全 文 ：　[ 收稿日期] 2002-04-26　　[ 修回日期] 2002-08-06
＊[ 基金项目] 国家自然科学基金资助项目(No.39970847);
湖南省卫生厅中医药科研课题(No.2000006)
Tel:0734-8281408;E-mail:Guoyuhy@sohu.com
Δ通讯作者:E-mail:dfliao@hotmail.com
[ 文章编号] 　1000-4718(2003)01-0010-04
金粉蕨素对甲萘醌损伤人脐静脉内皮
细胞的保护作用＊
郭　玉 , 　朱炳阳 , 　严奉祥 , 　黄红林 , 　廖端芳Δ
(南华大学药物药理研究所 , 湖南 衡阳 421001)
　　[ 摘　要] 　目的:探讨金粉蕨素对氧化应激损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用。方法:以甲萘醌损伤人脐静脉
内皮细胞 ,作为氧化损伤模型;采用MTT法 ,测定内皮细胞的生长抑制率;用硝酸还原酶法测定培养液中 NO-2 /NO-3
含量;以Western blot方法检测细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性及小凹蛋白(caveolin-1)表达。结果:金粉蕨素
呈剂量依赖性地降低甲萘醌对内皮细胞的生长抑制率 , 增加培养液中 NO-2 /NO-3 含量 , 保护 eNOS 活性 、阻止 caveolin
-1 表达下降。结论:金粉蕨素可能通过 caveolin-1/ eNOS 通路介导对抗甲萘醌对内皮细胞的氧化损伤作用。
[ 关键词] 　金粉蕨素;内皮细胞;维生素 K;一氧化氮合酶
　　[ 中图分类号] 　R363　　　　　[文献标识码] 　A
　　金粉蕨素(onychin)是从湖南永州采集到的中国
蕨科(Sinopteridaceae)金粉蕨属(Onychium ching)粟柄
金蕨粉(Onychium lucidum)植物中提出的二氢黄酮甙
(flavanone glycoside),属于黄酮类化合物。黄酮类化
合物具有抗炎 、抗氧化 、抗癌等生理及药理活性[ 1] 。
初步研究发现金粉蕨素能促进血管内皮细胞(vascu-
lar endothelial cell ,VEC)释放和合成一氧化氮(nitric
oxide ,NO),且抑制血管平滑肌细胞增殖。最近我室
研究表明金粉蕨素对溶血性磷脂酰胆碱损伤的离体
兔血管环的舒张功能有明显的保护作用 ,其作用可
被一氧化氮合酶(nitric oxide synthase ,NOS)抑制剂 N
-硝基-L-精氨酸(N-L-A)和环氧化酶抑制剂
吲哚美辛所阻断 ,提示金粉蕨素作用与其保护血管
内皮释放小分子物质 NO 和 PGI2 有关[ 2] 。目前 ,金
粉蕨素抗氧化作用机制尚不清楚 ,本实验旨在运用
甲萘醌损伤内皮细胞模型 ,通过对内皮细胞 caveolin
-1表达和 eNOS活性的研究 ,探讨金粉蕨素抗氧化
损伤内皮细胞的作用及其机制 。
材　料　和　方　法
1　材料
金粉蕨素:用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide , DM-
SO)溶解(DMSO终浓度不超过 1/1 000);甲萘醌:产
生超氧阴离子(O 2 )试剂 ,以无水乙醇作为溶媒配制
储存液(1mmol/L)[ 3] ;胰酶 、胶原酶 、M199 、内皮细胞
生长因子等为 Sigma 公司产品;NO 检测试剂盒购自
南京建成生物工程研究所;caveolin-1 、eNOS 一抗及
HRP标记的二抗购自 Santa Cruz;BCA蛋白分析试剂
(BCA protein assay reagent)购自 PIERCE公司 。
