全 文 ：图 4　不同模板纯度
1 、2 、3是模板粗提液;4、5 、6常规方法模板提取液。
Fig.4　Different purity of template
1 , 2 ,3 low purity template;4 , 5 , 6 high purity template.
由于实验材料和引物的不同 ,对于不同的反应体系来说 , 其具
体数据会有所变化 , 因此本研究的数据适用性不广 , 但规律是
普遍的 , 即对于 ISSR反应来说 ,弥散背景的产生主要由以下几
方面原因造成:首先 , 过低的退火温度;其次 , 不适当引物浓
度;再次 ,较高的模板浓度 , 还有模板纯度可能不高。因此 , 研
究人员在优化 ISSR反应体系时 , 如果遇到弥散背景 ,可以从这
几方面进行分析。
参考文献:
[ 1] Zietkiewicz E , Rafalski A , Labuda D.Genome fingerprinting by simple se-
quence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplif ication[ J] .
Genomics , 1994 , 20(2):176-183.
[ 2] 周延清.DNA 分子标记技术在植物研究中的应用[M] .1版.北京:
化学工业出版社 ,2005:143-146.
[ 3]杨双 , 阮燕晔 , 樊金娟 ,等.一种简易的拟南芥幼苗微量 DNA提取
方法[ J] .沈阳农业大学学报 , 2005 , 36(1):99-100.
[ 4] 汤章城.现代植物生理学实验指南[ M] .1版.北京:科学出版社 ,
1999:336-338.
正交设计优化金发藓科植物 ISSR-PCR反应体系
李传香 ,沙伟＊ ,郑云梅(齐齐哈尔大学生命科学与工程学院生物系 , 黑龙江 齐齐哈尔 161006)
摘要:目的:建立金发藓科植物 ISSR-PCR反应的最佳体系。方法:利用正交设计的方法 ,对金发藓科植物(Polytrichaceae)IS-
SR-PCR反应的 5 因素(Mg2+ , dNTP , primer , DNA template , Taq DNA polymerase)4 水平进行试验。结果:在20μl反应体系中 ,模板
DNA 50ng , 1.6μmol/ L的引物 , 1×反应缓冲液 , 3.2mmol/L的 Mg2+ , dNTP为 1.2mmol/L , 2U 的 Taq DNA 聚合酶 , 反应程序为 94℃预
变性 6min;94℃变性 45s , 57℃退火 45s , 72℃延伸 2min ,循环 40 次;72℃延伸 10min。利用此结论 ,对 20种金发藓科植物进行 ISSR-PCR扩增 , 扩增产物的多态性为 69.52%。 利用引物 841 构建的指纹图谱 , 可区分 20 种金发藓科植物中的 18 种 , 分辨率达
90%。金发藓科植物 ISSR-PCR反应体系的建立 ,为今后利用 ISSR标记技术开展金发藓科植物种间遗传多样性分析提供一个标
准化程序。
关键词:金发藓;ISSR-PCR;正交设计;反应体系
中图分类号:Q781;Q75　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2007)03-0044-03
Study on Optimization for ISSR-PCR Reaction System of Polytrichaceae
using Orthogonal Design
LI Chuan-xiang ,SHA Wei＊ ,ZHENG Yun-mei
(Department of Biology ,College of Life Science and Engineering ,Qiqihar University ,Qiqihar 161006 , China)
Abstract:Objective:The orthogonal design was used to optimize ISSR-PCR amplification system of Polytrichaceae in five factors(Mg2+ , dNTP ,
primer , DNA template , Taq DNA polymerase)at four levels respectively.A suitable ISSR reaction system was established , namely 20μl reaction
system containing 50ng DNA template , 1.6μmol/L primer , 1×PCR buffer , 3.2mmol/ LMg2+ , 1.2mmol/L dNTP , 2U Taq DNA polymerase.The
program of heating:pre-denaturation 6min at 94℃, then undergo a proceeding of reaction cycles as denaturation 45s at 94℃, anneal 45s at
57℃, extension 2min at 72℃, 40 cycles , finally extension 10 min at 72℃.ISSR polymorphism among twenty Polytrichaceae was 69.52%, and 18
out of 20 Polytrichaceae could be identified by ISSR fingerprinter established with primer 841.The result provided a standardizing program for the
analysis of interspecies genetic diversity of Polytrichaceae.
