全 文 ：中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2015, 46(8) · ·827
石杉碱甲 (huperzine A，1) 是从药用植物蛇足
石杉 [Huperzia serrata (Thunb. ex Murray)Trev.] 中
闽浙马尾杉内生真菌炭团菌 NX9产石杉碱甲的发酵条件优化
张方方1，王明兹2，刘海元3，郑雅媗1，吴水生1*
(1. 福建中医药大学，福建福州 350122；2. 福建师范大学，福建福州 350108；
3. 中国医药工业研究总院上海医药工业研究院，上海 200040)
摘要：采用单因素法和均匀设计法优化了闽浙马尾杉内生真菌炭团菌 (Hypoxylon investiens)NX9的摇瓶发酵条件及培养
基配方，以提高石杉碱甲的产量。优化后的发酵条件为：种龄 60 h、接种量 8％。培养基配方 (g/L) 为：马铃薯 200、丙
酮酸钠 1、乙酸钠 0.2、甘露醇 50、葡萄糖 50、硫酸镁 0.5、硫酸铵 10、硝酸钠 5、维生素 B6 0.1；pH 6.4。在上述条件
下，石杉碱甲的摇瓶发酵产量为 16.93 g/L，较优化前提高了 14倍。以优化后的培养基作为种子培养基制备种子液，发
酵液中石杉碱甲的含量进一步提高至 27.48 g/L。
关键词：炭团菌；石杉碱甲；发酵
中图分类号：TQ92 文献标志码：A 文章编号：1001-8255(2015)08-0827-06
DOI：10.16522/j.cnki.cjph.2015.08.009
收稿日期：2015-03-12
基金项目：福建省财政厅专项经费(闽财指[2011]1238)、福建省大
学生创新创业项目(201310393057)、福建省科技厅社会发展引导性项目
(2015Y0068)
作者简介：张方方(1990-)，女，硕士研究生，专业方向：中药生
物工程研究。
E-mail：1170563131@qq.com
通信联系人：吴水生(1965-)，男，教授，从事中药生物工程研究。
Tel：013960961228
E-mail：wushuishengwss@163.com
Fermentation Optimization of Huperzine A Produced by
Endophytic Fungi Hypoxylon investiens NX9 from Phlegmariurus phlegmaria
ZHANG Fangfang1, WANG Mingzi2, LIU Haiyuan3, ZHENG Yaxuan1, WU Shuisheng1*
(1. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122; 2. Fujian Normal University, Fuzhou 350108;
3. Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 200040)
ABSTRACT: A Single factor and an uniform design were conducted for the optimization of fermentation condition
and culture medium for Hypoxylon investiens NX9, an endophytic fungus isolated from Phlegmariurus phlegmaria, to
increase its productivity of huperzine A. The optimal fermentation conditions were as follows: inoculum age of 60 h and
inoculum size of 8％. The compositions of optimum culture medium (g/L) were as follows: potato 200, sodium pyruvate
1, sodium acetate 0.2, D-mannitol 50, glucose 50, magnesium sulfate 0.5, ammonium sulfate 10, sodium nitrate 5, vitamin
B6 0.1; pH 6.4. Under the optimal conditions, the yield of huperzine A reached to 16.93 g/L, which increased to 14 times
compared with the basal culture medium. After applying the optimum medium as the seed liquid medium, the content of
huperzine A in the fermentation broth was up to 27.48 g/L.
