全 文 ：柳兰鞣质含量动态分析及体外抗氧化作用研究
刘 娟，郝春艳，李凤伟
(佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007)
摘要:目的:通过测定不同生长期柳兰中鞣质的含量，分析柳兰中鞣质含量的动态积累规律并研究其体外抗氧化活性。
方法:采用紫外分光光度法对不同生长期柳兰中鞣质进行含量测定，并采用 DPPH 自由基体系、超氧阴离子自由基体系，对其
进行体外抗氧化活性进行研究。结果:柳兰中鞣质含量呈规律性变化，在花蕾期含量最高，含量为 12． 50%，果期含量最低，含
量为 5． 32%;柳兰鞣质对 DPPH自由基及超氧阴离子自由基均有抑制作用。结论:确定了柳兰鞣质含量的动态积累规律，其
变化规律对确定药材的最佳采收期有指导意义;柳兰鞣质具有明显外抗氧化作用。
关键词:柳兰;紫外分光光度法;鞣质;抗氧化活性
中图分类号:Ｒ284 文献标识码:A 文章编号:1008 － 0104(2014)03 － 0019 － 03
柳兰(Chamaenerion angustifoliu)为柳叶菜科柳兰属多年
生草本植物［1，2］，异名糯芋(云南)、大救驾(湖北)、山麻条
(四川)，又名红筷子。柳兰全草入药，性辛、苦、平，有小毒，
具有调经活血及消肿止痛的功效，用于治疗骨折、关节扭伤、
月经不调、阴囊肿大等症［3］。目前已经从柳兰中分离出了 4
个黄酮类化合物和 9 个鞣质及其小分子多元酚类化合
物［4，5］。其提取物具有抗肿瘤和抗炎作用［6，7］。鞣质也称单
宁，是一类水溶性的含多酚羟基结构的化合物，其具有较强
的化学活性及生理活性，如抗氧化、抗病毒、抗衰老、止血作
用等［8］。通过对相关文献的查阅，目前尚未见有对其鞣质含
量测定及其所含化学成分鞣质的体外抗氧化活性的相关报
道，因此本文以柳兰鞣质含量变化为指标，采用紫外分光光
度法测定了不同生长期柳兰中鞣质的含量，研究柳兰中鞣质
的动态积累规律，并测定其鞣质成分的体外抗氧化活性，为
柳兰的开发利用及药材采收加工提供科学依据。
1 材料、仪器与试剂
1． 1 试验材料
柳兰样品分别于 2013 年 5 ～ 8 月采自黑龙江省佳木斯
市汤原县葫芦岛，经佳木斯大学生药学教研室刘娟教授鉴定
为柳叶菜科植物柳兰(Chamaenerion angustifoliu)。
1． 2 试验仪器
紫外分光光度计 (上海棱光技术有限公司)，电子天平
(上海恒平科学仪器有限公司)，HH － 2． 4 型恒温水浴锅
(郑州长城科工贸有限公司)，微型植物粉碎机(天津市泰斯
特仪器有限公司)。
1． 3 试验试剂
没食子酸标准品(中国药品生物制品检定所，批号:0831
－ 9501);DPPH标准品(Sigma 公司);邻苯三酚、丙酮、钼酸
钠、硫酸锂、钨酸钠、盐酸、溴、磷酸均为分析纯。干酪素为化
学纯。
2 方法与结果
2． 1 柳兰鞣质的含量测定
2． 1． 1 溶液的配制
磷钼钨酸试液的配制:称取钼酸钠 25g、钨酸钠 100g，加
入水 700mL 将其溶解，再加入磷酸 50mL、盐酸 100mL，加热
回流 10h，冷却，继续加入硫酸锂 150g、水 50mL 和液溴
0． 2mL，加热煮沸约 15min 以除去残留的溴，用水稀释至
1000mL，过滤，收集滤液，即得黄色磷钼钨酸试液。对照品溶
液的制备:准确称取没食子酸对照品 50mg，置于 100mL棕色
容量瓶中，加水溶解，稀释至刻度，准确量取上述溶液 5mL，
置于 50mL棕色容量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀，即得浓度
为 0． 05mg /mL的对照品溶液。
供试品溶液的制备:精密称取过四号筛的柳兰干燥全草
粉末 1g 于三颈瓶中，以 60%丙酮为溶剂，料液比为 1:20，
70℃水浴回流 2h，滤过，定容于 25mL容量瓶中，从中精密量
取 5mL定容于 100mL容量瓶中，即为供试品溶液。
2． 1． 2 标准曲线的绘制
准确移取没食子酸对照品溶液 0． 5mL、1． 0mL、2． 0mL、
3． 0mL、4． 0mL、5． 0mL，分别置于 25mL 棕色容量瓶中，再各
加入磷钼钨酸试液 1mL，分别加入水 11． 5mL、11mL、10mL、
9mL、8mL、7mL，以 29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，避光
静置 30min。以相应的试剂作为空白，照紫外可见分光光度
法，在 760nm波长处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为
纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为:y = 101． 7x + 0． 022。
图 1 没食子酸标准曲线
2． 1． 3 含量测定条件的选择
显色时间:根据 2010 年版《中国药典》方法，样品溶液中
加入显色剂静置 30min 后，其中的酚酸可与显色剂完全反
应，经稳定性考察表明，溶液显色后在 3 h内稳定。因此选择
显色时间为 30 min，并且在 3 h内测定吸光度。
干酪素用量:分别准确称取 0． 4、0． 5、0． 6、0． 7、0． 8、0． 9g
干酪素，沉淀等量的样品(供试品溶液 25mL)。结果表明，随
着干酪素用量的增加，游离多酚的含量逐渐减少，当干酪素
用量达 0． 8g时，溶液中的游离多酚含量不再减少，说明其中
的鞣质已被干酪素吸附完全。由此确定干酪素用量为 0． 8g。