Key words:Polytrichaceae;ISSR-PCR;orthogonal design;reaction system
收稿日期:2006-12-30;修回日期:2007-03-05
基金项目:国家自然科学基金项目资助(No.30470144)
作者简介:李传香(1972-),女 , 在读硕士生 ,从事植物遗传研究, Tel:
0452-2742571 , E-mail:lichuanxiang2004@126.com;＊通讯作者:沙伟
(1963-),女 ,教授 ,博士生导师 , E-mail:Shw1129@263.net。
　　Zietkiewicz E , et al.[1]于 1994年创建了锚定SSR(Inter sim-
ple sequence repeat , ISSR)DNA标记技术 , 其基本原理是利用 16
～ 25bp的加锚 SSR(Simple sequence repeat , 简单重复序列)为引
物 ,对位于反向排列的 SSR 之间的 DNA 序列进行 PCR扩增。
用作引物的 SSR一般为 2～ 5 个核苷酸 ,为了引起特定位点退
火 ,通常在 5 或 3 端加锚 1～ 4个嘌呤或嘧啶碱基。ISSR呈孟
德尔式遗传 , 为显性标记 , 稳定性高 , 技术简单 、快速[ 2] , 该技
术由于多态性水平高 , 可重复性好 , DNA用量少 , 成本低廉等
优点 ,近年来在品种鉴定[ 3 , 4] 、种质资源和遗传多样性研究[ 4-6]
中得到了广泛的应用 ,并作为构建遗传图谱的工具[ 7 , 8] 。
虽然 ISSR有诸多优点 ,但由于它也是基于 PCR的一种标
记 ,所以反应体系和程序不同也会产生不同的结果。为了能
实现 ISSR分析结果的可靠性和重复性 , 进行 ISSR-PCR 反应
体系的优化是非常必要的。截至目前 , 关于金发藓科植物 IS-
SR-PCR反应体系优化的文章尚未见报道。 考虑到 Taq DNA
聚合酶 、Mg2+ 、模板 DNA 、dNTP、ISSR 引物等的浓度都能影响
PCR反应的结果 , 本研究利用正交试验设计的方法 , 从 Taq
DNA 聚合酶 、Mg2+、模板 DNA 、dNTP、ISSR引物 5个因素4 个水
平进行了金发藓 ISSR-PCR反应体系的优化分析。 正交试验
设计具有均衡分散 、综合可比及可伸缩 、效应明显等特性 , 既
减少了试验的规模 , 又不使信息损失得太多 , 克服了单因素试
验顾此失彼 、试验规模巨大的缺点 , 从而最快地找到了最优的
水平组合[9] 。在此基础上 , 又进行了 PCR 过程退火温度的梯
度检测 , 以期建立适合于金发藓的 ISSR反应的最佳体系 ,为今
后利用 ISSR分子标记技术开展金发藓科植物的系统分类研究
奠定了基础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
实验材料为 20 种金发藓科植物(见表 1)。以其中的金发
藓(Polytrichum commune)为正交试验材料 , 提取其 DNA 作为
PCR扩增的模板。
第 17卷第 3 期:44
2007 年 6 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.17 , No.2:44
Jun.2007
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2007.03.017
表 1　供试材料及其来源
Table 1　Polytrichaceae germplasm and their geographical origin
编号
(No.)
种名
(Species)
采集地
(Locus)
标本凭证号
(Voucher)
1
狭叶仙鹤藓
(Atrichum agustatum) 安徽 沙伟 051117
2
仙鹤藓
(Atrichum undulatum) 四川 裴林英 095
3
桧叶金发藓
(Polytrichum juniperinum) 小兴安岭 沙伟 04027
4
东亚小金发藓
(Pogonatum inflexum) 云南 沙伟 107
5
小口小金发藓
(Pogonatum microstomum) 云南 沙伟 72
6
苞叶小金发藓
(Pogonatum spinulosum) 日本 沙伟 J054004
7
穗发小金发藓
(Pogonatum camusii) 海南 汪楣芝 45694
8
扭叶小金发藓
(Pogonatum contortum) 广西 何小兰 00342085
9
东北小金发藓
(Pogonatum japonicum) 广西 汪楣芝 00342734
10
金发藓
(Polytrichum commune) 日本 沙伟 J050001
11
小胞仙鹤藓
(Atrichum crispulum) 安徽 沙伟 051124
12
小仙鹤藓
(Atrichum crispulum) 安徽 沙伟 051108
13
硬叶小金发藓
(Pogonatum neesii) 安徽 沙伟 051109
14
暖地小金发藓
(Pogonatum fastigiatum) 四川 裴林英 465
15
厚栉拟金发藓
(Polytrichastrum emodi) 四川 裴林英 080
16
拟金发藓
(Polytrichastrum alpinum) 四川 汪楣芝 57332
17
南亚小金发藓
(Pogonatum proliferum) 四川 裴林英 497
18
川西小金发藓
(Pogonatum nudiusculum) 陕西 黄全 00342915
19
小金发藓
(Pogonatum aloides) 广东 吴万春 00342011
20
半栉小金发藓
(Pogonatum subfuscatum) 四川 黎兴江 00343416
1.1.2　试剂
用于 ISSR-PCR 反应的 Taq DNA 聚合酶 、dNTP、Buffer、
Mg2+ 、ISSR引物等均购于上海生工公司。并用上海生工合成
的 ISSR引物 ,经初步筛选 , 把引物 841((gA)8C)作为此次正交
试验的引物。
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA 的提取
用改良的 CTAB法提取基因组 DNA ,参照Murry 和 Thomp-
son方法[ 10] ,略有改进。利用 Gene Specl(日本 7A0-0012)测定
DNA浓度和纯度 , 用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 是否降
解。
1.2.2　PCR正交试验设计与分析
针对酶量 、Mg2+、模板 DNA、dNTP 及引物 5个因素 4 个水
平 ,选用 L16(45)正交表 ,设计PCR扩增体系各成分的因素-水
平正交设计试验表[ 9]见表 2。
表 2　PCR扩增体系各成分因素-水平正交设计表 L16(45)
Table 2　Orthoronal design for PCR
编号
No.