Key Words: Hypoxylon investiens; huperzine A; fermentation
分离到的一种石松类倍半萜生物碱 [1]，具有高效、
低毒、可逆性的乙酰胆碱酯酶抑制作用，已成为治
疗阿尔茨海默病最有效的药物之一 [2]。1主要来源
于野生蛇足石杉全草，由于该植物对环境要求苛刻，
生长缓慢，分布零散，资源更新周期长，商业可采
量不超过 200 t[3]。近年来，对野生蛇足石杉的大规
模采掘导致其野生资源趋于灭绝。1的化学合成反
应步骤繁琐、成本高，尚无法实现工业化生产 [4]。
随着野生资源的枯竭，使得 1的药源成为很大的问
题。
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1996年 Strobel等从红豆杉中分离到 1株产紫
杉醇的内生真菌 [5]，为解决天然药物来源紧缺的问
题及保护濒临灭绝植物开辟了新的道路。黎万奎等
从植物蛇足石杉中分离到 1株产 1的内生真菌枝顶
孢霉属 (Cladosporium cladosporioides)2F09P03B[6]，
通过优化发酵条件，将 1产量提高至 8.32 g/L；王
吉祥也从该植物中分离到内生真菌竹黄属 (Shiraia
sp.)Slf14[7]，通过优化该菌的发酵条件，1产量达到
0.75 mg/L。本实验室从闽浙马尾杉 (Phlegmariurus
phlegmaria)中分离到 1株产 1的炭团菌(Hypoxylon
investiens)，经 UV及 NTG诱变，获得突变株
NX9，1产量为 1.12 g/L。在此基础上，本研究通
过单因素试验及均匀设计法进一步优化 1的摇瓶发
酵条件及培养基配方，并将优化后的培养基作为种
子液培养基，1产量显著提高。
1 仪器与试药
MJP-250型霉菌培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；
超高效液相色谱 -质谱联用仪 (美国Waters公司 )；LGJ-12
型真空冷冻干燥机 (北京松源华兴科技发展有限公司 )。
1对照品 (长沙中仁生物技术有限公司，纯度 >98％，
批号 2012120301)。替硝唑 (内标，2) 对照品 (中国食品药
品检定研究院，纯度 >99.9％，批号 100336-200703)。马铃薯、
玉米粉为市场购得，豆粕、麦麸购于福建科瑞医药有限公
司，丙酮酸、乙酰辅酶 A(CoA)、维生素 B6(VB6)、维生素
C(VC) 和维生素 A(VA) 购于美国 Sigma公司；甲醇、甲酸
为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
炭团菌 (Hypoxylon investiens)NX9由本实验室保藏。
马铃薯液体培养基 (PDB)/g·L-1：马铃薯 200，葡萄糖
20。
马铃薯培养基 (PDA) /g·L-1：马铃薯 200，葡萄糖 20，
琼脂 15。
所有培养基均在 121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min。
2 方法与结果
2.1 种子液培养
将保藏在固体斜面培养基的菌种接入 PDA平
板内，倒置于恒温培养箱中，28 ℃培养 3～ 5 d，
转接于 PDB培养基 80 ml中 (250 ml摇瓶 )，28 ℃
振荡 (140 r/min) 培养 72 h。
2.2 1粗提物的制备及含量测定
2.2.1 1的提取
将种子液以 8％的接种量接于 PDB培养基
80 ml中 (250 ml摇瓶 )，28 ℃振荡 (140 r/min) 培
养 10 d。向该发酵液中加入 2％酒石酸 50 ml摇匀，
静置过夜，超声 (50 W，40 min×2)，过滤，合并滤液。
加氨水调至 pH 9，加入等体积二氯甲烷萃取 3次，
合并有机相，减压浓缩至干，用无水甲醇 10 ml分
3次加入回收瓶中，溶解，取出吹干，剩余物加入
0.2％甲酸 200 l溶解，经 0.22 m微孔滤膜过滤。
2.2.2 UPLC-MS/MS法测定 1
色谱条件：色谱柱 Acquity UPLC BEH C18柱
(2.1 mm×100 mm，1.7 m) ；流动相 甲醇∶ 0.2％
甲酸 (50∶ 50) ；流速 0.15 ml/min；进样量 5 l。
质谱条件：离子源 电喷雾电离源 (ESI+) ；采
集方式 多反应监测 (MRM) ；毛细管电压 3.0 kV；
锥孔电压 35 V；离子源温度 110 ℃；脱溶剂温度
350 ℃；脱溶剂气流量 (N2) 650 L/h；锥孔气流量
(N2) 50 L/h；监测离子对 m/z 243.33→m/z 209.98
(1)，m/z 248.18→m/z 120.96(2)。
配 制 浓 度 分 别 为 5、4、2.5、2、1、0.5 和
0.25 g/ml的 1对照品溶液 (2均含 0.5 g/ml)，分
