全 文 ：乳浆大戟提取物对人肺癌细胞生长的影响
王爱红1，庞秋霞1，陈美霓1，米志宽1，符兆英1* ，杨文杰2，向云涛2 (1 延安大学医学院生物化学教研室，延安
716000;2延安大学医学院;* 通讯作者，E-mail:fu_zhaoying@ 163． com)
摘要: 目的 观察乳浆大戟提取物对体外培养的人肺癌细胞 A549 增殖的影响及其可能的作用机制。 方法 不同浓度的
乳浆大戟提取物(0． 2，0． 4，0． 8 g /L)作用于体外培养的 A549 细胞，MTT法观察乳浆大戟提取物对 A549 细胞增殖的影响;Ho-
echst33528 和 PI染色法观察细胞凋亡的形态学改变;流式细胞术检测 A549 细胞的凋亡率变化;JC － 1 染色法观察细胞线粒体
膜电位改变，ＲT － PCＲ检测 bcl － 2、bax的 mＲNA表达变化。 结果 乳浆大戟提取物抑制 A549 细胞的增殖，具有时间和剂
量效应关系，0． 8 g /L乳浆大戟提取物作用 A549 细胞 48 h后抑制率为 46． 3%;流式细胞仪结果显示，乳浆大戟提取物作用 48
h后，可以诱导 A549 细胞凋亡，凋亡率可达 48． 4%;荧光显微镜下观察到线粒体膜电位下降;ＲT － PCＲ 结果显示 bcl － 2 的
mＲNA表达水平下调，bax的 mＲNA表达水平上调，其作用呈剂量效应关系。 结论 乳浆大戟提取物抑制 A549 细胞增殖是
通过线粒体途径诱导 A549 细胞凋亡，可能的机制是上调 bax及下调 bcl － 2 的表达。
关键词: 乳浆大戟提取物; A549 细胞; 凋亡
中图分类号: Ｒ734． 2 文献标志码: A 文章编号: 1007 － 6611(2014)06 － 0460 － 05 DOI:10． 13753 / j． issn． 1007 － 6611． 2014． 06． 006
Effect of extracts of Euphorbia esula on proliferation of human lung cancer cells
WANG Aihong1，PANG Qiuxia1，CHEN Meini1，MI Zhikuan1，FU Zhaoying1* ，YANG Wenjie2，XIANG Yuntao2(1Department of Bio-
chemistry，Yan’an Medical College，Yan’an University，Yan’an 716000，China;2Yan’an Medical College，Yan’an University;
* Corresponding author，E-mail:fu_zhaoying@ 163． com)
Abstract: Objective To investigate the effect of extracts of Euphorbia esula on proliferation of the human lung cancer cell lines A549
cells and explore its related mechanisms． Methods The human lung cancer cell lines A549 cells were treated with different concen-
trations(0． 2，0． 4，0． 8g /L)of extracts of Euphorbia esula in vitro． The cell proliferation was analyzed by MTT． The cell morphological
changes were observed using Hoechst33528 and PI staining． The effect of extracts of Euphorbia esula on apoptosis was observed by flow
cytometry． Mitocbondrial membrane potential was observed under fluorescence microscope． ＲT － PCＲ methods were used to explore the
mＲNA expression levels of bcl-2，bax． Ｒesults Extracts of Euphorbia esula inhibited the growth of A549 cells in a time-and dose-de-
pendent manner，and the maximum inhibition rate was 46． 3% after treated with 0． 8 g /L extracts of Euphorbia esula for 48 h． Extracts
