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HPLC法同时测定遍地金中4种黄酮类成分的含量



全 文 :湖 北 农 业 科 学 2014 年
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收稿日期:2014-05-29
基金项目:青海省自然科学基金项目(2011-Z908)
作者简介:邱海洋(1984-),男,陕西绥德人,研究方向为药学,(电话)18797396002(电子信箱)961749321@qq.com;通讯作者,林鹏程(1966-),
男,教授,硕士生导师,主要从事藏药化学成分及质量控制研究,(电话)0971-8804649(电子信箱)qhlpc@126.com。
金丝桃属植物在抗抑郁、抑制中枢神经、抗肿
瘤和抗病毒 [1-3]方面的突出作用, 使得该属植物的
研究受到国内外普遍关注[4]。 遍地金(Hypericum wigh-
tianum)为藤黄科金丝桃属多年生草本植物,分布于
云南、四川、贵州、西藏等地,有收敛止血、清热解毒
的功效,民间用于治疗小儿炎症、久痢、久泻、毒蛇
咬伤等疾病[5]。近期研究发现,该植物具有明显的抗
抑郁作用[6],该作用不仅与金丝桃素含量有关,还与
植物中所含其他成分相关[7]。 已有对该植物化学成
分及分析方法的报道 [8],但未见对该植物中槲皮素、
HPLC法同时测定遍地金中 4种黄酮类成分的含量
邱海洋 1,林鹏程 1,2,马建滨 2,3,姚 晶 1,2,曾擎屹 1,2
(1.青海民族大学,西宁 810007;2.青海省青藏高原植物化学研究重点实验室,西宁 810007;3.青海师范大学,西宁 810001)
摘要:建立同时测定遍地金(Hypericum wightianum)药材中槲皮素、槲皮苷、木犀草素、山奈酚含量的高效
液相色谱分析方法。 采用 Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,检测波长 360 nm,柱
温 30 ℃,槲皮素、槲皮苷、木犀草素、山奈酚线性范围分别为 0.078~2.340 μg、0.106~3.180 μg、0.04~1.200
μg、0.062~1.860 μg;遍地金中槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分别为 0.385%、0.022%、0.012%和
0.111%,该方法简便快速、准确实用。
关键词:遍地金(Hypericum wightianum);高效液相色谱法;槲皮素;槲皮苷;木犀草素;山奈酚
中图分类号:O657.32; 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2014)16-3898-03
Simultaneously Determing of Four Flavonoids in Hypericum wightianum with HPLC
QIU Hai-yang1, LIN Peng-cheng1,2,MA Jian-bin2,3,YAO Jing1,2,ZENG Qing-yi1,2
(1.College of Chemistry and Life Science , Qinghai Nationality University, Xining 810007, China;
2.Key Laboratory of Plant Resources of Qinghai-Tibet Plateau in Chemical Research, Xining 810007,China;
3.Department of geography and Life Science , Qinghai Normal University, Xining 810008, China)
Abstract:To simultaneously determine the contents of quercitrin,quercetin,luteolin and kaempferol in harb Hypericum
wightianum, the samples were separated on the column of Kromasil C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm) eluted with methanol and
water (0.04% phosphoric acid). The sample size was 10 μL. The wavelength uesd was 360 nm and column temperature was
30℃. The linear ranges of quercitrin, quercetin ,luteolin and kaempferol were 0.078-2.340 μg,0.106-3.180 μg, 0.040-1.200
μg and 0.062-1.860 μg, respectively. The contents of four flavonoids from seven different areas in Qinghai province and
different organs were 0.385%,0.022%,0.012% and 0.111%. The method was rapid and accurate.
