全 文 ： 第 28卷 第 4期
2010年 11月
贵州师范大学学报(自然科学版)
JournalofGuizhouNormalUniversity(NaturalSciences)
Vol.28.No.4
Nov2010
文章编号:1004— 5570(2010)04-0021-04
大叶藓属(Rhodobryum)植物组织培养研究＊
梁红柱 ,郭晓莉 ,赵建成＊
(河北师范大学 生命科学学院 ,河北 石家庄 050016)
摘要:研究以采自河北省境内的大叶藓(Rhodobryumroseum)为实验材料 , 探讨了不同培养基 、不同培养条件对其
配子体组织培养的影响 ,以期对大叶藓属植物组织培养研究和快速繁殖技术提供科学依据。 结果表明:茎尖片
段培养的原丝体和新芽生成比例明显高于叶片片段 , 采用茎段更适合于大叶藓的配子体组织培养;适度的 Na-
ClO溶液消毒外植体利于大叶藓配子体组织培养;6-BA抑制了大叶藓原丝体的生成 , 2, 4-D则有明显的促进作
用 , 6-BA促进了大叶藓愈伤组织和新芽的出现;BG11培养基更适于大叶藓原丝体的萌发和愈伤组织的生成 , 其
他适于大叶藓组织培养的培养基依次为 Knop、改良 Knop、BBM、1/2MS和 MS。
关 键 词:大叶藓;组织培养;原丝体发育
中图分类号:Q949 文献标识码:A
TissuecultureresearchofRhodobryum
LIANGHong-zhu, GUOXiao-li, ZHAOJian-cheng
(ColegeofLifeScience, HebeiNormalUniversity, Shijiazhuang, Hebei050016, China)
Abstract:TheinfluenceofdiferentmediumandcultureconditiontotheRhodobryumroseumgameto-
phytetissuecultivationwasstudiedinthisarticle, whichisexpectedtoprovidescientificbasistothe
tissuecultivationandtherapidreproductiontechniquesofRhodobryum.Theresultsindicatethatthe
ratioofprotonemagerminationandsproutingbythestemfragmentsismuchmorethanthatbytheleaf
fragments, thereforethestemfragmentsaremoreadequateforthegametophytecultivationofRhodobry-
umroseum.SterilizationbyNaClOtothegametophytefragmentsisgoodforthecultivationofRhodobry-
um.6-BAinhibitstheprotonemadevelopmentbutpromotesthecalusandprolification, while2, 4-D
promotestheprotonemadevelopment.BG11 culturemediumisthebestforthegametophytetissuecul-
tivation, theotherusablemediumareKnop, modifiedKnop, BBM, 1 /2MSandMS.
Keywords:Rhodobryumroseum;tissueculture;protonemadevelopment
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＊ 收稿日期:2010-08-20
基金项目:国家自然科学基金资助(30670152);河北师范大学校内青年基金资助(L2007Q19)
作者简介:梁红柱(1977-),男 , 汉族 ,讲师 ,研究方向:植物系统进化 、生理生态学, Email:hongzhuliang@yahoo.com.cn
＊通讯作者:赵建成(1956-), 男 ,汉族 , 教授 ,博士生导师 , 研究方向:植物分类与系统进化 , Email:zhaojiancheng@mail.heb-
tu.edu.cn
DOI :10.16614/j.cnki.issn1004-5570.2010.04.034
0 引言
大叶藓属(Rhodobryum)隶属真藓科 ,其叶大
形深绿色 ,具横生地下根茎 ,地上茎直立或倾立。
叶片生于茎枝顶端 ,蔷薇花形。雌雄异株 ,孢蒴 1
～ 3个丛生 。河北省分布仅一种 , 即大叶藓
(Rhodobryumroseum)。
目前国内外对苔藓植物原丝体发育的研究 ,大
部分是以孢子作为外植体 。日本学者 Nishida先后
研究了 121种藓类植物的孢子萌发和原丝体发育