of Euphorbia esula induced the apoptosis of A549 cells，and the apoptotic rate was 48． 4% after treated with 0． 8 g /L extracts of Euphor-
bia esula for 48 h． Fluorescence microscopy showed that mitocbondrial membrane potential decreased． ＲT-PCＲ analysis showed that
the mＲNA expression level of bcl-2 was down-regulated，while the level of bax was up － regulated． Conclusion Extracts of Euphorbia
esula can induce the apoptosis of A549 cells by mitocbondrial pathway，which may be related to the increase of bax expression and the
decrease of bcl-2 expression．
Key words: extracts of Euphorbia esula; A549 cell; apoptosis
肺癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之
一，其发病率及病死率均居首位［1，2］，从天然资源如
植物或中药中寻找提取毒副作用小的治疗肺癌的药
物，有着特别重要的意义［3 － 6］。本研究发现，乳浆大
戟提取物具有诱导人肺癌 A549 细胞凋亡的作用，
并对其作用机制做了初步研究，结果报道如下。
1 材料与方法
1． 1 细胞株和主要试剂
人肺癌细胞 A549 由延安大学医学实验中心实
验室保存。噻唑蓝(MTT)、碘化丙锭(PI)、二甲亚
砜(DMSO) (sigma － Aldrich公司，美国) ;ＲPMI 1640
培养基(invitrogen 公司，美国) ，四季青新生小牛血
清(浙江天杭生物科技有限公司) ，胰酶(Gibco BＲL
公司，美国) ，Trizol(invitrogen公司，美国) ，JC-1线粒
体膜电位检测试剂盒(南京凯基生物技术有限公
司 ) ，ＲevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit
基金项目: 陕西省教育厅科学研究基金资助项目(12JK0755) ;延安市科技发展计划资助项目(2010ks － 06) ;国家大学生创新基金资
助项目(201210719012)
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(Fermentas公司，加拿大) ;Bcl-2、Bax、β-actin 引物
由上海生工设计合成，荧光倒置显微镜及 CCD采用
Nikon 显微镜，流式细胞仪 FACS Calibur(Becton
Dickinson公司，美国) ，凝胶成像系统(SYNGENE 公
司，美国) ，酶标仪采用美国 Bio － Ｒad 680 型全自动
酶标仪。
1． 2 方法
1． 2． 1 细胞培养 人肺癌细胞用 ＲPMI1640 培养
基培养，常规加入 10%小牛血清，100 U /ml青霉素，
0． 1 mg /mL 链霉素。放置 37 ℃、5% CO2 培养箱中
培养。
1． 2． 2 乳浆大戟提取物制备 乳浆大戟地上全草
阴干，用植物捣碎机粉碎，加适量纯水制成混悬液，
粗滤纸过滤收集滤液，低温风干称重，加纯水配制成
100 g /L，0． 22 μm滤器过滤保存于 － 20 ℃备用。
1． 2． 3 MTT法检测乳浆大戟提取物对人肺癌细胞
增殖的影响 取对数生长期的 A549 细胞，以 5 ×
104 /ml的密度接种于 96 孔板中，每孔 200 μl。次日
细胞贴壁后，更换培养基，添加乳浆大戟提取物，其
终浓度为 0，0． 2，0． 4，0． 8 g /L，每个浓度设 6 个复
孔，于培养 24，48，72 h 加入 MTT 20 μl /孔(5 mg /
ml) ，继续孵育 4 h，吸弃培养液，加入二甲基亚砜
(DMSO)150 μl /孔，充分混匀，在酶标仪 490 nm 处
测其吸光度(A)值，计算平均 A 值和抑制率(IＲ)。
试验重复三次。IＲ = (1 － 实验组 A 值 /对照组 A
值)× 100%。
1． 2． 4 Hoechst33528 和 PI染色法观察细胞形态学
改变 取对数生长期的 A549 细胞，以 2 × 105 /ml的
密度接种于 6 孔板中，每孔 2 ml。次日细胞贴壁后，
更换培养基，添加乳浆大戟提取物，其终浓度为 0，
0． 2，0． 4，0． 8 g /L，培养 48，72 h后弃去培养基，2 ml
