全 文 ：KA challenged seizure , but it the mechanism of the
early expression of IL-6 w ith the homeostasis of en-
dogenous NO mediator merit s further study .
KEY WORDS 　ni tric oxide;L-nit roarginine;L-
arginine;kainic acid;seizure;interlukin-6
1Basic Medical Inst itute , the Acaderny of M ili tary Medical S ciences ,
Beijing　100850
2Dept of Neu rology , 210 Hospital , Dalian　116021
3Dept of Funct ions , Dalian Medical University , Dalian　116027
金粉蕨素拮抗氧化损伤所抑制的
内皮细胞增殖的作用及其机制＊
郭　玉　朱炳阳　严奉祥　廖端芳
(南华大学药物药理学研究所 , 衡阳　421001)
中国图书分类号　 R 322.123;R 284.1;R 329.25;R
345.44;R 345.57;R 914.3
文献标识码　A　文章编号　1001-1978(2003)04-0401-03
摘要　目的　探讨金粉蕨素拮抗 Menadione 氧化损伤所抑
制的内皮细胞增殖的作用及其机制。方法　以 Menadione
(O-2)损伤人脐静脉内皮细胞作为氧化损伤模型 ,采用 MTT
法和细胞计数法 ,观察不同浓度金粉蕨素对 Menadione 损伤
内皮细胞生长抑制率的影响;利用硝酸还原酶法测定培养液
中 NO 含量;以 Western blo t检测细胞 eNOS 活性及磷酸化
ERK1/ 2的表达。结果　金粉蕨素保护组与损伤组相比 , 内
皮细胞的生长抑制率明显降低 , 培养液中 NO 含量增高 ,
eNOS 活性增强 , 磷酸化 ERK1/ 2 表达上调。结论　NO 和
ERK1/ 2通路可能介导了金粉蕨素拮抗 Menadione氧化损伤
所抑制内皮细胞增殖的保护作用。
关键词　金粉蕨素;内皮细胞;一氧化氮合酶;细胞外信号调
节激酶
　　金粉蕨素(Onychin)是从粟柄金蕨粉(Onychi-
um lucidum)植物中提出的二氢黄酮苷(f lavanone
g ly coside),属于黄酮类化合物。黄酮类化合物具有
抗炎 ,抗氧化 , 抗癌等生理及药理活性[ 1] 。初步研
究发现金粉蕨素能促进血管内皮细胞释放和合成一
氧化氮(nit ric o xide , NO),且抑制血管平滑肌细胞
增殖;最近笔者研究表明金粉蕨素对溶血性磷脂酰
2002 05 08收稿 , 2002 12 02修回
＊国家自然科学基金课题 , No 39970847 , 湖南省卫生厅中医药科研
课题 , No 2000006
作者简介:郭　玉 , 女 , 34 岁 , 硕士。 Tel:0734-8281408 , E-mail:
Guoyuhy@sohu.com ;
廖端芳 , 男 , 44岁 , 教授 , 博士生导师。通讯作者。 Tel:
0734-8281308 , Fax:0734-8281239 , E-mail:dfliao @ hot-
mail.com
胆碱损伤的离体兔血管环的舒张功能有明显的保护
作用[ 2] 。目前 , 金粉蕨素的药理作用机制尚不清
楚 ,本实验通过金粉蕨素对 Menadione 抑制内皮细
胞(endothelial cell , EC)增殖的影响及 eNOS(en-
dothelial nit ric oxide synthase , eNOS)活性和磷酸化
ERK1/2(ex tracellular signal-regulated kinase 1 and
2 , ERK1/2)表达的研究 ,发现金粉蕨素可能通过阻
止磷酸化 ERK1/2的下调和保护 eNOS 活性而对抗
Menadione对内皮细胞增殖的抑制作用 。
1　材料和方法
1.1 　药品与试剂 　金粉蕨素:用二甲基亚砜
(dimethyl sulfox ide , DMSO)溶解(DMSO 终浓度不
超过 1/1 000);Menadione购自 Sigma公司 ,为产生
超氧阴离子(O·2)试剂 ,以无水乙醇作为溶媒配制储
存液(1 mmol·L-1)[ 3] ;胰酶 ,胶原酶 ,M199 ,内皮细
胞生长因子等为 Sigma 公司产品;NO 检测试剂盒
购自南京建成生物工程研究所;磷酸化 ERK1/2 ,
eNOS 一抗 , HRP 标记的二抗及发光剂(Western