过程[ 1] ;国内赵建成 、范庆书 、李敏等先后研究了
161种藓类植物萌发孢子型特征 [ 2 -7] ;魏华
(2007)、王丹(2008)、黄士良(2009)等研究了真藓
科等藓类植物原丝体发育特征[ 8-10] 。然而 ,直接
用配子体作为外植体获得再生体系的研究 ,在国内
外偶见报道 [ 11] ,且成功率不高。苔藓植物植株小 ,
密度大 ,种间易杂生 ,不易分离和鉴定 ,难以大量纯
种采集 。因此 ,解决纯培养和快速繁殖的问题显得
尤为重要。
大叶藓属植物配子体的叶片由单层细胞构成 ,
其茎纤细 ,构造简单 ,无维管束 ,这种特殊的构造 ,
使其作为外植体进行组织培养时极易受到伤害 ,这
对其组织培养研究具有一定的难度 。大叶藓具有
清肝明目 、养心安神 、软化冠状动脉等功能 [ 12] 。现
代研究发现 ,大叶藓具有抗心肌缺血 、改善微循环
及抗动脉硬化 、减少内皮细胞受损等功效 ,其含有
的二十二碳二烯酸是种子植物所不能制造
的 [ 13, 14] 。大叶藓属植物配子体再生技术的研究可
以为苔藓植物经典分类学 、生理学 、生态学等领域
的研究提供技术理论支持 ,因此 ,开展大叶藓属植
物配子体再生技术的研究具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 实验材料
选取河北省茅荆坝自然保护区 、阜平等地采集
的大叶藓属植物为供试材料 ,以其剪碎的茎尖 、叶
片片段为组织培养的外植体。
1.2 实验方法
1.2.1 培养基的制备
本研究所用培养基包括 BG11、Knop、改良
Knop、BBM、1/2MS和 MS, pH值为 6.0,培养基中
按实验设计部分添加 6-BA、2, 4-D等植物激素 。
1.2.2 接种和培养
消毒方法 1:外植体置于 1%洗涤灵溶液中浸
泡 3min,然后自来水冲洗 60min,接着在 75%乙醇
中浸泡 3s,再用无菌水漂洗 6次 ,最后在紫外灯下
照射 15min。
消毒方法 2:将外植体在 1%洗涤灵溶液中浸
泡 3min,自来水冲洗 60min,然后在 75%乙醇中浸
泡 3s,接着用 1%NaClO溶液消毒 20s,再用无菌水
漂洗 6次 ,最后在紫外灯下照射 15min。
消毒后的外植体在超净工作台上接种 ,每培养
皿接 5块外植体 ,每组 3个重复;在白天 25℃,夜
晚 22℃,光照 12h/d,光照强度为 2 000 ～ 3 000lx,
相对湿度≥80%的培养条件下 ,置于光照培养箱
中 ,培养 10d和 30d后分别观察结果并拍照记录。
1.3 实验设计
1.3.1 不同消毒方法处理的外植体培养实验
采用 BG11培养基 ,将茎(J)、叶(Y)片段分别
用消毒方法 1和方法 2处理 ,然后将 J1、J2、Y1和
Y2接种于培养基上 ,每皿接种 5块外植体 ,每组 3
个重复。
1.3.2 添加植物激素的外植体培养实验
取茎尖片段作为外植体 ,经方法 2消毒处理
后 ,接种于添加过 2, 4-D和 6-BA的 MS培养基上 ,
分为 4组:J1、J2、J3和 J4,每组 3个重复 。植物激
素添加情况见表 1。
表 1 MS培养基添加植物激素情况表
Tab.1 PhytohormonedistributionintheMSmedium
Groups J1 J2 J3 J4
2, 4-D/(mg/L) 0 0.5 0 0.5
6-BA/(mg/L) 0 0 0.5 1.0
Sucrose/% 0 2.0 2.0 2.0
1.3.3 多种培养基培养实验
将用方法 2消毒后的叶段和茎段分别接种于
以下 6种培养基中:MS、Knop、BG11、BBM、改良
Knop和 1 /2MS,依次设为 Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6
和 J1、J2、J3、J4、J5、J6共计 12个组 ,每皿接种 5块
外植体 ,每组 3个重复 ,培养基中均未添加植物激
素和蔗糖。
2 结果与分析
2.1 不同消毒方法处理外植体的培养实验结果
如图 1和图版 Ⅰ (1-4)所示 , 10d观察 J2和
Y2原丝体生成比例明显高于 J1和 Y1;J2出现原
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贵州师范大学学报(自然科学版) 第 28卷
丝体比例高于 J1, 30d新芽生成比例低于 J1;Y1无
原丝体和新芽生成 , Y2出现原丝体和新芽 ,但新芽
生成比例明显低于原丝体的生成。
图 1 不同消毒方法对原丝体 、新芽萌发的影响
Fig.1 Influenceofdiferentsterilizationwaystothe
germinationofprotonemaandsprouting
2.2 添加植物激素的培养实验结果
由图 2和图 4(5 -12)结果所示 , J2原丝体的
生成比例最高 ,明显高于对照组 J1, J3和 J4原丝
