 24 h，A549 cells exhibited typical characteristics of
apoptosis，such as phosphatidylserine(PS) externalization，pyknosis，dense-stained nucleus and cytoplasm，nucleus granulation，
mitochondrias gathered to the nucleus and their shape changed from rod into granular form，mitochondrial membrane potential decreased．
Conclusion SSCE induced apoptosis of A549 cells by changing the mitochondrial morphology and reducing the mitochondrial membrane
potential．
【Key words】 spatholobus suberectus;A549;apoptosis;mitochondria
基金项目:北京市教育委员会科技发展计划(KM200810025008)。This
study was supported by Science and Technology Development Program of
Beijing Municipal Commission of Education(KM200810025008)．
* Corresponding author，E-mail:1ntxm100@ sina． com
鸡血藤(spatholobus suberectus dunn)黄酮类有效
部位是养血活血类中药，常用于肿瘤患者。研究［1-2］
表明，鸡血藤提取物在体内、体外试验中均呈现抗肿
瘤作用。采用聚酰胺柱色谱法从鸡血藤醇提取物中
分离获得的富含黄酮类化合物组分“鸡血藤黄酮类有
效 部 位 (spatholobus suberectus column extract，
SSCE)”，SSCE在体外试验中抑制肿瘤活性最强［3］。
本试验组选用敏感的肺癌细胞系 A549 细胞株作
为研究对象，观察 SSCE 作用后细胞凋亡的情况及线
粒体膜电位的改变，以探讨鸡血藤抗肿瘤的物质基
础，为寻找新的高效低毒的新型抗癌先导化合物提供
依据。
首 都 医 科 大 学 学 报 第 32 卷
1 材料和方法
1． 1 材料与仪器
恒温 CO2 培养箱(日本三洋公司) ，SA1000 酶标
仪(奥地利 Asyshitech 公司) ，激光共聚焦显微镜
FV500(日本 Olympus公司)。
1． 2 药品与试剂
SSCE由北京市中医研究所药化室制备。F12 培
养基(美国 HyClone 公司) ;胎牛血清(美国 Gibco 公
司) ;胰蛋白酶(美国 Gibco 公司) ;细胞增生试剂盒
cell counting kit-8(CCK-8，日本同仁化学公司) ，An-
nexin V-PI 双染试剂盒(Cat K 101-25，美国 BioVision
公司) ，Hoechst染料(日本同仁化学公司) ，JC-1 染料
(北京碧云天公司) ，Mitotracker Red(Cat PA-3017，瑞
士 Lonza公司)。
1． 3 细胞系及细胞培养
人肺腺癌 A549 细胞系购自协和细胞中心。细胞
培养条件:F12 培养基，含 10%胎牛血清和 1%双抗
(青霉素 100 U /mL，链霉素 100 mg /L) ，置于 37 ℃、
5% CO2 的恒温箱中培养。
1． 4 细胞活性检测
采用 CCK-8 检测，取对数生长期细胞制成单细胞
悬液，调细胞个数为 2 × 107 /L，接种于 96 孔板中，每孔
100 μL，于 37 ℃、5% CO2 的恒温培养箱中培养 24 h
后，吸出上清液，每孔加入 100 μL 含 SSCE 或无 SSCE
的培养液。
实验分为 4 组，分别为:①对照组:A549 细胞 +完
全 F12 培养;②低剂量组:A549 细胞 + 40 mg /L SSCE;
③中剂量组:A549 细胞 + 80 mg /L SSCE;④高剂量组:
A549细胞 +160 mg /L SSCE。每组至少设 3个副孔，培
养 24、48、72 h 后，每孔加入 10 μL CCk-8 溶液，培养 4
h，在酶标仪上测 450 nm处吸光度 A，并计算细胞增生
抑制率(inhibition rate，IR) ，实验重复 3次。
细胞增生抑制率(%)= (1 － 实验组 A /对照组
A)× 100%。
1． 5 细胞凋亡检测
1)Annexin V-PI双染法激光共聚焦显微镜观察:
细胞以 1 × 105 /mL 传送于 Petri 小皿中，分为对照组
及 SSCE组(160 mg /L，作用 24 h、48 h) ，用 PBS 洗 2
次，分别加入 100 μL 1 × Binding Buffer 缓冲液，5 μL
Annexin V-FITC和 5 μL PI，室温避光孵育 15 min，再
加入 400 μL 1 × Binding Buffer缓冲液，激光共聚焦观
察。激发波长 Ex = 488 nm;发射波长 Em =530 nm。
2)Hoechst染色倒置荧光显微镜观察:将细胞传
送于提前放置好洁净盖玻片的 24 孔板中，细胞密度 1
× 105 /mL，待细胞贴壁后，向孔内加入 SSCE(160 mg /
L) ，同时设正常对照组，SSCE 作用 24 h 后，取出细胞
爬片，于 PBS溶液中漂洗 3 min × 3 次，漂洗后于预冷
的固定液中(甲醛与丙酮 1∶1 混合)固定细胞 8 min，
向固定好的细胞滴加 Hoechst33342(5 μmol /L 50
μL) ，37 ℃孵育 15 min，取载玻片，每片上滴加 1 滴防
荧光淬灭剂，将细胞片扣于载玻片上，于正置荧光显
微镜下观察细胞核变化。
1． 6 线粒体检测
1)JC-1 染色激光共聚焦显微镜观察:细胞以 1 ×