blot ting luminol reagent)均购自 Santa Cruz Biotech-
nology 公司;BCA蛋白定量试剂(BCA protein assay
reagent)购自 PIERCE公司。
1.2　仪器　CO2 培养箱 , USA 生产;Bio Rad聚丙
烯酰胺垂直电泳系统 , USA 生产;Elx800 酶联仪
USA生产;Nikon相差显微镜 ,日本生产;无菌超净
台 ,超低温冰箱 ,超声波细胞粉碎机等 。
1.3　实验方法
1.3.1　脐静脉内皮细胞的培养及实验分组　人脐
静脉内皮细胞按参考文献[ 4]方法培养 ,取第 2 ～ 5代
细胞以 5×107 个·L-1密度铺种于细胞培养瓶或细
胞培养板 ,待细胞贴壁并达 70%融合时 ,按实验分
组设计加入相应处理因素并检测相应指标 。
·401·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2003 Apr;19(4):401 ～ 3
实验分 3组:①正常对照组;②Menadione 损伤
组:观察量效关系 ,分别用(5 , 10 , 20 ,40)μmol·L-1
Menadione损伤内皮细胞;③Menadione +金粉蕨素
保护组:以(10 μmol·L-1)Menadione与不同浓度金
粉蕨素(终浓度分别 1 、5 、10 μmol·L-1)处理内皮细
胞;按实验分组加入相应处理因素 ,孵育 24h后 ,检
测相应指标。
1.3.2　细胞增殖抑制的测定　分别采用 MT T 比
色法和苔盼蓝染色细胞计数法 ,按下列公式计算细
胞生长抑制率(Inhibitory Rate , IR):
细胞生长抑制率=〔(正常对照组 OD 值-用药组 OD 值)/
正常对照组 OD值〕×100%
或细胞生长抑制率=〔(正常对照组活细胞数-用药组活细
胞数)/正常对照组活细胞数〕×100%
1.3.3　细胞培养液中 NO 含量的测定　采用硝酸
酶还原法按南京建成生物公司提供试剂盒内说明书
方法测定细胞培养液中 NO 的含量 。其原理为 NO
在体内被氧化成硝酸盐(NO-3 )与亚硝酸盐(NO-2 ),
一般认为 NO-3 /NO-2 是 NO稳定的代谢产物;运用
硝酸还原酶可将 NO-3 还原成 NO-2 , NO-2 在酸性条
件下可与磺胺反应生成重氮盐 ,后者再与萘乙二胺
偶合生成紫红色产物 ,通过测定吸光度和标准曲线
即可计算 NO-2 浓度。
1.3.4　内皮细胞 eNOS 及磷酸化 ERK1/2 的表达
　采用Western blot方法测定[ 5] ,主要步骤如下:弃
细胞培养液 , 4℃的 PBS 洗 3 次 ,吸净残余 PBS 溶
液 ,以三去污裂解液裂解细胞 ,收集细胞裂解液;以
BCA蛋白定量试剂测定细胞蛋白质含量 ,按每孔 80
μg 蛋白量上样 ,进行聚丙烯酰胺垂直电泳 ,转聚偏
二氟乙烯膜(Bio Trace PVDF)膜 , 5%脱脂牛奶封闭
2 h ,TPBS(为含 0.4%Tween-20的 PBS溶液)洗膜
3次;分别杂交 eNOS 及磷酸化 ERK1/2一抗 ,室温
孵育 1 h ,洗膜;与相应二抗孵育 1 h ,洗膜 ,加发光
剂 ,于暗室显影 、定影 。
1.3.5　统计学处理　实验结果均采用 x ±s 表示 ,
组间比较经方差齐性分析后进行 t 检验 。
2　结果
2.1　Menadione对细胞增殖的影响　MTT 比色法
和细胞计数法实验结果均显示:Menadione(O-2 )对
内皮细胞生长抑制作用呈剂量依赖性 ,随着 Mena-
dione浓度增高 ,内皮细胞生长抑制率增加(Fig 1)。
2.2　金粉蕨素对Menadione抑制内皮细胞增殖的
保护作用　MTT 比色法和细胞计数法实验结果均
表明不同剂量金粉蕨素可不同程度拮抗 Menadione
对内皮细胞增殖的抑制作用 ,降低 Menadione 对内
皮细胞的抑制率(Tab 1)。
Tab 1　Protective effect of onychin on inhibitory
growth of EC injured by menadione( x±s , n=6)
Group
Dose
/μmol·L-1
MTT Method
OD
IR
/ %
Count ing Method
Cell number
/ ×107·L-1
IR
/ %
Cont rol 0.770±0.028 - 105±1.6 -
M 0.283±0.033 63.3 37±2.4 64.8
M+O 1 0.342±0.053＊ 55.6 60±2.7＊ 42.9
M+O 5 0.580±0.075＊ 24.7 65±1.5＊ 38.1