别进样，以 1浓度 c为横坐标，1、2峰面积比值 R
为纵坐标，进行线性回归，得回归方程 R=0.604 2c-
0.023 1，r=0.997 2。采用标准曲线法计算 1含量。
2.3 菌株发酵条件考察
2.3.1 菌株发酵培养特性研究
将种子液以 8％的接种量接于 PDB培养基
80 ml中 (250 ml摇瓶 )，28 ℃振荡 (140 r/min) 培
养 20 d，发酵期间每天取出 3瓶发酵液，分别测定
发酵液的 pH值，然后离心 (5 700×g)10 min，收集
菌丝体，并计算生物量 (g/L)。同时按“2.2.1”项
下方法处理发酵液，测定其中的1。结果(图1)显示，
菌株从 d4开始进入对数生长期，d8生物量达到最
大值，进入稳定生长期，d13后菌株进入衰亡期。1
为菌株次级代谢产物，在对数生长期之前基本未生
成，稳定期后期产量较高。当菌体摇瓶培养到 d10、
d11时 1含量较高，之后 1含量随发酵时间的延长
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而降低。在对数生长前期，随着细胞量的迅速增加，
对营养物质的胞外降解和消耗导致培养液 pH值由
6.4降至 5.61。随后由于代谢产物的积累，培养液
pH值回升，对数生长后期 pH值上升较快，培养液
酸碱度趋于中性。进入稳定期后培养液 pH值继续
缓慢上升，1积累期间培养液呈弱碱性。
图 1 菌株 NX9的发酵生长曲线
Fig.1 Fermentation Curves of Strain NX9
2.3.2 种龄对 1产量的影响
分别取培养 30、42、48、54、60和 72 h的种子液，
以 8％接种量接于 PDB培养基 80 ml(250 ml摇瓶 )
中，28 ℃振荡 (140 r/min) 培养 10 d，考察种龄对
1含量的影响。结果见图 2A。可见，随着种龄的增大，
1含量增加。种子液种龄为 60 h时，含量最高约为
1.20 g/L。菌龄小于 48 h时，菌株生长状态不佳，
迟缓期较长。
2.3.3 接种量对 1产量的影响
取“2.1”项下的种子液分别按 2％、4％、6％、
8％和 10％的接种量接种于 PDB培养基 80 ml中
(250 ml摇瓶 )，28 ℃振荡 (140 r/min) 培养 10 d，
按“2.2.1”项下方法处理发酵液，并测定其中的 1。
结果见图 2B。接种量的控制对内生真菌发酵过程
中菌丝的生长、形态及代谢产物的产生都有很大影
响。由图 2B可知，随着接种量的增加，生长达峰
时间缩短，产物合成提前，1含量也随之增大。接
种量为 8％时，1含量较高 (1.12 g/L) ；但因丝状
真菌接种量过大，不同菌落间的菌丝交织在一起，
容易吻合产生异核体，变异菌株增多，菌种发生退
化，生产能力下降 [8]，因此接种量为 10％时菌株
NX9中 1含量大幅降低。
2.3.4 pH值对 1产量的影响
将培养基的初始 pH值调至 6.2、6.4、6.6、6.8、
7.0和 7.2，取“2.1”项下的种子液按 8％接种量接
于 PDB培养基 80 ml中 (250 ml摇瓶 )，28 ℃振荡
(140 r/min) 培养 10 d，按“2.2.1”项下方法处理发
酵液，测定发酵液中的 1。由图 2C可知，菌株在
偏酸性的条件下生长状况较好，1含量高；当 pH
值为 6.4时，1含量为 1.12 g/L。培养基初始 pH
值为偏中性或碱性，菌株生长状态较差，1含量低，
且易染菌。
2.4 培养基单因素考察
2.4.1 碳源
以 PDB为基础培养基，其中的葡萄糖 (2％ )
分别替换为麦芽糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、酵母
膏和玉米粉，添加量均为 8％，以基础培养基为对照。
取“2.1”项下的种子液以 8％的接种量分别接种
于上述培养基 80 ml中 (250 ml摇瓶 )，28 ℃振荡
A：种龄，B：接种量，C：发酵液初始 pH值
图 2 菌株 NX9发酵条件考察
Fig.2 Investigation on Fermentation Conditions of Strain NX9
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(140 r/min) 培养 10 d，按“2.2.1”项下方法处理发
酵液，测定发酵液中的 1。由图 3 A可知，以甘露醇
为碳源时，发酵液粗提物中 1含量较高 (5.67 g/L)；
以葡萄糖 (8％ )为碳源时 1含量为 4.35 g/L；而
基础培养基中 1的含量仅达 1.24 g/L。其他碳源对
1的生成呈抑制作用，其中以酵母膏为碳源的培养
基所得发酵液中几乎未检测到 1。由此可见，选用
甘露醇和葡萄糖作为 NX9菌株发酵的碳源均有利
于提高 1的产量。
2.4.2 氮源
