全 文 ：收稿日期:2013-08-26; 修订日期:2014-01-06
基金项目:国家自然科学基金( No． 81260620) ;
广西自然科学基金创新研究团队项目
( No． 2011GXNSFF018006)
作者简介:周雨晴( 1988-) ，女( 汉族) ，陕西安康人，广西中医药大学在读
硕士研究生，主要从事中药及民族药的鉴定与开发工作．
* 通讯作者简介:朱 华( 1959-) ，男( 壮族) ，广西南宁人，广西中医药大
学教授，博士学位，主要从事中药品种、品质及资源开发研究工作．
拳卷地钱基因组 DNA提取
及 ISSＲ-PCＲ扩增体系优化
周雨晴1，2，杜沛霖1，王跃峰2，3，白燕远1，朱 华1*
(1．广西中医药大学，广西 南宁 5300001;
2．广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室， 广西 南宁 530007; 3．桂林医学院，广西 桂林 541004)
摘要:目的 建立一种拳卷地钱基因组 DNA的提取方法; 对影响拳卷地钱 ISSＲ － PCＲ反应的各因素进行优化，建立稳定
的反应体系。方法 采用改进的 CTAB法提取拳卷地钱基因组 DNA;以 Taq 酶、Mg2 +、dNTP 和引物 4 因素 3 水平的正交
设计对拳卷地钱 ISSＲ － PCＲ反应体系进行优化。结果 采用改进的 CTAB 法提取的拳卷地钱基因组 DNA 质量高，且适
用于 ISSＲ － PCＲ扩增;获得拳卷地钱最佳反应体系( 20 μl) 为: Taq 酶 0． 5 U，Mg2 + 2． 0 mmol /L，dNTP 250 μmol /L，模板
DNA 50ng，引物 0． 6 μmol /L 。结论 建立并优化了拳卷地钱总 DNA 提取方法及 ISSＲ － PCＲ反应体系。
关键词:拳卷地钱; DNA提取; ISSＲ － PCＲ; 正交设计; 体系优化
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 06． 093
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2014) 06-1498-03
Establishment and optimization of genomic DNA extraction and ISSＲ － PCＲ reaction sys-
tem for Marchantia convoluta
ZHOU Yu － qing1，2，DU Pei － lin1，WANG Yue － feng2，3，BAI Yan － yuan1，ZHU Hua1*
( 1． Guangxi University of Chinese Medicine，Guangxi Nanning 530001，China; 2． Guangxi Crop Genetic Improve-
ment and Biotechnology Laboratory，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Guangxi Nanning 530007，Chi-
na; 3． Guilin Medical University，Guilin 541004，China)
Abstract: Objective To establish a method for genomic DNA extraction of Marchantia convoluta; to establish and optimize the
ISSＲ － PCＲ reaction system for Marchantia convoluta． Methods A modified CTAB method was applied to extract genomic DNA
from Marchantia convoluta and the orthogonal design was applied to optimize ISSＲ － PCＲ reaction system in three levels of four
factors ( Taq DNA polymerase，Mg2 +，dNTP，primer) ． Ｒesults The effects of the improved CTAB method worked well，and the pu-
rity of DNA was high． An optimum ISSＲ － PCＲ reaction system was established for Marchantia convoluta and the 20 μl ISSＲ －