M+O 10 0.632±0.068＊ 17.9 84±1.7＊ 20.0
　　M=menadione(10μm ol·L -1), O=onychin , ＊P<0.05 vs mena-
dione(10μmol·L -1)group
Fig 1　Concentration effect curve
of menadione on EC growth inhibition
2.3　金粉蕨素对培养液中 NO含量的影响　本实
验结果显示:Menadione 损伤组细胞培养液中 NO
含量低于正常组 ,而金粉蕨素呈浓度依赖性地增加
细胞培养液中 NO的含量(Fig 2)。
Fig 2　Influence of onychin on NO
release of EC injured by menadione
　　＊P<0.05 vs menadione group , #P<0.05 vs cont rol group( x ±
s , n=6)
2.4　金粉蕨素对内皮细胞 eNOS及磷酸化ERK1/2
表达的影响　Western blot检测结果显示 ,正常组细
胞表达大量的 eNOS , 并存在一定量的磷酸化
ERK1/2;Menadione 作用内皮细胞 24h 后 ,内皮细
胞 eNOS和磷酸化 ERK1/2的表达下调;金粉蕨素
可拮抗 Menadione的下调作用(Fig 3)。
·402· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2003 Apr;19(4)
Fig 3　Effect of onychin on eNOS activity and
phosph-ERK1/ 2 protein levels of EC injured by menadione
3　讨论
近来血管内皮细胞的剥脱和修复障碍在再狭窄
的形成方面所起的作用越来越受到重视 ,对再狭窄
的研究已转向促进血管内皮细胞的修复和功能恢复
方面[ 6] 。金粉蕨素能使内皮细胞生长抑制率降低 ,
提示内皮细胞再生功能恢复 ,能修复受损内膜 ,这对
防治再狭窄具有十分重要的意义。
NO 为血管内皮源性舒张因子 ,也是一种重要
的信号分子 ,具有独特的理化性质和生物学活性 ,
eNOS为 NO 合成酶 , NO含量的变化受 eNOS 活性
的影响;最近研究报道 NO 具有调节细胞周期的活
性[ 7] ,在内皮细胞生长因子诱导内皮细胞增殖中 ,
NO起着非常重要的作用[ 8] 。
细胞外信号调节激酶(ERK1/2)通路主要调控
细胞增殖 ,该通路信号传递包括 Ras-Raf-MEK1/2-
ERK1/2 , ERK1/2 通过磷酸化激活 , 被激活的
ERK1/2可转入核内并磷酸化其底物 ,改变一些基
因的表达 ,从而促进细胞生长 、分化[ 9] 。
　　金粉蕨素是一种易氧化的黄酮类化合物 ,也是
氧自由基和过氧化物的清除剂 ,本实验结果显示 ,金
粉蕨素可拮抗 Menadione对内皮细胞增殖的抑制作
用 ,同时增加培养液中 NO的含量 ,保护 eNOS 活性
并阻止磷酸化 ERK1/2表达下调 。由此推测 NO和
ERK1/2信号通路可能介导了金粉蕨素抗氧化损伤
抑制内皮细胞增殖的作用。
参考文献
1　彭　芳 ,陈植和.300黄酮类化合物的生物学活性.国外医学植
物药分册 , 1998;13(5):207～ 9
2　庹勤慧 , 黄红林 , 谢志忠 et al.金粉蕨素对溶血性磷脂酰胆碱
损伤血管内皮依赖性舒张功能的保护作用及机制.中国动脉硬
化杂志 , 2001;9(1):27～ 30
3　Lee JL , Bae ON , Chung SM et al.Menadione induces endothelial
dysfunction mediated by oxidative stress and arylat ion.Chem Biol
In teract , 2001;137(2):169～ 83
4　Loyenzon P , Vecile E , Nardon E et al.Endothelial cell E- and P-
selectin and vascular cell adhesion molecule-1 function as signaling re-
ceptors.J Cel l Biol , 1998;142(5):1381～ 91
5　Liao DF , Jin ZG , Baas AS et al.Purification and identif icat ion of se-
creted oxidative st ree-induced factors f rom vasular smooth muscle
