全 文 ：广西科学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　 2010, 26( 3): 237～ 238, 241
Journal of Guangxi Academ y of Sciences　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 Vol. 26, No. 3　 August 2010
收稿日期: 2010-06-26
作者简介:周　琳 ( 1965-) ,女 ,工程师 ,主要从事有机生化分析研究
及大型仪器设备管理工作。
* 广西科技基础条件平台建设项目 ( No: 07-105-0001-012)资助。
高效液相色谱法测定野生毛葡萄中的白藜芦醇*
Determination of Resveratrol in Wild Grape by HPLC
周　琳 ,陈秋虹
ZHOU Lin, CHEN Qiu-hong
(广西分析测试研究中心 ,广西南宁　 530022)
( Guangxi Research Center of Analysis and Testing, Nanning, Guangxi , 530022, China)
摘要:为了建立整颗野生毛葡萄中白藜芦醇含量的高效液相色谱分析方法 ,采用组织分散匀质器将葡萄匀浆
后用无水硫酸钠研磨干燥均匀样品 ,再用乙酸乙酯提取作为前处理方法 ,通过优化各种实验条件 ,选择色谱柱
为 Symmetr yshielyTM RP18柱 ( 4. 6 mm× 250mm, 5μm) ,流动相为乙腈 - 0. 1%醋酸溶液 ( 25∶ 75) ,检测波长
为 306nm的实验方法进行实验。 结果表明 ,白藜芦醇在 1. 32～ 4. 80μg /ml的范围内线性关系良好 ,平均回收
率为 97. 3% , RSD为 2. 24% 。 该方法简单准确 ,重现性好 ,可以用于山葡萄酒原料野生毛葡萄的质量检测。
关键词:高效液相色谱法　白藜芦醇　野生毛葡萄
中图法分类号: O657. 72　　文献标识码: A　　文章编号: 1002-7378( 2010) 03-0237-02
Abstract: A method for determination of resv eratrol in the whole wild g rape by HPLC was
established. The grapes w as homogenated by homogeneous dispersion device and the anhydrous
sodium sulfate w as used to grind and dry the samples. Then the samples w ere ex tracted by using
ethy l aceta te as the pre-treatment methods. By optimizing a variety of experimental condi tions, a
Symmetry shielyTM RP18( 4. 6 mm× 250mm, 5μm) w as selected as column, w ith acetonit rile:
0. 1% HAC ( 25∶ 75) as mobile Phase and UV detection w aveleng th at 306nm. The results
demonst rated the calibration curv e of resv eratrol w as linear betw een 1. 32～ 4. 80μg /m l and the
average recovery was 97. 3% with RSD equating to 2. 24% . This method was proved to be
simple, rapid, accurate and can be used for the quality determination of w ild g rape.
Key words: HPLC, resv erat rol, wild g rape
　　白藜芦醇又称芪三酚 ,是一种含有芪类结构的
非黄酮类多酚化合物。白藜芦醇具有明显的抗菌、消
炎、抗癌、抗血栓、抗高血脂等作用 ,特别是对降低心
血管病几率有明显的效果 [1 ]。 白藜芦醇存在于多种
高等植物中 ,常见含白藜芦醇的植物有葡萄科葡萄
属植物、棕榈科海藻属植物、豆科槐属、花生属、三叶
草植物及虎杖、桑椹等。与其它植物相比 ,葡萄中的
白藜芦醇含量较高 ,并主要集中在葡萄果籽和果皮
中 [2 ]。白藜芦醇在葡萄中的含量因葡萄品种、产地、
生长环境的不同而存在着很大的差异 [3 ]。野生毛葡
萄果穗小、种子较大而且其出汁率较低 ,因此野生山