以 PDB培养基为基础，不加葡萄糖，分别加
入 1％蛋白胨、硫酸铵、硝酸钠、牛肉膏、豆粕和
麸皮作为氮源，以 PDB培养基为对照。取“2.1”
项下的种子液分别接种于上述培养基，同上培养
10 d，按“2.2.1”项下方法处理发酵液，并测定其
中的 1。由图 3B知，与 PDB培养基中 1含量相比，
以硫酸铵和硝酸钠为氮源时菌株发酵液中的 1含量
提高显著，为 5.37和 4.37 g/L。其他氮源均不利
于菌株生长。因此选择硫酸铵和硝酸钠作为氮源。
2.4.3 无机盐
在上述优化的培养基中 ( 即马铃薯 20％、葡
萄糖 8％、甘露醇 8％、硫酸铵 1％、硝酸钠 1％ )，
分别加入 0.05％磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠和硫
酸铁，取“2.1”项下的种子液分别接种于上述培养
基，同上培养 10 d，按“2.2.1”项下方法处理发酵
液，测定其中的 1。结果 (图 3C) 显示，加入硫酸
镁时，1含量显著提高 ( 以 PDB培养基为对照 )，
为 6.45 g/L；当加入磷酸二氢钾时，1含量下降显
著 (0.55 g/L) ；是否加入氯化钠对 1的含量无明显
影响。可见，向培养基中加入硫酸镁可促进1的产生。
2.4.4 前体化合物对 1产量的影响
在上述优化的培养基中 (即马铃薯 20％、葡萄
糖 8％、甘露醇 8％、硫酸铵 1％、硝酸钠 1％、硫
酸镁 0.05％ )，分别加入 0.05％乙酸钠、乙酸钾、
丙酮酸钠或 0.015％ CoA，取“2.1”项下的种子液
分别接种于上述培养基，同上培养 10 d，按“2.2.1”
项下方法处理发酵液，测定其中的 1。结果 ( 图
3D) 显示，与 PDB培养基相比，加入乙酸钠和丙
酮酸钠后，1含量略有提高(以PDB培养基为对照)，
为 4.34和 5.83 g/L；是否加入乙酸钾几乎无影响；
CoA则呈抑制作用，所得 1含量仅 0.23 g/L。
2.4.5 维生素与 1含量的关系
在上述优化的培养基中 (即马铃薯 20％、葡萄
糖 8％、甘露醇 8％、硫酸铵 1％、硝酸钠 1％、硫
酸镁 0.05％、乙酸钠 0.05％、丙酮酸钠 0.05％ )，
分别加入 0.015％ VB6、VA和 VC，取“2.1”项下
的种子液分别接种于上述培养基，同上培养 10 d，
按“2.2.1”项下方法处理发酵液，测定其中的 1。
结果(图 3E)显示，加入VB6后 1含量提高显著(以
PDB培养基为对照 )，为 6.45 g/L；VA呈抑制作
用，菌株发酵液中 1的含量仅 0.89 g/L；而维生素
C几乎无影响。
2.5 均匀设计
通过上述单因素试验考察结果，确定影响 1含
量的最重要因素，即丙酮酸钠、乙酸钠、甘露醇、
葡萄糖、硫酸镁、硫酸铵、硝酸钠和 VB6，分别用
x1～ x8表示。用 DPS(14.5) 软件生成 8因素 14水
平 [U8(148)] 的均匀设计表 (表 1)。该均匀设计表
的中心化偏差 CD=0.286 6，每个水平平行试验 3次，
以 1含量为指标，采用偏最小二乘二次多项式回归
分析 (PLS) 统计分析试验结果，得到回归方程。
y = 11 . 11 5 - 1 6 . 2 9 6 x 1- 9 . 1 7 2 x 2- 0 . 8 5 5 x 3+
0 .502x 4+97.526x 5- 2.823x 6- 7.328x 7- 0.506x 8+
1.886x1
2-1.618x22+0.006x32-0.030x42-516.386x52-
0.022x6
2+1.459x7
2-0.413x82+3.684x1x2+0.591x1x3-
0.409x1x4-39.677x1x5+ 3.524x1x6+4.798x1x7+ 1.736x1x8+
0.248x2x3+0.022x2x4+27.098x2x5+1.660x2x6+3.501x2x7+
0.295x2x8+0.030x3x4+0.566x3x5+0.010x3x6+ 0.502x3x7+
0.010x3x8+1.399x4x5-0.186x4x6+ 0.008x4x7-0.092x4x8-
12.235x5x6-63.672x5x7+ 0.362x5x8+0.927x6x7+0.832x6x8-
0.122x7x8，R=0.966。
结果表明该方程可信度较高，在该模型最佳点
处进行 PLS验证试验 (表 2)。推测的最优组合与
菌株 NX9中 1含量的期望值极为接近，实验值与
模型计算值相差 3.97％，表明二次数学模型与实际
情况拟合较好，实测值与预测值之间无显著性差异，
证明该数学模型有效。
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A：碳源，B：氮源，C：无机盐，D：前体化合物，E：维生素
图 3 培养基组成单因素试验考察结果