cells.J Biol Chem , 2000;275(1);189～ 96
6　Meurice T , Vallet B , Bauters C et al.Role of endothelial cells in
restenosis af ter coronary angioplasty.F undam Clin Pharmacol ,
1996;10(3):234～ 42
7　Marx SO , Marks AR.Bench to beside:The development of ra-
pamycin and its application to stent restenosis.Circu lation , 2001;
104(8):852～ 5
8　Park JS , Hong GR , Baek SW et al.Expression and regulation of en-
dothelial nit ric oxide synthase by vascular endothelial grow th factor
in ECV304 cells.J Korean Men S ci , 2002;17(2):161～ 7
9　Zhang W , Liu HT.MAPK signal pathways in the regulat ion of cell
proliferation in mammaliam cells.Cell Res , 2002;12(1):9～ 18
Protective action and of onychin aganist growth inhibition of
endothelial cell injured by oxidation and its mechanism
GUO Yu , ZHU Bing-Yang , YAN Feng-Xiang , LIAO Duan-Fang
(The Insti tute of Pharmacy and Pharmacology , Nanhua University , Hengyang 　421001)
ABSTRACT　AIM　To investigate the pro tective ac-
tion of onychin aganist the grow th inhibi tion of en-
do thelial cell injured by menadione and its mecha-
nism .METHODS 　The injured model was estab-
lished by endo thelial cell treated with menadione.Pro-
tective ef fect of onychin aganist grow th inhibi tion of
injured endothelial cell was determined by M T T assay
and cell counting method;NO concentration in the
medium was determined by ni trate reductase assay;
eNOS and phosph-ERK1/2 pro tein levels were deter-
mined by Western blot.RESULT　Onychin signifi-
cant ly decreased the g row th inhibito ry rate of injured
endothelial cells , increased NO concentration in the
medium and eNOS activity and up-regulated phosph-
ERK1/2 expressing.CONCLUSION 　Onychin has
protective action and against the g row th inhibi tion of
endothelial cell injured by menadione may be via NO
and ERK1/2 signal pathw ay .
KEY WORDS　onychin;endothelial cell;endothelial
ni tric oxide synthase(eNOS), ex tracellular signal-
regulated kinase 1 and 2(ERK1/2)
·403·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2003 Apr;19(4)