葡萄中酚类的含量远高于其他种植葡萄品种 ,特别
是其中对心血管起软化作用的白藜芦醇的含量较
高。目前只有对葡萄皮、籽和葡萄酒中白藜芦醇的测
定 [4～ 7 ] ,尚无整颗野生毛葡萄的测定方法。野生毛葡
萄作为山葡萄酒及饮料的原料 ,其白藜芦醇的含量
是决定山葡萄酒优质程度的指标 [ 8]。因此 ,野生毛葡
萄中白藜芦醇的测定有重要的意义。本实验在样品
前处理、提取条件选择、色谱方法改进上均做系统研
究 ,较好地解决了毛葡萄中高水分、高糖分对提取白
藜芦醇所带来的干扰 ,通过各种因素试验选择确定
了低毒、容易回收而且提取液杂质少的试剂 ,并经过
多次筛选 ,确定了能明显改善色谱峰脱尾现象色谱
条件 ,为山葡萄酒的原料野生毛葡萄质量控制建立
标准检测方法。
1　实验部分
1. 1　仪器与试剂
　　Waters ALLIANCE 2695高效液相色谱系统 ,
Empow er色谱工作站 , Wa ters2996紫外检测器 ,
T25基本分散器 , THZ-82A台式恒温振荡器。
　　白藜芦醇标准对照品 (中国药品生物制品检定
DOI : 10. 13657 /j . cnki . gxkxyxb. 2010. 03. 022
所出品 ,批号为 111535- 200502) ,乙腈 (色谱纯 ) ,
乙酸乙酯 (分析纯 ) , 醋酸 (分析纯 ) ,无水硫酸钠 (分
析纯 )。 野生毛葡萄由广西农科院提供。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　色谱条件
　　色谱柱为 Symmetry shielyTMRP18( 4. 6 mm×
250mm , 5μm)色谱柱 ,流动相为乙腈- 0. 1%醋酸溶
液 ( 25∶ 75) ,流速: 1. 0ml /min,柱温 25℃。检测波长
为 306nm。
1. 2. 2　对照品溶液的制备
　　精密称取白藜芦醇对照品 6. 60 mg,用甲醇溶
解 ,定容于 100 m l棕色量瓶中 ,制得浓度为 66μg·
ml
- 1的标准溶液。
1. 2. 3　供试品溶液的制备
　　取新鲜野生毛葡萄用分散器将毛葡萄搅成匀
浆 ,精确称取样品 5g ,加入无水硫酸钠研磨至干燥
均匀 ,置磨口三角瓶中用乙酸乙酯 50ml在 40℃恒
温下振摇提取 30min,反复提取 3次。合并乙酸乙
酯 ,减压蒸干 ,用甲醇溶解残留物 ,用 5m l棕色量瓶
定容。摇匀 ,滤过 ,续滤液用微孔滤膜 ( 0. 45μm)滤
过 ,取续滤液作为供试品溶液。
1. 2. 4　标准曲线的制备
　　白藜芦醇标准曲线的制备是精密吸取白藜芦醇
储备液 ( 66μg· ml- 1 ) 0. 1m l、 0. 5m l、 1. 0ml、 1. 5ml、
2. 0ml、 3. 0m l、 5. 0ml至 5ml棕色量瓶中 ,用甲醇稀
释至刻度 ,依次进样制备。
2　结果与分析
2. 1　线性关系
　　以对照品进样量为横坐标 ,峰面积为纵坐标 ,将
所得数据绘成标准曲线 ,白藜芦醇线性方程为 Y
= - 87. 2+ 38. 8X , 相关系数 0. 9970,线性范围
1. 32～ 4. 80μg /ml。 最低检测限为 0. 026μg /ml。
2. 2　精密度试验
　　精密吸取白藜芦醇标准对照品溶液 ( 66μg·
ml
- 1 )各 20μl,重复进样 5次 ,测定峰面积 , RSD =
0. 44% ,表明精密度良好。
2. 3　稳定性试验
　　取同一份供试品溶液 ,按供试品溶液的制备操
作方法 ,在 0h、 1h、 1. 5h、 2h、 5h、 10 h分别测定计算
白藜芦醇的峰面积 , RSD为 0. 53% ,表明供试品溶
液在避光情况下 10h内稳定。
2. 4　重复性试验
　　对同一批样品取样 5份 ,按供试品溶液的制备
操作方法 ,依法测定计算白藜芦醇的含量 , RSD为
2. 57% ,表明方法重复性良好。
2. 5　回收率试验
　　精密称取已知含量的样品 5份 (称样量为原来
的一半 ) ,精密加入白藜芦醇对照品 ,按供试品溶液
的制备方法进行操作 ,测定计算回收率 ,结果 (表 1)
表明方法回收率较好 (平均回收率为 97. 3% , RSD
为 2. 24% )。
表 1　回收率试验结果
样品含量
(μg) 加标量(μg) 测得量(μg ) 回收率(% )
13. 85 9. 2 22. 82 98. 99
13. 33 9. 2 22. 42 99. 49
13. 63 9. 2 22. 64 99. 15
13. 21 13. 8 25. 84 95. 69
13. 60 13. 8 26. 38 96. 26
12. 36 13. 8 24. 79 94. 77
12. 38 18. 4 28. 85 93. 73
14. 05 18. 4 31. 97 98. 50
12. 07 18. 4 30. 35 98. 96
2. 6　样品测定
　　按 1. 2. 3项的方法制备供试品溶液 ,分别吸取