体生成都低于对照组 J1。 J2添加 2, 4-D和蔗糖 ,
所接种外植体 10d全部生成原丝体;J3添加 6-BA
和蔗糖 ,观察结果原丝体生成比例均低于对照组;
J4添加 2, 4-D、 6-BA和蔗糖 , 6-BA的添加量大于
2, 4-D,结果显示 , 30d原丝体生成比例均低于对照
和 J3。
图 2 植物激素对原丝体萌发的影响
Fig.2 Influenceofphytohormoneto
thegerminationofprotonema
2.3 6种培养基培养的原丝体发育结果
如图 3所示 ,叶段外植体(Y)在 6种培养基中
均未生成原丝体;J3原丝体生成比例最高 , 30d后 ,
J2和 J5原丝体的生成比例较高 , J4和 J6较低 , J1
最低。
从与外植体对应的培养基来看 , BG11培养基
对茎段的组织培养效果最好 , Knop和改良 Knop培
养基培养效果较好 , BBM培养基稍差 , 1/2MS培养
基和 MS培养基对大叶藓茎段培养的效果最差 。
图 3 不同培养基对原丝体萌发的影响
Fig.3 Influenceofdifferentmediumto
theprotonemagermination
3 讨论
3.1 不同消毒方法对大叶藓组织培养的影响
由图 1结果可见 ,大叶藓外植体消毒阶段使用
NaClO溶液消毒 ,对大叶藓组织培养更为有利 。苔
藓植物配子体的叶片通常由单层细胞组成 ,而其茎
纤细且结构简单。以苔藓配子体为外植体组织培
养时 ,这种简单的构造通常会使消毒步骤很难掌
握 ,消毒时间过长或者消毒液浓度过大 ,都会严重
损害配子体 ,进而影响组织培养效果;消毒时间过
短或消毒液浓度过低 ,会促进其他菌类或微生物的
繁殖 ,从而影响藓类的组织培养[ 15] 。
本研究参照英国皇家植物园对苔藓配子体外
植体的消毒方法[ 16] ,采用 NaClO溶液消毒 30s。由
图 1结果所示 , NaClO的消毒步骤对大叶藓配子体
组织培养有促进作用 ,从而也验证了英国皇家植物
园的研究结论 。组织培养 30d观察结果发现 , Y1
外植体衰退为黄绿色或近透明 ,均无原丝体和新芽
生成 , Y2生成的原丝体分枝少 ,颜色浅 , J1和 J2生
成的原丝体颜色深 ,分枝多。说明配子体的茎段更
适宜作为大叶藓组织培养的外植体 。
3.2 植物激素对大叶藓组织培养的影响
由图 2结果所示 ,原丝体的生成比例 J3
加 6-BA抑制了原丝体的萌发。这与陈圆圆
(2009)对暖地大叶藓的研究一致[ 17] 。 30d观察培
养结果发现 , J3新芽的生成比例最高 ,明显高于 J1
和 J2(图 4:5-12),这表明添加 6-BA对诱导大叶
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第 4期 梁红柱 , 郭晓莉 ,赵建成:大叶藓属(Rhodobryum)植物组织培养研究
藓新芽的出现具有促进作用。
培养 60d后跟踪观察发现 , J3和 J4分别出现
少量愈伤组织 ,且 J3>J4 ,表明大叶藓配子体组织
培养添加 6-BA能诱导其愈伤组织的形成 ,这与陈
圆圆(2009)等的研究结果一致[ 17] 。
3.3 不同培养基对大叶藓组织培养的影响
如图 3所示 , 6种培养基中 ,最适于大叶藓配
子体组织培养的是 BG11培养基 ,最不适宜的是
MS培养基 。所有培养基中的叶段均未生成原丝
体 ,外植体颜色变淡近透明 ,死亡 。这可能与消毒
过程有关 , NaClO溶液破坏了叶片的单层细胞结
构 ,从这一角度分析 ,以叶片片段作为外植体更易
受到损害 ,因此 ,外植体选取茎段更适宜 。
培养 45d后跟踪观察发现 ,以茎段为外植体的
组织培养体系中 , 6种培养基均出现了新芽 ,其中
BG11中新芽颜色更深 ,原丝体分枝更多 ,其他培养
基次之。从而证实了大叶藓配子体组织培养更适
宜的培养基是 BG11。
1.方法 1消毒的茎段培养 30d结果 J1(×40);2.方法 2消毒的茎段培养 30d结果 J2(×40);3.方法 1消毒的叶段
培养 30d结果 Y1(×40);4.方法 2消毒的叶段培养 30d结果 Y2(×40);5-8:添加植物激素的茎段培养 10d结果
J1-J4(×40);9-12:添加植物激素的茎段培养 30d结果 J1-J4(×100)。
图 4 大叶藓组织培养与原丝体发育
Fig.4 ThecharacteristicsoftissuecultureandprotonemadevelopmentofRhodobryumroseum
4 结论
综上所述 ,在大叶藓配子体组织培养体系中 ,
外植体选用茎尖片段 ,经过消毒方法 2处理 ,接种
于 BG11培养基上 ,添加适量的植物激素 ,保持适
当的培养光照强度和湿度 ,可能更有利于其原丝体
的形成 、新芽的萌发以及愈伤组织的出现 。
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