2　方法
2.1　人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein en-
dothelial cell , HUVEC)的培养　取新鲜脐带 ,置于无
菌平皿中 ,用温 PBS 洗除残血 ,向脐静脉中注入 5-
10 mL 0.1%胶原酶(Ⅱ型),于 37℃消化约 20 min ,收
集消化液 ,并用 PBS多次冲洗残余细胞 ,消化液与冲
洗液一并注入含M199培养液(20%胎牛血清 、25×
104 U/L青霉素 、250 mg/L链霉素 、20 mg/L 内皮细胞
生长因子 、90 mg/L 肝素钠)的离心管中 ,800 r/min离
心5 min;吸除上清 ,细胞沉淀重悬于 M199培养液 ,
接种于一次性培养皿中;细胞培养箱中培养 24 h 后 ,
换液 1次;待细胞融合成单层后 ,用 0.25%胰酶和
0.01%EDTA消化传代 ,以鹅卵石形状及含第 Ⅷ因子
鉴定为内皮细胞 。第 2-5代细胞供实验使用。
2.2　实验分组及处理方法　实验分 3组:①正常对
照组;②甲萘醌处理组:观察量效关系 , 分别用 5 、
10 、20 、40μmol/L甲萘醌处理内皮细胞;③甲萘醌+
金粉蕨素处理组:以 10μmol/L甲萘醌分别与不同浓
度金粉蕨素处理内皮细胞;按实验分组加入相应处
理因素 ,孵育 24 h后 ,检测相应指标。
2.3　MTT 法检测内皮细胞生长抑制率 　采用 MTT
·10· 中国病理生理杂志　Chinese Journal of Pathophysiology　2003 , 19(1):10-13
法即自动酶联仪于 570 nm 波长下测定每孔细胞 A
值。按下列公式计算细胞生长抑制率(inhibitory rate ,
IR):
　　内皮细胞生长抑制率=(正常对照组 A 值-用
药组 A值)/正常对照组 A值×100%
2.4　细胞培养液中NO-2 /NO-3 含量的测定　采用硝
酸酶还原法按南京建成生物公司提供试剂盒内说明
书方法测定细胞培养液中 NO-2 /NO-3 的含量 。
2.5　Western blot方法[ 4]检测 HUVEC 的 eNOS 活性
及 caveolin-1表达　取对数生长期的内皮细胞接种
于100 mm培养板 ,每孔加细胞悬液 6.0 mL。设正常
对照组 ,甲萘醌(10 μmol/L)损伤模型组及不同浓度
金粉蕨素组 ,作用 24 h;收集细胞以三去污裂解液裂
解细胞 ,超声处理 1-2 min;以 BCA蛋白分析试剂测
定细胞蛋白质含量 ,按每孔 80 μg 蛋白量上样 ,进行
聚丙烯酰胺垂直电泳 ,转聚偏二氟乙烯膜(Bio Trace
PVDF),分别杂交 eNOS 、caveolin-1 抗体;再于暗室
显影 ,定影 。然后将Western blot结果经 Labwork计算
机软件分析灰图面积值(mean density×area),以正常
组为 1 ,其余各组与正常组比较 ,作直方图。
3　统计学处理
实验数据均采用 x±s表示 ,组间比较经方差齐
性分析后进行 t 检验 。
结　　果
1　甲萘醌对细胞增殖的影响
甲萘醌对内皮细胞生长抑制作用呈剂量依赖
性 ,低剂量甲萘醌(1 μmol/L)对内皮细胞无明显影
响 ,随着甲萘醌浓度增高 ,内皮细胞受抑制程度逐渐
增强 ,当甲萘醌浓度 >40 μmol/L 时 ,镜下可见大部
分细胞脱落 ,死亡。MTT 法检测时 ,加入 DMSO基本
不显色(图 1)。
Fig 1　Concentration-effect curve of menadione on EC growth inhi-
bition.＊P<0.05 vs control group( x±s.n=8).