PCＲ system contained 50ng of the template DNA，2． 0 μl of PCＲ buffer，0． 5 U of Taq polymerase，250μmol /L dNTP mix，2．
0mmol /L of Mg2 +，0． 6 μmol /L of primers． Conclusion a method for genomic DNA extraction of Marchantia convoluta was estab-
lished and the ISSＲ － PCＲ reaction system was optimized．
Key words: Marchantia convoluta; DNA extraction; ISSＲ － PCＲ; Orthogonal design; Ｒeaction system optimization
拳卷地钱 Marchantia convoluta Gao et Chang为苔藓植物门苔
纲地钱科(Marchantianceae)植物，始载于《西藏苔藓植物志》，广
泛分布在西藏、广西、贵州等高寒山区［1］，是苔藓植物中常见的
中草药之一，常用其外治烫伤骨折、体癣、疮病不敛，内治黄疸性
肝炎，获得了较好的疗效［2，3］。另，民间用药调查发现其也用于
退烧，效果显著。目前国内外对拳卷地钱的研究集中于显微鉴
别、化学成分、药效研究等［4 ～ 6］，分子遗传学水平上的研究则少见
报道。近年来由于人类活动的破坏，加之植物本身对环境的要求
苛刻，其野生资源正日渐匮乏，濒临危机。因此，对拳卷地钱遗传
多样性进行研究，进而为其野生资源保护及开发提供支撑，就显
得尤为迫切。ISSＲ(Inter － Simple Sequence Ｒepeat)分子标记技
术是由加拿大蒙特利尔大学的 Zietkiewicz 等于 1994 年提出，综
合了其他分子标记技术的优点，具有高多态性、可重复性、稳定
性、成本低、易操作及不需要先进行 DNA 测序等优点［7］，已被广
泛用于药用植物的遗传多样性研究、品种鉴别、良种选育、基因定
位及资源分类等方面［7 ～ 10］。
DNA 提取是 ISSＲ分子标记技术极为重要的工作。本实验
采用改良的 CTAB法，期望建立一种适用于拳卷地钱 DNA 的高
效提取方法。由于 ISSＲ 反应易受 Mg2 +、引物、dNTPs 及 TaqDNA
聚合酶浓度等多种因素的综合影响，因此，有必要建立一个最佳
反应体系。本实验利用改良的 CTAB 法提取的样品基因组 DNA
为模板对拳卷地钱 ISSＲ － PCＲ 反应体系进行了优化，为后期种
群遗传多样性、品种鉴定及资源保护等研究奠定基础。
1 材料
拳卷地钱幼嫩叶状体于 2012 年 11 月 24 日采自广西南宁市
高峰林场，经广西中医药大学药用植物教研室韦松基教授鉴定为
拳卷地钱 Marchantia convoluta Gao et Chang． 原植物。洗净后置
于 － 20 ℃冰箱保存备用。
PCＲ 仪(美国 Bio － Ｒad 伯乐公司，Model:PTC － 200);DYCP
－ 34 型电泳槽(北京市六一仪器厂);CDYY －6C型电泳仪(北京
市六一仪器厂);UVP 凝胶成像系统。MgCl2、dNTPs、Taq DNA 聚
合酶等均购于宝生物工程(大连)有限公司;引物由生工生物工
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程(上海)有限公司合成，经初步筛选以引物 UB834［(AT)8YT］
作为此次正交试验的引物。
2 方法
2． 1 拳卷地钱基因组 DNA 提取 本实验参考改良的 CTAB
法［11］提取基因组基因组 DNA。方法适当改进如下:①剪取 1 ～ 2
g拳卷地钱叶状体放在研钵中，加 PVP适量，加液氮研磨成粉末;
②将粉末转入 2． 0 ml离心管中，加入 800 μl 2% CTAB 缓冲液混
匀，③65℃水浴 50 min，每隔 10 min 振摇一次;④取上清液转至
新离心管中，加入 1 000 μl的氯仿∶ 异戊醇(24∶ 1)，颠倒混匀，
10 000 r /min离心 5 min;⑤取上清液转至新离心管中，加入等体
积的氯仿∶ 异戊醇(24∶ 1)，颠倒混匀，10 000 r /min离心 5 min;
⑥取上清液加入 2 倍体积经 － 20 ℃预冷的无水乙醇混匀，－ 20
℃冰箱沉淀 DNA 30 min。⑦4 ℃ 10 000 r /min离心 10 min，弃上