Fig.3 Investigation Results of the Single Factor Test for Culture Medium Compositions
表 1 8因素 14水平 [U8(148)]的均匀设计表
Tab.1 Uniform Design Table of 8 Factors with
14 Levels [U8(148)]
因子 x1/g·L-1 x2/g·L-1 x3/g·L-1 x4/g·L-1 x5/g·L-1 x6/g·L-1 x7/g·L-1 x8/mg·L-1
N1 1.00 3.52 69.23 16.15 0.25 17.69 8.85 13.85
N2 2.54 2.42 100.00 19.23 0.36 20.00 5.00 15.38
N3 4.38 4.26 88.46 28.46 0.22 13.85 5.77 12.31
N4 2.85 5.00 73.08 10.00 0.34 10.77 6.54 19.23
N5 3.77 9.40 96.15 37.69 0.27 10.00 8.46 14.62
N6 3.46 4.63 53.85 40.77 0.38 19.23 8.08 11.54
N7 3.15 1.31 84.62 31.54 0.41 18.46 10.00 20.00
N8 1.31 1.68 61.54 34.62 0.43 11.54 5.38 13.08
N9 2.23 2.78 80.77 50.00 0.32 13.08 9.62 10.00
N10 1.92 0.20 50.00 25.38 0.20 15.62 7.69 16.92
N11 4.08 0.50 76.92 13.08 0.48 16.15 6.92 10.77
N12 5.00 3.15 57.69 22.31 0.45 12.31 9.23 16.15
N13 1.62 3.89 92.31 43.85 0.50 15.38 7.31 17.69
N14 4.69 2.05 65.38 46.92 0.29 16.92 6.15 18.46
表 2 PLS推论的最优组合菌株 NX9发酵液中 1含量
的预期值和实测值
Tab.2 The Expected and Measured Value of 1 through
the Optimized Fermentation Medium of Strain NX9
优化推论值/g·L-1 1/g·L-1
x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 预测值 实测值
1.00 0.20 50.00 50.00 0.50 10.00 5.00 0.10 17.63 16.93
综上，确定培养基配方 (g/L) 为：马铃薯
200，丙酮酸钠 1、乙酸钠 0.2、甘露醇 50、葡萄糖
50、硫酸镁 0.5、硫酸铵 10、硝酸钠 5、VB6 0.1；
pH 6.4。
2.6 种子液的制备
为进一步提高菌株 NX9的 1产量，以上述优
化的培养基同时作为种子和发酵培养基。将在 PDA
培养基上活化的菌株接种于优化培养基 80 ml中
(250 ml摇瓶 )，28 ℃振荡 (140 r/min) 培养 60 h制
备种子液，种子液以 8％的接种量转接于优化培养
基 80 ml中 (250 ml摇瓶 )，28 ℃振荡 (140 r/min)
培养 10 d。取发酵液按“2.2.1”项下方法处理，并
测定其中的 1。结果发酵液中 1的含量为 27.48 g/L。
3 讨论
本试验基于均匀设计和 PLS回归分析优化菌株
NX9的发酵培养基，与传统发酵培养基的优化方法
(如正交实验设计、响应面设计等 )相比 [9]，本法
更加简便高效，采用优化所得培养基为发酵培养基，
发酵液中的 1含量提高至 16.93 g/L。
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1为倍半萜生物碱，其生物合成通路尚不明确，
萜类化合物的共同前体异戊二烯焦磷酸 ( IPP) 是由
CoA经甲羟戊酸途径合成的 [10]。此外，Ma和 Luo
等的研究发现 [11-13]，在 1的合成通路中有聚酮合酶
的参与，本试验通过额外添加萜类化合物及聚酮类
化合物前体物的辅料，提高前体物质供应，促进目
标产物的合成，结果显示丙酮酸钠及乙酸钠均能显
著提高菌株 NX9的 1产量。而 CoA属于生物大分
子物质，推测在发酵液中不能直接被利用，对 1的
含量无明显的提高作用。
种子质量是影响发酵生产水平的重要因素。种
子质量的优劣，除了取决于菌种本身的遗传特性外，
发酵条件也是重要因素之一。本研究将优化后的培
养基作为种子培养基制备种子液，并进行发酵培养，
所得发酵液中 1的含量提高至 27.48 g/L。
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