PBS 洗二次，加入 50 g /L 的 PI 染料，避光染色 30
min，Hoechst33528 染色按照说明书进行，荧光显微
镜观察细胞核的形态改变。
1． 2． 5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 流式细胞术
样品准备:①细胞处理方法同 1． 2． 3，培养 48 h 后，
消化收集细胞(1 － 5)× 106 个，500 － 1 000 r /min 离
心 5 min，弃去培养液。②3 ml PBS洗一次。③离心
去除 PBS，加入冰预冷的 70%的乙醇固定，4 ℃，1
h。④离心弃去固定液，3 ml PBS 重悬 5 min。⑤
400 目的筛网过滤 1 次，500 － 1 000 r /min 离心 5
min，弃去 PBS。⑥用 1 ml PI染液，4 ℃避光 30 min。
⑦流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1． 2． 6 细胞线粒体膜电位检测 细胞处理同
1． 2． 3，培养 48 h后吸弃全部培养基，用 PBS洗涤细
胞一次，加 1 ml培养液和 1 ml JC染色工作液，充分
混匀，在培养箱 37 ℃孵育 20 min;37 ℃孵育结束
后，吸弃含染色液的培养液，用 JC 染色缓冲液洗涤
2 次;加入 2 ml细胞培养液，在荧光显微镜下观察并
照相。
本实验采用 JC-1 荧光探针法检测细胞的线粒
体膜电位，在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线
粒体的基质中，形成聚合物产生红色荧光，线粒体膜
电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基质中，此
时 JC-1 为单体，产生绿色荧光。正常的细胞膜电位
较高，镜下观察为红色;当出现凋亡时，膜电位下降，
镜下观察为绿色。
1． 2． 7 ＲT-PCＲ 将 A549 细胞接种于 25 ml 培养
瓶中，接种浓度为 3 × 105 /ml，细胞处理方法同
1． 2． 3。按 Trizol 试剂盒说明书操作提取总 ＲNA ，
DEPC水溶解，取少量样品进行紫外分光光度计定
量和琼脂糖凝胶电泳分析，－ 80 ℃保存。取 1 μg
总 ＲNA 在 20 μl 体系中逆转录合成 cDNA，逆转录
体系包括总 ＲNA 1 μg、引物 oligo(dT)18 1 μl、5 ×
Ｒeaction buffer 4 μl、ＲNase inhibition 1 μl、10 mmol /
L dNTP Mix 2 μl、Ｒeverse Transcriptase1 μl、加水至
20 μl，逆转录条件 42 ℃1 h，70 ℃5 min，取 2 μl cD-
NA产物在 25 μl 反应体系中进行 PCＲ 仪中扩增，
β － actin作为内对照，引物序列、大小及退火温度见
表 1。PCＲ反应体系包括 cDNA 产物 2 μl 、上游引
物和下游引物各加 1 μl、2 × PCＲ mix 12． 5 μl 、水 8． 5
μl ，混匀离心，放进梯度 PCＲ仪，按以下条件扩增，94
℃预热 3 min，94 ℃ 3 s，59． 1 ℃(bax)、64． 2 ℃(bcl －
2)、61． 8 ℃(β － actin)3 s、72 ℃1 min，共 30 个循环。
PCＲ产物在 1． 5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，并用
Gene凝胶成像系统进行照相及半定量分析。
表 1 被检测基因所使用的引物序列
Table 1 Sequence of primers of target genes
基因 引物序列 大小 /bp T /℃
Bax 5’primer tttgc ttcag ggttt catcc 359 59． 1
3’primer ggagg aagtc caatg tccag
Bcl － 2 5’primer ggatg ccttt gtgga actgt 329 64． 2
3’primer attcg acgtt ttgcc tgaag
β － actin 5’primer gaaaa tctgg ccacc cacct 141 61． 8
3’primer ggggt gttga aggtc tcaaa
·164·山西医科大学学报，2014 年 6 月，第 45 卷 第 6 期
1． 3 统计学分析
数据用 珋x ± s 表示，各组间均数比较采用单因素
方差分析，P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 乳浆大戟提取物对 A549 细胞增殖的影响
MTT法检测结果显示，用不同浓度乳浆大戟提
取物处理细胞，细胞增殖被抑制，各时点各剂量组与