105 /mL传送于 Petri 小皿中，分为对照组及 SSCE 组
(160、80、40 mg /L，作用 24 h) ，用 PBS 洗 2 次，加入
JC-1(50 mg /L，200 μL) ，37 ℃孵育 20 min，激光共聚
焦显微镜观察。JC-1 是检测线粒体膜电位的荧光探
针，在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体的基
质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates) ，可以产生红
色荧光;在线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线
粒体的基质中，此时 JC-1 为单体(monomer) ，可以产
生绿色荧光。这样就通过荧光颜色的转变来检测线
粒体膜电位的变化。
JC-1 单体的最大激发波长为 514 nm，最大发射波
长为 529 nm;JC-1 聚合物(J-aggregates)的最大激发波
长为585 nm，最大发射波长为590 nm。实际观察时，
使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。
用软件计算红绿荧光比值。
2)Mitotracker Red染色激光共聚焦显微镜检测:
细胞以 1 × 105 /mL 传送于 Petri 小皿中，分为对照组
及 SSCE组(160 mg /L，作用 24 h) ，用 PBS 洗 2 次，加
入 Mitotracker(5 mg /L，200 μL) ，37 ℃孵育 20 min，
激光共聚焦显微镜观察。
1． 7 统计学方法
数据采用 SPSS 16． 0软件处理，实验数据以均数 ±
标准差(珋x ± s)表示。组间比较采用折因方差分析和均
数的两两比较，以 P ＜0． 05为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 SSCE对 A549 细胞活性的影响
相同处理时间不同浓度 SSCE 作用后，对细胞活
性的影响与对照组相比差异均有统计学意义，低、中、
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第 6 期 王 燕等:鸡血藤黄酮类有效部位对人非小细胞肺癌 A549 细胞凋亡与线粒体膜电位的影响
高 3 个剂量的 SSCE 作用 24 h 后，抑制率分别为
10． 29%、31． 52%和42． 75%;各剂量 SSCE 处理 48 h
后，抑制率分别为 27． 15%、38． 85%和 57． 49%;各剂
量 SSCE 处理 72 h 后，抑制率分别为 15． 13%、
15． 10%和 37． 52%，详见表 1。
表 1 不同浓度 SSCE作用相同时间对 A549 细胞增生的影响
Tab． 1 Effect of SSCE on the proliferation of A549 cells(珋x ± s) n = 6
Group
OD
24 h 48 h 72 h
Control 0． 639 ± 0． 011 2． 280 ± 0． 190 3． 299 ± 0． 231
160 mg /L 0． 366 ± 0． 035＊＊ 0． 969 ± 0． 107＊＊ 2． 088 ± 0． 211＊＊
80 mg /L 0． 438 ± 0． 056＊＊ 1． 394 ± 0． 158* 2． 837 ± 0． 102*
40 mg /L 0． 574 ± 0． 081* 1． 661 ± 0． 791* 2． 836 ± 0． 107*
* P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01 vs control;SSCE:spatholobus suberectus column extract;OD:optical density．
In each group the time of reaction was the same，and the effects of different concentration of SSCE on cell
proliferation were compared．
2． 2 SSCE对细胞凋亡的影响
磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)正常位于
细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS 可从细胞膜
的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
发生 PS外翻的细胞能够结合 AnnexinV-FITC 呈绿色
荧光图像。凋亡晚期和死亡细胞能够被 PI 染成红
色。因此，未被染色的为正常细胞，单染绿色荧光的
为早期凋亡，红绿双染的为晚期凋亡，单染红色的为
死亡细胞。SSCE在浓度 160 mg /L作用于 A549 细胞
24 h 后，细胞单染绿色(图 1B) ，表明发生了早期凋
亡。作用 48 h后，细胞呈红绿双染，表明为晚期凋亡
(图 1D)。
图 1 SSCE作用 24、48 h后 Annexin V-PI染色激光共聚焦显微镜观察 PS外翻
Fig． 1 Immunofluorescence staining of Annexin V-PI in SSCE incubated A549 cells(600 ×)
A:control;B:SSCE at concentration of 160 mg /L，24 h;C:control;D:SSCE at concentration of 160
mg /L，48 h;SSCE:spatholobus suberectus column extract;PS:phosphatidylserine．