供试品溶液 20μl、对照品溶液 10μl,在上述色谱条件
下进样 11批 ,测定峰面积 ,按外标法以峰面积计算
白藜芦醇含量 ( mg /100g )分别为: 0. 36, 0. 19, 0. 58,
0. 49, 0. 54, 0. 55, 0. 47, 0. 54, 0. 36, 0. 28, 0. 14。
3　讨论
3. 1　样品前处理
　　白藜芦醇是葡萄植株受到真菌感染 ,紫外照射
等不利条件产生的抗逆物 ,是一种植物抗毒素 ,主要
产生在果实的表皮中 [9 ]。 目前对于葡萄组织的测定
一般采用先提取后浓缩 ,再测定的步骤 [ 10 ]。整株毛
葡萄由于水分高、糖分大 ,白藜芦醇含量低 ,较之在
葡萄皮、籽中测定难度更大。整株毛葡萄由于糖分过
高无法烘干样品 ,而且样品结块不利于提取 ,若直接
用醇类试剂提取则试剂使用量大 ,试剂含水难于浓
缩。 本实验采用组织分散匀质器将葡萄打成匀浆后
再用无水硫酸钠研磨干燥均匀样品 ,再用有机溶剂
提取 ,不仅去除水分干扰 ,而且样品分散均匀 ,提取
更全面。 我们用这样的方法提取葡萄皮中的白藜芦
醇平均含量为 4. 10mg /100g ,葡萄籽中的白藜芦醇
平均含量为 2. 37mg /100g。
3. 2　提取条件选择
　　白藜芦醇属芪类化合物 ,难溶于水 ,易溶于乙
醇、甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂 ,因此一般采用上述
溶剂作为提取剂。我们的实验发现 ,甲醇、乙酸乙
(下转第 241页 )　　
238 广西科学院学报　 2010年 8月　第 26卷 第 3期
草 中 β-蜕 皮 激 素 的 含 量 分 别 为 0. 0369% ,
0. 0401% , 0. 0395% , 0. 0410% , 0. 0395% , RSD为
1. 61% 。
2. 6　加标回收率
　　取已知含量的样品粉末 ,加入适量 β-蜕皮激素
标准溶液 ,按索氏提取法进行操作 ,再按 1. 4中色谱
条件测定 β -蜕皮激素含量并计算得到平均回收率为
99. 31% 。
2. 7　重现性
　　精密吸取 0. 80mg /ml标准溶液 10μl,按 1. 4中
色谱条件 ,重复进样 5次 ,计算得出 RSD = 2. 0%。
2. 8　样品测定
　　将 100401、 100402、 100403、 100404、 100405、
100406、 100407、 100408这 8个不同批次的蓝耳草
粉末按精密度试验方法 ,结合标准曲线分别计算蓝
耳草中 β -蜕皮激素的含量 ,结果 (表 1)比较理想。
表 1　样品的测定结果
样品批号 含量 (% ) 样品批号 含量 (% )
100401 0. 039 100405 0. 036
100402 0. 040 100406 0. 041
100403 0. 040 100407 0. 038
100404 0. 039 100408 0. 041
3　结束语
　　本文采用振荡提取法和超声提取法提取 β-蜕皮
激素。该方法操作简单 ,提取时间短 ,但激素提取不
是很完全。由于蓝耳草成分较复杂 ,我们选用中等浓
度有机相 (如 40%甲醇水溶液 )作流动相得到了较
好的分离效果 ,以甲醇为溶剂 ,索式提取法提取蓝耳
草中 β-蜕皮激素 ,用高效液相色谱法测定其含量 ,所
得线性关系、回收率、精密度、重现性都比较满意 ,对
样品含量的测定 ,也取得了较好的结果。该结果为蓝
耳草的进一步开发利用提供了依据。
参考文献:
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(责任编辑: 尹　闯 )　　
(上接第 238页 )
酯提取率较乙醇高 ,甲醇与乙酸乙酯提取率相当。与
甲醇相比 ,乙酸乙酯低毒、沸点低易回收 ,提取液色
素含量低 ,色谱杂质峰少 ,故本实验采用乙酸乙酯为
提取试剂。通过对提取方式 (加热回流、超声、振摇 )、
提取时间、提取温度、料液比、提取次数分别做单因
素实验 ,确定出实验方案为: 每次用乙酸乙酯 50ml
在 40℃恒温下振摇提取 30min,分别提取 3次。特别
的是白藜芦醇对光不稳定 ,其反式异构体见光后发
生异构化而形成顺式 ,因此所有操作应严格避光。
3. 3　色谱条件的选择
　　本次试验通过对色谱条件的多次筛选 ,确定选
用 Symmetry shielyTMRP18 ( 4. 6 mm× 250mm ,
5μm )作为色谱柱 ,选用乙腈-0. 2%醋酸溶液 ( 25∶
75)作为流动相。优于其他的溶液系统磷酸盐 -乙腈 ,
乙腈 -水等 ,达到更好的分离效果 ,而且能够明显改
善色谱峰脱尾现象。
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(责任编辑: 邓大玉 )　　
241徐　慧等:高效液相色谱法测定蓝耳草中 β -蜕皮激素含量