清，沉淀用 70%乙醇漂洗 2 次，⑧室温干燥后 DNA 溶于 200μl 1
倍的 TE中。4 ℃ 贮存备用。
2． 2 拳卷地钱基因组 DNA检测 使用 1． 5% 琼脂糖凝胶电泳和
紫外分光光度计检测 DNA纯度与浓度，并将提取的 DNA稀释到
50 ng /μl备用。
2． 3 拳卷地钱 ISSＲ － PCＲ扩增体系正交设计优化 对影响 ISSＲ
－ PCＲ反应的 Taq聚合酶、Mg2 +、dNTP、引物浓度的 4 个主要因
素进行 4 因素 3 水平的正交设计 L9(34)，四因素水平和正交试
验设计分别见见表 1、表 2。以拳卷地钱 1 号的 DNA 为模板，加
样 50 ng，引物为 UB834((AT)8YT) ，总反应体积为 20μl(均含
2μl的 10 × PCＲ buffer)。扩增程序:95 ℃预变性 5 min;95 ℃变
性 55s、53 ℃退火 1 min、72 ℃延伸 1． 5 min，循环 40 次;72 ℃终
延伸 10 min，4 ℃保存。
扩增产物以 2 000 bp Ladder Plus Marker 为分子量标记，每
管加入 5μl 有核酸染料的 6 × Loading Buffer 充分混匀，取 10 μl
在 2． 0 % 琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统上检测并拍
照。
2． 4 PCＲ产物扩增统计分析 参照何正文［12］等的方法，通过直
观分析，根据谱带的条带数量和明亮度对扩增结果进行打分。运
用新复极差法(SSＲ法)［13］对扩增结果进行分析，得到拳卷地钱
ISSＲ － PCＲ单因素反应条件的最高分值。
表 1 拳卷地钱 ISSＲ体系的因素 －水平
水平
因素
Mg2 +浓度 /
mmmol·L －1
dNTP /
μmol·L －1
Taq 聚合酶 /
U
引物 /
μmol·L －1
1 1． 2 150 0． 5 0． 4
2 1． 6 200 0． 75 0． 5
3 2． 0 250 1． 0 0． 6
表 2 拳卷地钱 ISSＲ正交实验设计表 L9(34)
编号
因素
Taq 聚合酶
/U
Mg2 +浓度
/mmol·L －1
dNTP
/μmol·L －1
引物
/μmol·L －1
1 0． 5 1． 2 150 0． 4
2 0． 5 1． 6 200 0． 5
3 0． 5 2． 0 250 0． 6
4 0． 75 1． 2 200 0． 6
5 0． 75 1． 6 250 0． 4
6 0． 75 2． 0 150 0． 5
7 1． 0 1． 2 250 0． 5
8 1． 0 1． 6 150 0． 6
9 1． 0 2． 0 200 0． 4
3 结果
3． 1 DNA电泳检测 拳卷地钱基因组 DNA 结果见图 1，基因组
DNA条带整齐，无降解、无 ＲNA 污染、无弥散的荧光出现、加样
孔清晰。紫外分光光度计检测结果，OD260 /280在 1． 6 ～ 1． 9 之间，
浓度均不低于 140 ng /μl(见表 3)，说明该拳卷地钱基因组 DNA
提取方法纯度和浓度都较高，符合以下实验对拳卷地钱基因组
DNA的要求。
图 1 拳卷地钱基因组 DNA 电泳图
表 3 拳卷地钱 OD值及浓度检测
检测指标 1 2 3 4 5 6
OD260 /280 1． 65 1． 82 1． 72 1． 88 1． 69 1． 78
C /ng·ml －1 144 151 149 201 186 163
3． 2 拳卷地钱 ISSＲ － PCＲ扩增结果分析 拳卷地钱 ISSＲ － PCＲ
扩增产物电泳结果见图 2，图中 9 个处理扩增出的条带数和明亮
度进行打分，明亮记 3 分，亮记 2 分，暗记 1 分，无条带记 0 分。
结果见表 4。
采用新复极差法(SSＲ法)对 9 个处理的条带数和明亮度进
行分析，得到拳卷地钱 ISSＲ － PCＲ 单因素反应条件的最高分值
(见表 5)。
3． 2． 1 dNTP浓度对 ISSＲ － PCＲ 扩增结果的影响 由表 3 可看
出，dNTP浓度为 200 μmol /L时，平均分值最低，11 分;dNTP浓度
为 250 μmol /L时，平均分值最高，14 分;说明 250 μmol /LdNTP浓
度为拳卷地钱 PCＲ反应的适宜浓度。
图 2 扩增产物电泳图
表 4 拳卷地钱 ISSＲ正交优化组合扩增结果
序号 组合
条带数
明亮 亮 暗
总赋值
1 A1B1C1D1 2 1 4 12
2 A1B2C2D2 2 1 4 12
3 A1B3C3D3 3 2 2 15
4 A2B1C2D3 2 3 2 14
5 A2B2C3D1 1 3 4 13
6 A2B3C1D2 1 1 7 12