图 1　甲萘醌抑制内皮细胞增殖的浓度曲线
2　金粉蕨素对受损内皮细胞增殖的影响
甲萘醌(10μmol/L)作用内皮细胞 24 h 后 ,细胞
的生长增殖明显受到抑制 ,其生长抑制率达 63.3%,
以不同剂量的金粉蕨素 1 、5 、10μmol/L 同甲萘醌(10
μmol/L)一起与内皮细胞孵育 ,金粉蕨素呈剂量依赖
性地对抗甲萘醌的损伤作用 ,降低甲萘醌对内皮细
胞的抑制率(表 1)。
表 1　金粉蕨素对甲萘醌损伤内皮细胞的保护作用
Tab 1　Protective effect of onychin on inhibitory growth of EC injured
by menadione( x±s.n =8)
Group A Inhibitory rate
Control 0.770±0.028 /
M 0.283±0.033 63.3%
M+O(1μmol/ L) 0.342±0.053# 55.6%
M+O(5μmol/ L) 0.580±0.075# 24.7%
M+O(10μmol/L) 0.632±0.068# 17.9%
M+DMSO(1/1 000) 0.273±0.063 64.5%
　#P <0.05 vs menadione(10 μmol/ L)group.M:menadione
(10μmol/ L);O:onychin.
3　金粉蕨素对培养液中 NO-2 /NO-3 含量的影响
图 2结果表明 ,甲萘醌(10 μmol/L)组细胞培养
液中 NO-2 /NO-3 含量明显低于正常组;而金粉蕨素
组随着金粉蕨素浓度的增加 , 其细胞培养液中
NO-2 /NO-3 的含量明显上升 ,与甲萘醌组比较 ,具有
显著差异(图 2)。
Fig 2　Influence of onychin on NO-2 /NO-3 concentration of EC in-
jured by menadione.＊P<0.05 vs control group. x±s.n
=6.
图2　金粉蕨素对甲萘醌损伤的内皮细胞培养液中 NO-2 /
NO-3 含量的影响
4　金粉蕨素对内皮细胞 eNOS及 caveolin-1 表达
的影响
　　Western blot 检测结果显示 ,正常组细胞表达大
量的 eNOS 和 caveolin-1;甲萘醌明显降低 eNOS 和
caveolin-1的表达;金粉蕨素呈浓度依赖性阻断甲萘
醌对 eNOS 及 caveolin -1 表达的下调 , 其溶媒组
(DMSO)对 eNOS 和 caveolin-1的表达无上调作用
(图 3 ,图 4)。
·11·
Fig 3　Effect of onychin on eNOS activity of EC injured by mena-
dione.＊P<0.05 vs menadione group. x±s.n=3.
图 3　金粉蕨素对甲萘醌损伤的内皮细胞 eNOS活性的影响
Fig 4　Influence of onychin on caveolin-1 protein levels of EC in-
jured by menadione.＊P <0.05 vs menadione group. x±
s.n=3.
图4　金粉蕨素对甲萘醌损伤的内皮细胞 caveolin-1 表达的
影响
讨　　论
氧自由基对内皮细胞增殖有明显的影响 ,低剂
量的氧自由基可延迟细胞死亡 、抑制存活细胞增殖 ,
过量的超氧化物导致细胞急剧坏死 ,使活细胞数量
明显减少 ,造成对血管壁的损伤 。在经皮腔内冠脉
成型术中 ,由于对斑块部位内皮细胞的剥脱 、破坏 ,
以及术前炎症产生的高浓度活性氧仍然存在 ,使剥
脱部位周围区域的内皮细胞功能紊乱 、增殖受抑 ,从
而导致术后再狭窄的发生 、发展 。经皮腔内冠脉成
型术后受损部位周围内皮细胞的增殖 、迁移和功能
恢复的速度对术后最终损伤形成程度及再狭窄进展
的速度起关键作用[ 5] 。金粉蕨素能使内皮细胞生长
抑制率降低 ,提示内皮细胞再生功能恢复 ,这对经皮
腔内冠脉成型术后再狭窄的防治具有十分重要的意
义。
NO为血管内皮源性舒张因子 ,能清除细胞代谢
中产生的氧自由基;同时 NO也是一种信号分子;一
般认为 NO-2 /NO-3 是 NO 稳定的代谢产物 , NO-2 /
NO-3 的结果可反应 NO 的水平 。金粉蕨素能使细胞
培养液中 NO-2 /NO-3 的含量增加 ,表明细胞合成和
释放NO的量增加 ,提示合成 NO的合酶(eNOS)可能
受到影响。在内皮细胞中 eNOS 主要与 caveolin-1
结合存在于细胞小凹(caveolae)的脂质区域;caveolae
是细胞膜上直径约 50-100nm ,富含胆固醇和磷脂的
特异性凹陷结构 ,其主要组成蛋白为 caveolin-1;
caveolin-1可充当 eNOS 的“分子伴娘”而调节其功
能活性[ 6 , 7] 。
用Western blot的方法观察到金粉蕨素能使甲萘
醌损伤内皮细胞的 eNOS 和 caveolin-1表达均上调 ,
说明金粉蕨素可能通过增加 eNOS 、caveolin-1 的表
达 ,使 NO 的合成和释放增加 ,增强细胞清除氧自由
基的能力;另外 ,金粉蕨素是一种易氧化的黄酮类化
合物 ,是O 2 捕捉剂和 O 2 淬没剂 ,能抑制氧自由基
形成[ 8] ;从而具有对抗甲萘醌对细胞的氧化损伤作
用。
[ 参　考　文　献]
[ 1] 　彭　芳 , 陈植和.300 黄酮类化合物的生物学活性[ J] .
国外医学:植物药分册 , 1998 , 13(5):207-209.