对照组均差异有统计学意义，最大抑制率达 46． 3%
(见表 2)。
表 2 MTT法测乳浆大戟提取物对 A549 细胞生长的抑制作用 (n = 18，珋x ± s)
Table 2 Inhibition effect of extracts of Euphorbia esula on proliferation of A549 cell by MTT assay (n = 18，珋x ± s)
分组
24 h 48 h 72 h
吸光度 IＲ /% 吸光度 IＲ /% 吸光度 IＲ /%
0 g /L 0． 392 ± 0． 025 0． 605 ± 0． 055 0． 956 ± 0． 077
0． 2 g /L 0． 356 ± 0． 031* 9． 3 ± 3． 5 0． 376 ± 0． 033* 37． 8 ± 3． 5 0699 ± 0． 107* 27． 1 ± 6． 5
0． 4 g /L 0． 342 ± 0． 055* 13． 8 ± 8． 3△ 0． 352 ± 0． 042* 41． 9 ± 2． 6△ 0． 523 ± 0． 038* 45． 2 ± 1． 6△
0． 8 g /L 0． 318 ± 0． 033* 19． 2 ± 3． 9△ 0． 326 ± 0． 046* 46． 3 ± 3． 2△ 0． 542 ± 0． 022* 43． 1 ± 2． 8△
与对照组(0 g /L)相比，* P ＜ 0． 05;与 0． 2 g /L组相比，△P ＜ 0． 05
2． 2 乳浆大戟提取物对 A549 细胞形态的影响
倒置相差显微镜下观察对照组细胞饱满呈梭
形，胞质丰富，大小均一，单层贴壁生长，处理组的细
胞减少，细胞间隙增大，贴壁状态差，细胞变圆，细胞
膜皱缩，折光性小，细胞脱落明显(见图 1)。
图 1 乳浆大戟提取物作用 A549 细胞 48 h的细胞形态变化 (× 100)
Figure 1 Morphology of A549 cells after treated with 0． 8 g /L extracts of Euphorbia esula for 48 h (× 100)
Hoechst33528 和 PI 染色结果显示，正常对照组
细胞的细胞核呈完整椭圆形，细胞数目多，几乎无凋
亡细胞;与对照组相比，处理组细胞核皱缩变形，细
胞数目明显减少，细胞体积变小、变圆，细胞核出现
固缩，呈致密强荧光(图 2，见第 548 页)。
2． 3 乳浆大戟提取物对 A549 细胞凋亡的影响
流式细胞仪结果显示，不同浓度的乳浆大戟提
取物作用 A549 细胞 48 h 后，可以诱导细胞凋亡，随
着药物浓度的增加，凋亡率增大，各个处理组的细胞凋
亡率与正常对照组细胞相比有差异(P ＜0． 05，见表 3)。
表 3 乳浆大戟提取物作用 A549 细胞 48 h 的凋亡率
(n = 3，珋x ± s)
Table 3 Effect of extracts of Euphorbia esula on apopto-
sis of A549 at 48 h by flow cytometry (n = 3，
珋x ± s)
组别 凋亡率 /%
0 g /L组 5． 33 ± 0． 67
0． 2 g /L组 15． 53 ± 0． 15*
0． 4 g /L组 21． 42 ± 1． 01*
0． 8 g /L组 46． 57 ± 1． 76*
与对照组(0 g /L)相比，* P ＜ 0． 05
·264· J Shanxi Med Univ，Jun 2014，Vol 45 No 6
2． 4 乳浆大戟提取物对 A549 细胞线粒体膜电位
的影响
荧光显微镜下观察可见对照组细胞呈红色，表明
线粒体膜电位正常，而处理组细胞多数呈绿色，表明线
粒体膜电位下降，细胞凋亡，说明线粒体途径参与乳浆
大戟提取物诱导的细胞凋亡(图 3，见第 548页)。
2． 5 bax和 bcl － 2 的 mＲNA表达
ＲT － PCＲ 结果显示，乳浆大戟提取物处理
A549 细胞，bax 的 mＲNA 表达的逐渐增加，bcl － 2
的 mＲNA表达逐渐减弱(图 4A)。以内参照 β － ac-
tin校正，以校正值为基因的表达丰度，bcl － 2 和 bax
的 mＲNA表达呈剂量 －反应关系(图 4B)。
图 4 乳浆大戟提取物对 A549 细胞的 bax、bcl － 2 mＲNA表达水平的影响
Figure 4 Effect of extracts of Euphorbia esula on mＲNA expression of bax and bcl － 2 in A549 cells by ＲT-PCＲ
3 讨论
我国的中草药资源丰富，而且中草药具有有效
成分多、结构多样、抗癌谱广、副作用小、开发成本低
等特点，日益受到国内外医药界的关注［7 － 9］。进入
新世纪以来，在回归大自然的观念和医疗模式转换
的影响下，对天然药物的探索与研究更加受到青睐，