Mg2+
(mmol/L)
dNTP
(mmol/ L)
引物
Primer
(μmol/L)
模板DNA
Templet
(ng 20μl)
Taq聚合酶
Polymerase
(U 20μl)
1 2.8 0.8 1.6 40 0.5
2 2.8 1.0 1.8 50 1.0
3 2.8 1.2 2.0 60 1.5
4 2.8 1.4 2.4 70 2.0
5 3.0 0.8 1.8 60 2.0
6 3.0 1.0 1.6 70 1.5
7 3.0 1.2 2.4 40 1.0
8 3.0 1.4 2.0 50 0.5
9 3.2 0.8 2.0 70 1.0
10 3.2 1.0 2.4 60 0.5
11 3.2 1.2 1.6 50 2.0
12 3.2 1.4 1.8 40 1.5
13 3.6 0.8 2.4 50 1.5
14 3.6 1.0 2.0 40 2.0
15 3.6 1.2 1.8 70 0.5
16 3.6 1.4 1.6 60 1.0
　　表中共有 16 个处理 ,每个处理做 2 个重复 , 共 32 管 ,按表
中的数据加样。在美国 PE-9600 型 PCR扩增仪上进行扩增 ,
反应体系为 20μl , 除表中所列因素外 , 每管还有 1×PCR Buffer。
反应程序为:94℃预变性 6min;94℃变性 45s , 57℃退火 45s ,
72℃延伸 2min , 循环40次;72℃延伸 10min;4℃保存。
1.2.3　ISSR-PCR产物的检测
ISSR-PCR产物在 1.3%琼脂糖凝胶上(0.5×TBE 电泳缓
冲液中)电泳 90min , 电压设定为 120V。溴化乙锭(Ethidium
Bromide)染色 30min后在紫外凝胶成像系统(UVP GDS-8000)
下拍照记录。
2　结果与分析
2.1　正交设计的分析
在 L16(45)正交试验设计中 , 组合 1、2、6、8、10、15 无带产
生 ,组合3 、4、5、9、13、16 扩增出 1条带 ,组合 7 扩增出 7 条带 ,
组合 12 扩增出 8条带 , 组合 14扩增出 5 条带 , 而组合 11 扩增
出 12 条清晰的带 ,且组合 11 的多态性及清晰度最好。所以组
合 11 为最佳反应体系(见图 1)。因此获得的最佳 ISSR扩增反
应条件为:反应总体积 20μl , Mg2+为 3.2mmol/ L dNTP 为
1.2mmol/ L ,引物为 1.6μmol/ L ,基因组 DNA 为 50ng , Taq 酶 2U ,
其他成分为无菌双蒸水。重复的结果与此一致。
图 1　ISSR-PCR正交试验结果(1-16 , 处理代号 , 参见表 2;M 为
DI2000)
Figure 1　Electrophoresis of ISSR-PCR orthogonal design(1-16 , Treatment
number , treatment as showed in Table 2;M , DI2000 marker)
2.2　不同 PCR参数对 ISSR-PCR的影响
为了在金发藓科植物上建立最优的反应体系 , 对影响 IS-
SR-PCR扩增的模板 DNA、引物 、Mg2+ 、dNTP 和 Taq DNA 聚合
酶的浓度及扩增循环数设置了不同处理。结果表明 , DNA 含
452007 年 6 月　　　　　　　　　　　　　　正交设计优化金发藓科植物 ISSR-PCR反应体系　　　　　　　　　　　　　　
量在 40 ～ 70ng范围内对 ISSR-PCR 扩增结果无显著影响 , 但
DNA低于 60ng 时 , 条带更清晰易辨 ,高于 60ng 时背景稍显模
糊。ISSR引物浓度小于 1.6μmol/ L时扩增出的条带弱或无扩
增产物 , 引物浓度在 1.6μmol/L～ 2.4μmol/ L , 均可扩增出全部
产物 ,且扩增效果无明显差异。 dNTP浓度为 1.2mmol/L时 , 即
可扩增出全部产物 , 且条带清晰。Mg2+主要是通过影响 Taq
酶活性从而间接影响 PCR扩增 , 结果表明 Mg2+表明浓度在
3.2mmol/ L时可获得最好的扩增结果 , 低于 3.2mmol/ L的情况