2． 1． 4 鞣质含量测定方法
总酚:精密吸取一定量的供试品溶液，置于 25mL棕色容
量瓶中，按照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸
试液 1mL”起，再加水补至 13mL，以 29%碳酸钠溶液稀释至
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刻度。依法测定溶液吸光度，在标准曲线中读出供试品溶液
中没食子酸的量(mg)，计算即得。
不被吸附的多酚:准确量取供试品溶液 25mL，加于已盛
有干酪素 0． 8g的 100mL具塞锥形瓶中，密封，置于 30℃水浴
中，保温 1h，每隔 5min振摇一次，取出放冷，摇匀，过滤，弃去
初滤液，准确量取续滤液 5mL，置于 25mL 棕色容量瓶中，按
照标准曲线制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液 1mL”
起，再加水补至 13mL，以 29%碳酸钠溶液稀释至刻度。依法
测定吸光度，在标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量
(mg)，计算即得。
按照下式计算鞣质的含量:
鞣质含量 =总酚的量 －不被吸附的多酚量
2． 1． 5 方法学考察
精密度试验:准确移取供试品溶液 1mL，按照总多酚含
量测定的方法，测定样品的吸光度，连续测定 6 次，ＲSD 为
0． 19%，表明仪器精密度良好。
稳定性考察:准确移取同一供试品溶液 1mL，按照总多
酚含量测定方法进行显色，分别在显色后 0． 5，1，1． 5，2，2． 5，
3 h测定溶液的吸光度。结果表明，随着显色后放置时间的
延长，样品溶液的吸光度在逐渐的下降，但在 3 h内溶液吸光
度的 ＲSD为 2． 6%(n = 6)，表明样品显色后至少在 3h 内稳
定。
重复性考察:取 6 份同一柳兰样品粉末 1g，平行制备供
试品溶液 6 份，按“2． 1． 4”项下方法测定鞣质含量，结果鞣质
含量平均为 12． 07%，ＲSD为 2． 3%，结果表明此方法重复性
良好。加样回收率考察:取同一柳兰样品粉末 9 份，每份 1g，
精密称定，平行制备供试品溶液，分别加入一定量的没食子
酸对照品溶液，使得没食子酸的加入量为柳兰样品中总多酚
含量的 50%(3 份)、100%(3 份)和 150%(3 份)。按照总多
酚含量的测定方法测定样品中总多酚含量，计算其加样回收
率，结果其平均加样回收率为 99． 03%，ＲSD为 2． 55%。
2． 1． 6 柳兰样品含量测定
取不同采收时期柳兰全草干燥粉末各 1g，供制备试品溶
液，准确移取供试品溶液 1mL，在“2． 1． 4”项条件下显色，测
定其吸光度，每个样品平行测定两次，取平均值，计算鞣质含
量。
表 1 不同采收期柳兰中鞣质的含量测定(%，n = 2)
采收时间 采收期 总酚含量 不被吸附酚含量 鞣质含量
2013． 05 幼苗期 11． 71 1． 11 10． 60
2013． 06 花蕾期 13． 51 1． 01 12． 50
2013． 07 花果期 13． 10 1． 14 11． 96
2013． 08 果期 6． 26 0． 94 5． 32
研究结果表明柳兰中鞣质含量随着生长期不同呈规律
性变化，不同时期柳兰中鞣质含量由高到低依次为:花蕾期
＞花果期 ＞幼苗期 ＞果期。
2． 2 柳兰鞣质的纯化
取提取液适量，加入过量 1%热明胶溶液，使其充分沉
淀，直至沉淀不再产生为止，过滤，将沉淀置于丙酮中，过滤，
减压回收溶剂至干，即得柳兰鞣质提取物粉末。
2． 3 柳兰鞣质体外抗氧化活性评价
2． 3． 1 对 DPPH自由基的清除作用
分别取不同浓度(0． 002、0． 004、0． 006、0． 008、0． 01mg /
mL)的柳兰鞣质溶液2． 0mL于试管中，分别加入 DPPH 溶液
2． 0mL，于 37℃避光反应 30min，在 517nm波长处测定其吸光
度值(AS)。同时，在 517nm处测定不同浓度样品2． 0mL加乙
醇2． 0mL的吸光度值(AC)，乙醇 2． 0mL 加 DPPH 2． 0mL的吸
光度值(A0)。并计算 DPPH 自由基清除率。以 Vc 溶液作
为阳性对照。其清除率按下式计算:
清除率(%)=［1 －(AS － AC)］/A0 × 100%
图 2 柳兰鞣质对 DPPH的清除能力
图 3 Vc对 DPPH的清除能力
维生素 C和柳兰鞣质对 DPPH自由基均有清除作用，随
着浓度升高，清除率增大，其 IC50 值分别为 0． 00502mg /L 和
0． 00632mg /mL，二者较为接近，表明柳兰鞣质具有较好的清
除 DPPH自由基的作用。
2． 3． 2 对超氧阴离子自由基的清除作用
在试管中准确加入 5mL Tris － HC1 缓冲溶液(pH = 8． 2)
和 2． 0mL 不同浓度的样品(0． 008mg /mL，0． 016mg /mL，
0． 024mg /mL，0． 032mg /mL，0． 04mg /mL)，混匀后在 25℃恒
温水浴中反应 20min，取出后迅速加入 50μL 经 25℃预热的
5mmol /L的邻苯三酚，摇匀后立即倒入比色皿中，于 325nm
处以 30s为时间间隔，扫描其在 5min内的 OD值。以同样操
作的 2． 0mL超纯水代替样品溶液作为平行对照，以同样操作
的 Vc溶液作为阳性对照组，以 pH = 8． 2 的 Tris － HC1 缓冲