[ 2] 　庹勤慧 , 黄红林 , 谢志忠 , 等.金粉蕨素对溶血性磷脂
酰胆碱损伤血管内皮依赖性舒张功能的保护作用及机
制[ J] .中国动脉硬化杂志 , 2001 , 9(1):27-30.
[ 3] 　Lee JL , Bae ON , Chung SM , et al.Menadione induces en-
dothelial dysfunction mediated by oxidative stress and arylation
[ J] .Chem Biol Interact , 2001 , 137(2):169-183.
[ 4] 　Liao DF , Jin ZG , Baas AS , et al.Purification and identification
of secreted oxidative stree - induced factors from vasular
smooth muscle cells[ J] .J Biol Chem , 2000 , 275(1);189-
196.
[ 5] 　Kerjcy K , Schwarzacher S , Ferber W, et al.Expression of VCAM
-1 in rabbit iliac arteries is associated with vasodilator dysfunc-
tion of regenerated endothelium following balloon injury [ J] .
Atherosclerosis , 1996 , 122(1):59-67.
[ 6] 　Peterson TE , Poppa V , Ueba H , et al.Opposing effects of re-
active oxygen species and cholesterol on endothelial nitric ox-
ide synthase and endothelial cell caveolae[ J] .Circ Res ,
1999 , 85(1):29-37 .
·12·
[ 7] 　Annotte U , Philip WS , Ivan SY , et al.High density lipoprotein
prevents oxidized low density lipoprotein-induced inhibition of
endothelial nitric-oxide synthase localization and activation in
caveolae[ J] .J Biol Chem , 2000 , 275(15):11278-11283.
[ 8] 　White HL , Scates PW , Cooper BR.Extracts of Gmkgo Biloba
Leaves inhibit monoamine oxidase [ J] .Life Sci , 1996 , 58
(16):1315-1317.
Protective effect of onychin on the human umbilical
vein endothelial cells injured by menadione
GUO Yu , ZHU Bing-yang ,YAN Feng-xiang , HUANG Hong-lin , LIAO Duan-fang
(The Institute of Pharmacy and Pharmacology , Nanhua University ,Hengyang 421001 , China)
　　[ ABSTRACT] 　AIM:To investigate the protective effect of onychin on the endothelial cells injured by oxidative
stress.METHODS:The injured model was established by endothelial cells treated with menadione.The growth in-
hibitory rate of endothelial cell was determined by MTT assay;NO-2 /NO-3 concentration in the medium was determined
by nitrate reductase assay;eNOS and caveolin-1 protein levels were determined by Western blot.RESULTS:Onychin
significantly decreased the growth inhibitory rate of endothelial cells injured by menadione , increasedNO-2 /NO-3 concen-
tration in the medium and eNOS activity and up-regulated caveolin-1 expression.CONCLUSION:Onychin possesses
a protective effect against endothelial cell injury induced by menadione via caveolin-1/eNOS pathway.