下无扩增产物或产物极少。20μl反应液中需要 2U的 Taq酶才
可以扩增出理想的条带 ,但值得注意的是 Taq 酶的商品型号不
同 ,酶活力存在差异 , 用量也不一样。另外 ISSR-PCR扩增过
程中至少需要 40 个热循环才能获得足量产物 , 低于 40 个循
环 ,无扩增产物或产物少。
2.3　退火温度的确定
根据正交试验的分析结果 , 选择最佳的扩增体系进行退
火温度检测。采用的扩增体系中 , 各成分的终浓度为:模板
DNA 50ng , 引物 1.6μmol/ L , 1 ×buffer , Mg2+ 3.2mmol/ L , dNTP
1.2mmol/ L、Taq DNA 聚合酶 2U。从试验中得知:退火温度较
低时 , 产生的杂带多 , 背景较深(48℃～ 53.5℃)。当退火温度
逐渐升高时 , 扩增的特异性升高 , 杂带减少 , 扩增的主带也减
少 ,弥散背景减少。由于 ISSR引物较长 , 所以退火温度要适当
的提高一些 ,以 57℃为金发藓 ISSR-PCR在引物 841 的最佳
退火温度。
2.4　ISSR扩增产物的多态性
利用本研究建立的优化体系和反应条件 , 对 20 种金发藓
科植物进行 ISSR扩增 ,从 48 个引物中筛选出 12 个条带清晰 、
分辨率高 、特异性好的引物 , 其扩增片断大小 200～ 2 000bp , 数
目 5～ 13 个。利用 12 个随机引物共获得 105 条谱带 , 即共检
测到105个位点 , 平均每个引物检测到 8.75 个位点。其中 , 多
态性条带为 73条 , 多态百分率为 69.52%。
以引物 841((gA)8C))构建的指纹图谱可区分 20 种金发
藓科植物中的 18 种 , 分辨率达 90%(见图 2), 表明 ISSR 标记
具有高水平的遗传多态性 , 适用于金发藓科植物的种质鉴定
和遗传分析。
图 2　S841引物 ISSR扩增结果(1～ 20 ,为 20种 ,参见表 1;M 为DI2000)
Fig.2　Amplified ISSR electrophoretogram with S841(1-20 , Species number ,
t reatment as showed in Table1;M ,DI2000marker)
3　讨论
3.1　ISSR引物序列特性对扩增结果的影响
ISSR-PCR扩增结果与引物序列有密切关系 ,引物的核苷
酸组成 ,锚定与否以及锚定位置都会对扩增结果产生影响[ 4] 。
本研究选用的 45个 ISSR引物中 ,以(AT)n 或(TA)n 为重复序
列的引物均没有得到扩增产物 ,柑橘 、水稻 ISSR-PCR扩增中
也有同样的结果[ 5 ,6] 。 尽管植物基因组富含(AT)n 序列 , 但
(AT)n或(AT)n 引物容易自身退火而导致不能扩增。 同时锚
定位置也会影响扩增结果 , 研究发现 3 加锚的(AT)n 引物没
有扩增产物 , 而 5 端加锚的(AT)n 引物却有扩增产物[ 7] 。 在
葡萄 、水稻的 ISSR。 PCR扩增中发现 , 5 端加锚的引物扩增出
的条带多于 3 端加锚的引物 , 但 3 端加锚的引物扩增出的条
带更清晰可辨[ 6 , 8] 。
3.2　ISSR-PCR反应参数的设定
适合的 PCR反应参数是保证 ISSR-PCR扩增效果的基本
条件。在 ISSR-PCR反应体系中 , DNA模板质量是保证 ISSR
-PCR扩增的重要因素 , 一般吸光值 A260/A280在 1.6 ～ 1.9 的
DNA 样本均能得到良好的扩增产物 , 引物浓度要适量 ,过低时
扩增产物少 , 谱带弱 , 过量会出现非特异性谱带;Mg2+浓度主
要通过影响 Taq 酶活性从而影响 PCR扩增浓度过低对 Taq 酶
的活化作用不够 , 过高又会抑制酶活性;dNTP 是 PCR反应的
基本原料 , 浓度过高会产生错误渗入 , 过低会导致扩增不完
全 , 产物少 ,条带弱。总之 , ISSR-PCR反应体系的建立既要保
证扩增产物足量 , 条带清晰 , 重复性好 ,又要兼顾节约成本和
尽量缩短试验周期的原则。
3.3　ISSR的稳定性
与 RAPD相比 , ISSR的引物较长 ,通常在 16 ～ 25bp , PCR扩