从天然产物中寻找保健预防和治疗疾病的有效成分
已经成了国际上的大潮流。有不少学者认为，天然
药物今后将会逐渐成为医药市场的主流［10 － 12］。
乳浆大戟(Euphorbia esula L．)是一种并不多见
的植物，根据中国植物志［13］，乳浆大戟又称猫眼草
(中国高等植物图鉴) ，乳浆草(北京植物志) ，华北
大戟(秦岭植物志) ，新疆大戟(中国沙漠植物志) ，
太鲁阁大戟(台湾植物志) ，岷县大戟(云南植物研
究) ，宽叶乳浆大戟(东北草本植物志) ，东北大戟，
松叶乳汁大戟等。乳浆大戟为多年生草本，是国产
大戟属植物中分布最广、变异幅度最大的种之一，分
布于全国大部分地区，除海南、贵州、云南和西藏外。
乳浆大戟全草入药，具拔毒止痒之效。
我们采集乳浆大戟的地上全草，提取水溶性组
分，经除菌过滤后，用人肺癌细胞 A549 作抑制细胞
增殖和活力的 MTT 实验、PI 和 Hoechst33528 染色
观察细胞形态学改变、JC － 1 染色检测细胞线粒体
膜电位改变、并用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结
果显示，乳浆大戟提取物能抑制 A549 细胞的增殖，
具有剂量效应关系，随着时间延长，抑制作用增强，
最大抑制率为 46． 3%;显微镜下观察，乳浆大戟提
取物处理后的 A549 细胞出现凋亡细胞的形态特
征;JC － 1 染色显示细胞线粒体膜电位下降，流式细
胞检测结果显示乳浆大戟提取物可以诱导 A549 细
胞凋亡，凋亡率可达 48． 4%。
我们进一步做了乳浆大戟提取物诱导细胞凋亡
作用机制的初步研究，ＲT － PCＲ 结果显示，人肺癌
A549 细胞中 bax表达上调、bcl － 2 表达下调，bax 和
·364·山西医科大学学报，2014 年 6 月，第 45 卷 第 6 期
bcl － 2 是细胞凋亡的重要调节因子，参与线粒体凋
亡通路的调节。有研究表明，线粒体膜电位降低是
细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一［14］。
线粒体膜电位下降与线粒体膜通透性(MPT)改变
有关，MPT允许水和溶质进入基质，引起线粒体的
膨胀，内膜的膨胀导致外膜的破裂，从而使 Cyt C、
smac /Diabod、AIF等与细胞凋亡有关的重要因子释
放到胞质中［l5］，使细胞整体结构破坏、功能紊乱，发
生凋亡。bcl － 2 能稳定细胞及线粒体膜，阻止细胞
色素 C 释放进入胞质而抑制细胞凋亡，bax 以二聚
体或多聚体形式结合到线粒体膜上，改变膜的通透
性，引起细胞色素 C释放进入胞质，激活 Caspase 级
联反应，导致细胞凋亡［16］。综上所述，乳浆大戟提
取物可能是通过线粒体途径，上调 bax 的表达、下调
bcl － 2 表达从而诱导 A549 细胞发生凋亡。
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作者简介: 王爱红，女，1973 － 04 生，博士，副教授，E －
mail: aihong － wang@ sohu． com．
［收稿日期: 2014 － 01 － 24］
·464· J Shanxi Med Univ，Jun 2014，Vol 45 No 6
王爱红，等:乳浆大戟提取物对人肺癌细胞生长的影响 (正文见第 460 页)
WANG Aihong，et al:Effect of extracts of Euphorbia esula on proliferation of human lung cancer cells
(see page 460)
A，A为对照组;B，B为乳浆大戟处理组(0． 2 g /L，48 h) ;C，C为乳浆大戟处理组(0． 4 g /L，48 h) ;D，D为乳浆大戟
处理组(0． 8 g /L，48 h)
图 2 乳浆大戟提取物作用 A549 细胞 48 h的细胞核染色质形态变化 (× 100)
Figure 2 Effects of on morphology of cell nuclear of A549 cells after treated with different concentrations of extracts of Eu-
phorbia esula for 48 h (× 100)
图 3 乳浆大戟提取物作用 A549 细胞 48 h的线粒体膜电位变化 (JC － 1 染色，× 200)
Figure 3 Changes of mitochondrial membrane potential of A549 cells after treated with extracts of Euphorbia esula for 48 h
(JC － 1 staining，× 200)
·845· J Shanxi Med Univ，Jun 2014，Vol 45 No 6