Key words:Hypericum wightianum;HPLC;quercitrin;quercetin; luteolin;kaempferol
第 53 卷第 16 期
2014年 8 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol. 53 No.16
Aug.,2014
第 16 期
槲皮苷、木犀草素、山奈酚含量同时测定的报道。试验
建立了同时测定上述 4 种成分含量的 HPLC 方法,
为该资源后续开发利用及为新药源研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料 遍地金:2011 年采自西藏林芝地区,
阴干后粉碎备用 。 所用标准品槲皮苷 (批号 :
111538-200403)、槲皮素 (批号 :100081-200406)、
木犀草素 (批号 :111520-200201)、山奈酚 (批号 :
110861-200707)均购自中国药品生物制品检定所。
色谱纯甲醇为高效液相色谱专用试剂(山东禹王实
业有限公司禹城化工厂);水为娃哈哈纯净水;磷酸
为 AR级(天津市红岩试剂厂)。
1.1.2 仪器 Agilent 1200 型高效液相色谱仪 (美
国安捷伦科技有限公司)、AG204 型电子分析天平
(南京安铎贸易有限责任公司)、SHB—Ⅲ型循环水
式多用真空泵(上海科兴仪器有限公司)、EYEL4 型
旋转蒸发仪(日本东京理化器械株式会社)。
1.2 试验方法
1.2.1 色谱条件 色谱柱 :Eclipse XDB-C18(4.6
mm×250 mm,5 μm)柱。 流动相:甲醇(A)-0.2%的磷
酸水(B),流动相在 30 min 内甲醇由 35%线性增加
至 65%。 流速 1.0 mL/min;柱温 30 ℃,检测波长 360
nm;进样量 10 μL。
1.2.2 样品溶液的制备 分别精密称取经五氧化
二磷干燥过夜的槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚
标准品适量, 用色谱纯甲醇分别配置成 0.78、1.06、
0.40、0.62 mg/mL的储备液。
1.2.3 供试品溶液的制备 精密称取地黄金粉末
1.014 g,置于三角瓶中,精密加入 20 mL 甲醇,密封
室温下浸泡 2 h, 超声波处理 2 h, 冷却至室温,称
重,用甲醇补足减少的重量,移至 25 mL 容量瓶甲
醇定容,测加标回收率。
2 结果与分析
2.1 色谱图结果
对照品和样品色谱图见图 1。由图 1可知,槲皮
苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚保留时间分别为15.1、
22.1、27.1 min 和 28.2 min, 遍地金中的槲皮素和山
奈酚含量较高,槲皮苷和木犀草素较低。
2.2 标准曲线及线性范围
取标准品储备液稀释 10 倍后在选定的色谱条
件下分别进样 1、5、10、15、20、30 μL, 以进样量(X)
为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标做一元线性回归,4
种黄酮类物质标准曲线分别为 Y=1 807X-41.85、Y=
3 309X-18.23、Y=2 363X-19.09、Y=3 246X-7.84,线
性范围分别为:0.078~2.34 μg、0.106~3.18 μg、0.04~
1.2 μg、0.062~1.86 μg,线性相关系数分别为 0.999 6、
0.999 7、0.999 7、0.999 8。
2.3 精密度试验结果
量取标准品 10 μL,在选定的色谱条件下测定 5
次,得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面积
的 RSD分别为 0.97%、0.91%、1.1%、0.81%, 表明仪
器精密度良好。
2.4 重复性试验结果
样品溶液在选定的色谱条件下进样 10 μL,重
复测定 5 次,得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈
酚峰面积的 RSD分别为 1.6%,1.7%,1.2%,1.6%,表
明重复性良好。
2.5 稳定性试验结果
取“1.2.3”中样品溶液,分别放置 0、2、4、6、12 h
后在“1.2.1”色谱条件下进样,每次进样 10 μL,得到
槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面积的 RSD 分
别为 1.6%、1.4%、1.4%、1.7%,表明供试溶液在 12 h
内稳定。
2.6 加标回收率试验结果
精密称取遍地金粉末 0.5 g共 3份, 分别添加
标准品溶液:槲皮苷(0.78 mg/mL)2.28 mL、槲皮素
图 1 对照及样品色谱图
1.槲皮苷 2.槲皮素 3.木犀草素 4.山奈酚
100
0
10 15 20 25 30
保留时间//min
m
AU
1
2
3
4
a.对照品
50
0
10 15 20 25 30
保留时间//min
m
AU
1
2
4
b. 样品
3
邱海洋等:HPLC 法同时测定遍地金中 4 种黄酮类成分的含量 3899
湖 北 农 业 科 学 2014 年
(责任编辑 龙小玲)
组相较空白对照组和产 VE 对照组提高并不多,优
化效果不明显,推测可能与 PDA 培养基作基本培养
基有关, 与察氏培养基相比,PDA 培养基中营养成
分更全面复杂一些; 从试验中测得的 VE 的含量来
看,比前期试验结果要低很多,推测其原因可能是
提取剂和提取方法的影响。 产 VA 和 VE 的最适添
加氮源分别为硝酸钠和蛋白胨。
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(上接第 3894页)
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(1.06 mg/mL)溶液 0.11 mL、木犀草素(0.40 mg/mL)
溶液 0.15 mL、 山奈酚 (0.62 mg/mL)0.90 mL,按
“1.2.3”操作,测得加标回收率分别为槲皮苷 99.6%、
槲皮素 96.4%、木犀草素 98.6%、山奈酚 102.7%,说
明准确程度良好。
2.7 样品测定
按选定的色谱条件测定遍地金样品中 4 种黄
酮类成分的含量,进样量 10 μL,以外标法定量,测
得槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分别为
0.385%、0.022%、0.012%和 0.111%。
3 小结与讨论
本试验采用反相高效液相色谱法测定遍地金
中 4 种黄酮类成分槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈
酚 的 含 量 分 别 为 0.385% 、0.022% 、0.012% 和
0.111%,该方法具有操作简便,准确度高,重复性好
等优点,对该资源的评价、开发利用以及新药源研
究具有一定的现实意义。
试验前期比较了甲醇、乙醇、水等不同溶液作
为提取剂,结果以甲醇提取的黄酮含量较高,色谱
峰形较佳,分离效果较好。 考虑超声波提取方法简
单,耗时少,所以选择超声波提取法,而没有选择热
回流法。试验所测的 4种黄酮成分在 260 nm 和 360
nm 处均有较大吸收,但 260 nm 处干扰较大,故选择
360 nm 做检测波长。
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(责任编辑 龙小玲)
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