7 A3B1C3D2 1 2 5 12
8 A3B2C1D3 3 2 3 16
9 A3B3C2D1 1 0 3 6
3． 2． 2 引物浓度对 ISSＲ － PCＲ 扩增结果的影响 引物浓度为
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 6 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 6 期
0． 4 μmol /L时，平均分值最低，11 分;引物浓度为 0． 6 μmol /L时，
平均分值最高，15 分;说明 0． 6 μmol /L引物浓度为拳卷地钱 PCＲ
反应的适宜浓度。
3． 2． 3 Mg2 +浓度对 ISSＲ － PCＲ 扩增结果的影响 Mg2 +浓度为
2． 0 mmol /L 时，平均分值最低，11 分;Mg2 + 浓度为 1． 6 mmol /L
时，平均分值最高，14． 67 分;说明 1． 6 mmol /L Mg2 +浓度为拳卷
地钱 PCＲ反应的适宜浓度。
表 5 极差分析结果
水平
Taq 聚合酶 (A)
总分 平均分
Mg2 +(B)
总分 平均分
dNTP (C)
总分 平均分
引物 (D)
总分 平均分
1 40 13． 33 38 12． 67 40 13． 33 33 11
2 41 13． 67 44 14． 67 33 11 37 12． 33
3 37 12． 33 33 11 42 14 45 15
极差 4 1． 33 11 3． 67 9 3 12 4
3． 2． 4 Taq酶浓度对 ISSＲ － PCＲ 扩增结果的影响 Taq 酶浓度
为 1． 0 U时，平均分值最低，12． 33 分;Taq酶浓度为 0． 75U时，平
均分值最高，13． 67 分;说明 0． 75U Taq 酶浓度为拳卷地钱 PCＲ
反应的适宜浓度。
3． 3 ISSＲ － PCＲ 最优体系分析 采用极差法对正交试验中各单
因素进行分析，适合拳卷地钱 PCＲ 反应的最佳处理组合为:
A2B2C3D3，即:dNTP 浓度为 250 μmol /L，模板 DNA 浓度为 50
ng，引物浓度为 0． 6 μmol /L，Mg2 +浓度为 1． 6 mmol /L，Taq酶浓度
为 0． 75 U。由此得出，拳卷地钱 ISSＲ － PCＲ 扩增体系的最佳处
理组合为:20 μl的总反应 体 系 中 含 10 × PCＲ Buffer 2． 0 μl、
浓度为 250μmol /L dNTP、1． 6 mmol /L Mg2 +、0． 6 μmol /L 引物、
0． 75 U Taq DNA 聚合酶、50 ng 模扳 DNA。利用该优化体系，对
其他引物进行筛选，得到了多态性高，清晰明亮的条带。结果表
明，该体系具有可靠的应用价值。
4 讨论
DNA提取是进行分子生物学实验的先决条件，模板 DNA 的
含量是制约扩增产物稳定性及特异性的一个重要因素，往往影响
PCＲ的成功。拳卷地钱是苔藓植物中常见的一种，属于多酚多糖
多色素类植物，在提取过程中 DNA 容易被多酚氧化酶和细胞色
素氧化酶所降解，这就给 DNA的提取带来困难，本实验在改良的
CTAB 法中加入 2%的 PVP － 40，使酚类化合物和细胞色素的结
构更稳定，也使酚类化合物和细胞色素因多酚氧化酶及细胞色素
氧化酶的失活而不能形成复合物;在抽提过程中更易去除，提高
了 DNA 的纯度;另在离心操作中降低离心速度到 10 000 r /min，
避免了由于震荡而造成的 DNA 断裂，大大提高了基因组的完整
性。本实验表明改良的 CTAB 法提取苔藓植物拳卷地钱的 DNA
质量好且效率高，能满足 ISSＲ分子遗传学研究。
不同物种的 ISSＲ反应条件有所不同。因此，不同的物种采
用 ISSＲ分子标记技术时，其反应体系必须进行筛选优化。ISSＲ
体系优化的方法有多种，正交设计是研究多因素水平的一种具有
均衡分散、综合可比以及可伸缩性强，效用明确的特性［10］的高效
率、快速、经济的实验设计方法。本实验利用极差法对正交试验
结果进行分析，使试验过程简化，结果更加客观准确。从实验设
计到结果分析，都有鲜明的系统性和科学性，结果稳定、重复性
好，也节省了时间和经济成本。
目前，国内有关拳卷地钱分子标记研究较少。笔者率先对拳
卷地钱 DNA提取和 ISSＲ － PCＲ反应体系进行优化试验，并确定
其最佳反应体系。为今后利用 ISSＲ － PCＲ 技术对拳卷地钱进行
品种鉴定、遗传分析、资源保护等研究提供一定的理论基础。
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