溶液为空白对照。根据邻苯三酚每分钟自氧化率计算抑制
率，按照下列公式计算:
抑制率(%)=(ΔA0 /Δt － ΔA1 /Δt)/(ΔA0 /Δt)
ΔA0 /Δt—平行对照组邻苯三酚在该时段的自氧化率;
ΔA1 /Δt—加入样品后邻苯三酚在该时段的自氧化率;
由图可知，维生素 C和柳兰鞣质对超氧阴离子自由基清
除作用均随着浓度的增加而增强，其 IC50 值分别为
0． 01mg /mL和 0． 028mg /mL，说明柳兰鞣质具有一定抗超氧
阴离子自由基的活性，但较维生素 C弱。
·02· 黑龙江医药科学 2014 年 6 月第 37 卷第 3 期
图 4 柳兰鞣质对超氧阴离子自由基的清除作用
图 5 Vc对超氧阴离子自由基的清除作用
3 讨论
采用紫外分光光度法测定柳兰鞣质，经过方法学的验
证，其试验稳定性、仪器精密度、加样回收率及方法重现性均
达到分析要求，且该方法简便快捷，准确性高，操作简单、省
时、取样量少，适用于柳兰鞣质的含量测定。但其干酪素用
量对实验结果具有一定影响，因此本实验对干酪素用量进行
了考察，将其可吸附多酚完全吸附，确保了结果的准确性。
研究结果显示柳兰中鞣质含量随着生长期不同呈规律性变
化，在花蕾期含量最高，含量为 12． 50%，果期含量最低，含量
为5． 32%，这可能是由于其生长环境、阳光、温度、降水量等
条件的改变所致。该结果表明，若以鞣质作为其有效成分之
一，柳兰药材的最佳采收期为花蕾期。
本实验通过对柳兰鞣质体外抗氧化活性的研究，表明柳
兰鞣质对于 DPPH自由基和超氧阴离子自由基均具有一定
的清除作用。表明柳兰在医药、保健品等行业的应用具有远
大前景。
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(收稿日期:2014 － 03 － 14)
作者简介:刘娟(1949 ～)女，黑龙江佳木斯人，教授，硕士研究生导师。
通讯作者:郝春艳(1988 ～)女，黑龙江齐齐哈尔人，在读硕士研究生。E － mail:lznvhai@ 126． com。
Study on dynamics of tannin in different growth phase
of Chamaenerion angustifoliu and antioxidant activity in vitro
LIU Juan，HAO Chun － yan，LI Feng － wei
(Institute of Pharmacy，Jiamusi University，Jiamusi 154007，China)
Abstract:Objective:To measure tannin in different growth phase of Chamaenerion angustifoliu，and to ana-
lyze dynamic accumulation regularity of tannin in Chamaenerion angustifoliu，and study its antioxidant activity in
vitro． Methods:We determined the content of tannin in different growth phase of Chamaenerion angustifoliu by u-
sing UV － spectrophotometer． We made one research on its antioxidant activity in vitro by DPPH free radical system
and superoxide anion free radical system． Ｒesults:The content of tannin in Chamaenerion angustifoliu appeared
regular changes，and the content of tannin was highest in the bud stage，of which content was 12． 50% ． The con-
tent of tannin was the lowest in the mature phase，of which content was 5． 32% ． Tannin of Chamaenerion angustifo-
liu plays inhibiting bacteria effect on DPPH free radical and superoxide anion free radical． Conclusion:The dy-
namic regularity of the content of tannin in Chamaenerion angustifoliu are determined，which provide guidance to
determine the optimal harvest time of medicinal herbs． Tannin of Chamaenerion angustifoliu plays obvious anti － ox-
ygenation roles．
Key words:Chamaenerion angustifoliu;UV － spectrophotometry;tannin;antioxidant activity
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