　　[ KEY WORDS] 　Onychin;Endothelial cell;Vitamin K;Nitric-oxide synthase
(上接第 5 页)
表 1　急性心肌缺血对中性粒细胞浸润数 、PMN 表面 L-selectin及 EC表面 P-selectin的影响
Tab 1　Effects of acute myocardial ischemia on neutrophil infiltration , L-selectin on the surface of PMN and P-selectin on the surface of
EC( x±s.n=10)
Group PMN(×104/g) L-selectin(%) P-selectin- +/ ++ +++ ++++
Control 1.32±0.18 5.25±0.96 10 - - -
Ischemia 5.19±0.60＊ 26.00±3.85＊ - 2 6 2＊
　＊P<0.01 vs control group.
讨 　　论
　　选择素是体内重要的粘附分子 ,其重要特性是在炎性反
应中诱导白细胞粘附并最终跨内皮细胞迁移入组织 , 释放出
毒性物质 , 引起组织损伤。现知 , L-选择素的配体为 CD34、
唾液酸寡糖依赖的细胞粘附分子-1 ,而 P-选择素的配基为
P-选择素糖蛋白配基-1 , L-选择素和 P-选择素与其相应
的配基结合后可介导 PMN 沿 EC 滚动(rolling), 滚动是 PMN
与血管壁发生粘附的第一步 , 也是后来通过其它粘附分子途
径使细胞牢固粘附及细胞外渗的先决条件。
本实验显示 , 缺血组 L-选择素和 P-选择素的表达显
著增强(P<0.01),并伴随着心肌内 PMN 浸润数的明显增加
(P<0.01)。提示 ,急性心肌缺血后 L-选择素和 P-选择素
表达的增强可以促进 PMN 与 EC 的粘附 ,而一旦 PMN 粘附到
EC 上 ,则可通过释放氧自由基 、弹性蛋白酶等一系列细胞毒
性物质导致血管功能失调和组织损伤 , 从而导入一个恶性循
环。因此 , L-选择素和 P-选择素在 PMN 介导的急性心肌
缺血心肌损伤机制中起着重要的中介作用。 有研究表明 , L
-选择素和 P-选择素表达上调的机制可能与急性心肌缺血
后细胞因子白细胞介素-1 、白细胞介素-8 、肿瘤坏死因子的
分泌增加[ 5] 及一氧化氮的合成减少有关[ 6] 。 故给予急性心
肌缺血病人 L-选择素和P-选择素的单克隆抗体治疗可能
对缺血心肌有一定的保护作用 ,值得进一步探讨。
[ 参　考　文　献]
[ 1] 　周　同 , 宋长玲.细胞粘附分子与心血管疾病[ J] .中
国循环杂志 , 1995 , 10(8):502-504.
[ 2] 　郭　鹞 主编.人类疾病的动物模型[ M] .第 2 版.北
京:人民卫生出版社 , 1982.367-369.
[ 3] 　倪灿荣 主编.免疫组织化学实验新技术及应用[ M] .
第 1 版.北京:北京科学技术出版社 , 1993.102-104.
[ 4] 　Bradley PP.Measurement of cutaneous inflammtion:estima-
tion of neutrophil content with an enzyme marker [ J] .J Invest
Dermatol , 1982 , 78(3):206-209.
[ 5] 　Thorlacius H , Lindbom L , Raud J.Cytokine-induced leuko-
cyte rolling in mouse cremaster muscle arterioles in P-selectin
dependent [ J] .Am J Physiol , 1997 , 272(4 Pt 2):H1725-
H1729.
[ 6] 　Pruefer D , Scalia R , Lefe AM.Homocysteine provokes leuko-
cyte-endothelium interaction by downregulation of nitric oxide
[ J] .Gen Pharmacol , 1999 , 33(6):487-498.
·13·