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首 都 医 科 大 学 学 报 第 32 卷
在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常
的蓝色，阳性对照组大量细胞的细胞核出现致密浓染，
或呈碎块状致密浓染(图 2A) ，而 SSCE 组在浓度 160
mg /L作用 24 h，部分细胞核出现致密浓染(图 2B)。
图 2 SSCE作用 24 h后 Hochest33342 染色倒置荧光显微镜观察细胞核
Fig． 2 Immunofluorescence staining of Hochest33342 in SSCE incubated A549 cells(100 ×)
A:control;B:SSCE at concentration of 160 mg /L，24 h;SSCE:spatholobus suberectus column extract．
2． 3 SSCE对细胞线粒体的影响
SSCE作用于 A549 细胞 24 h 后，红色荧光向绿
色荧光转变，绿色荧光与红色荧光比值升高，详见表
2，图 3。
正常细胞线粒体经染色后，呈均匀的棒状、颗粒
状(图 4A) ;SSCE 作用于细胞 24 h 后，线粒体由颗粒
状、棒状变为点状，并向细胞核聚集(图 4B)。
表 2 不同剂量 SSCE作用 A549 细胞 24 h后
线粒体膜电位的改变
Tab． 2 Effect of SSCE on the mitochondrial membrane
potential of A549 cells(珋x ± s) n = 4
SSCE Green fluorescence /Red fluorescence
Control 0． 557 ± 0． 082
160 mg /L 3． 057 ± 0． 365＊＊
80 mg /L 2． 426 ± 0． 440＊＊
40 mg /L 1． 954 ± 0． 451＊＊
＊＊ P ＜ 0． 01 vs control;SSCE:spatholobus suberectus column extract．
图 3 SSCE作用 24 h后 JC-1 染色激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位
Fig． 3 Immunofluorescence staining of JC-1 in SSCE incubated A549 cells(600 ×)
A:control;B:SSCE at concentration of 160 mg /L，24 h;JC-1:J-aggregates;
SSCE:spatholobus suberectus column extract．
3 讨论
鸡血藤是一味养血活血中药，中医古籍记载用于
治疗月经不调、血虚萎黄、风湿痹痛等症，药化分析发
现其含有大量黄酮类化合物。现代药理学研究［3］证
实鸡血藤具有刺激骨髓造血功效，近年来研究［3］发现
鸡血藤粗提物及其总黄酮组分在细胞水平和整体的
动物水平都表现出抗肿瘤活性，其中富含黄酮成分的
有效部位 SSCE在体外抑瘤作用最强。
人们一直以为细胞增生和分化的异常是肿瘤发
生的主要原因，随着对细胞凋亡概念的引入，人们开
始从细胞凋亡的角度审视肿瘤的发生［4］。细胞凋亡
是细胞对内外刺激信号做出的应答反应，在机体的许
多生理、病理过程中都起到重要的作用。
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第 6 期 王 燕等:鸡血藤黄酮类有效部位对人非小细胞肺癌 A549 细胞凋亡与线粒体膜电位的影响
图 4 SSCE作用 24 h后 Mitotracker red染色激光共聚焦显微镜观察线粒体形态
Fig． 4 Immunofluorescence staining of Mitotracker red in SSCE incubated A549 cells(600 ×)
A:control;B:SSCE at concentration of 160 mg /L，24 h;SSCE:spatholobus suberectus column extract．
线粒体不仅在细胞存活而且在细胞凋亡通路中
起着核心作用。细胞凋亡过程中，线粒体形态和功能
均发生显著变化。线粒体跨膜电位的下降或线粒体
膜通透性转运孔开放是调节细胞凋亡的中心环节。
在致凋亡因子的刺激下，线粒体膜通透性转运孔开
放，线粒体跨膜电位降低或丧失，线粒体基质中释放
出凋亡蛋白使细胞凋亡。刘丽启等［5］报道线粒体跨
膜电位的耗散是细胞凋亡级联反应过程中最早发生
的时间，而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入
不可逆的凋亡过程。
本研究前期实验通过流式细胞仪对 PS 及细胞周
期进行了检测，发现 SSCE 可以使细胞周期 S 期细胞
增多，G0-G1 和 G2-M 期细胞减少。本研究结果进一
步证实，SSCE 作用于细胞 24 h 后，PS 表现外翻、细
胞质固缩，线粒体由棒状变成点状，并向细胞核聚集，
线粒体膜电位显著下降，有明显的凋亡特征;提示
SSCE可能对线粒体凋亡通路发挥作用。
凋亡通路包括线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡
途径，随着细胞生物学研究的深入，新的细胞死亡途
径逐渐被揭示出来，如胀亡、自噬、副凋亡等［6］。在细
胞程序性死亡过程中，各种通路不是单独起作用的，
而是相互交联的，有彼此重叠的机制出现。因此，
SSCE诱导 A549 细胞凋亡的机制仍需进一步研究。
4 参考文献
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生物技术报，2009，11:20-23．
(收稿日期:2011-03-10)
编辑 慕萌
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