增需要较高的退火温度。本研究所采用的引物 , 最低退火温
度为 54℃, 最高为57℃,均高于相应引物的 Tm 值 ,这种高严谨
度条件下的扩增可以大大降低了非特异性扩增的概率 , 保证
了扩增结果的可重复性。同时引物加锚还可以使引物与相匹
配的 SSR在特定位置退火 ,增加了扩增结果的稳定性。
参考文献:
[ 1] Zietkiewicz E , Rafalski A , Labuda D.Genome fingerprinting by simple se-
quence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplif ication[ J] .
Genomics ,1994 , 20:176-183.
[ 2] Reddy M P , Sarla N , Siddiq E A.Inter simple sequence repeat(ISSR)
polymorphixm and its application in plant breeding[ J] .Euphytica , 2002 , 128;
9-17.
[ 3] 沈永宝 ,施季森 ,赵洪亮.利用 ISSR DNA 标记鉴定主要银杏栽培品
种[ J] .林业科学 ,2005 , 41(1):202-204.
[ 4]胡绍庆 ,邱英雄 ,吴光洪 ,等.桂花品种的 ISSR-PCR分析[ J] .南京
农业大学学报:自然科学版, 2004 , 28(增刊):71-75.
[ 5] 杨传平 ,魏利 ,姜静 ,等.应用 ISSR-PCR对西伯利亚红松 19个种源
的遗传多样性分析[ J] .东北林业大学学报 , 2005, 33(1):1-3.
[ 6] 彭云滔 ,唐绍清 , 李伯林, 等.野生罗汉果遗传多样性的 ISSR分析
[ J] .生物多样性 ,2005 , 13(1):36-42.
[ 7] Kojima T , Nagaoka T , Noda K.Genetic linkage map of ISSR and RAPD
markers in Einkom wheat in relation to that of RFLP markers[ J] .Theor.APPl
Genet ,1998 , 96:37-45.
[ 8]张仁兵 ,易克 ,许勇 ,等.用重组自交系构建西瓜分子遗传图谱[ J] .
分子植物育种 , 2003 , 1(4):481-489.
[ 9] 续九如 ,黄智慧.林业试验设计[ M] .北京:中国林业出版社 , 1998:
65-79.
[ 10] Murray M G ,Thompson W F.[ J] .Nucl Acids Res , 1980 , 8:4321-4325.
切胶纯化表达蛋白包涵体的可行性分析
于在江1 ,马学恩1＊ ,周建华2(1.内蒙古农业大学动物科学与医学学院 ,内蒙古 呼和浩特 010018;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 ,黑龙江 哈尔滨 150001)
摘要:目的:高效率地纯化以包涵体形式表达的蛋白。方法:将 SDS-PAGE电泳后的目的蛋白用 4mol L 的乙酸钠显现出来 ,
切割下来的目的蛋白可直接用于免疫 ,将切割下来的目的蛋白装在透析袋中 ,在电场中将游离的目的蛋白洗脱下来可用于 ELISA
检测。结果:用该法得到的蛋白经 ELISA 和Western blot检测均能保持其原有的抗原性 , 并用该法纯化的蛋白成功制备了相应的
多抗和单抗。结论:证实了回收的蛋白仍能保留原有的抗原性 ,与传统的方法比较 ,方法简单且比较经济实用特别是包涵体 , 为
切胶纯化蛋白提供了一个新的方法。
关键词:SDS-PAGE;包涵体;蛋白纯化
中图分类号:Q503　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2007)03-0046-03
第 17卷第 3 期:46
2007 年 6 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.17 , No.3:46
Jun.2007