全 文 ：基金项目:新药创制国家科技重大专项资助(2012ZX09102201-10)
作者简介:高帅，男，硕士研究生 研究方向:中药新药新剂型研究 * 通讯作者:张琳，女，副教授，硕士生导师 研究方向:中药新药与
中药生物技术 Tel /Fax:(0571)87951301 E-mail:zhanglin@ zju. edu. cn
细梗香草总皂苷壳聚糖絮凝纯化工艺研究
高帅1，2，李凌军1，栾明1，2，徐婵娟2，李锡敏3，于秀颖2，张琳2* (1. 山东中医药大学药学院，济南 250014;2. 浙江大学生物医
学工程与仪器科学学院，杭州 310027;3. 常熟求是科技有限公司，江苏 常熟 215500)
摘要:目的 研究细梗香草总皂苷壳聚糖絮凝纯化工艺，为继续纯化三萜皂苷 B( LC-B) 和三萜皂苷 C( LC-C) 奠定基础。方法
用可见分光光度法、高效液相色谱-蒸发光散射检测法( HPLC-ELSD) ，分别测定总皂苷中间体水溶液絮凝率、总皂苷损失
率，以絮凝率和总皂苷损失率为指标，用正交实验优选壳聚糖絮凝纯化最佳工艺条件。结果 最佳工艺条件为总皂苷质量浓
度为 0. 6 mg·mL －1，每 100 mL总皂苷水溶液加入壳聚糖溶液 30 mL，絮凝温度 60 ℃，絮凝时间 4 h。验证结果表明，总皂苷
中间体水溶液澄清率为 47. 81%，总皂苷损失率为 9. 53%。结论 与传统除鞣质工艺相比，壳聚糖絮凝纯化工艺能有效保留
有效成分，工艺稳定性好，适合工业化生产。
关键词:细梗香草;总皂苷;三萜皂苷 B;三萜皂苷 C;壳聚糖;高效液相色谱-蒸发光散射检测法
doi: 10. 11669 /cpj. 2014. 13. 005 中图分类号:Ｒ284 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2014)13 － 1113 － 04
Flocculation and Purification of the Total Saponins of Lysimachia capillipes Hemsl. with Chitosan
GAO Shuai1，2，LI Ling-jun1，LUAN Ming1，2，XU Chan-juan2，LI Xi-min3，YU Xiu-ying2，ZHANG Lin2* (1. Col-
lege of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250014，China;2. College of Biomedical Engineering
and Instrument Science，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China;3. Changshu Qiushi Technology Co.，Ltd，Changshu 215500，
China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To study the flocculation process of the total saponins intermediate solution of Lysimachia capillipes
Hemsl. with chitosan and lay the foundation for separation of the total saponins monomer components by medium pressure column.
METHODS Visible spectrophotometry and HPLC-ELSD were used to respectively determine the flocculation rate and total saponins
loss rate as two main parameters to estimate the effects of influencing factors on flocculation. The optimum conditions of chitosan floccu-
lation were determined by orthogonal test. ＲESULTS The optimum conditions were as follows:aqueous solution concentration of 0. 6
mg·mL －1，chitosan solution volume of 30 mL per 100 mL intermediate solution，flocculation temperature of 60 ℃，and flocculation
time of 4 h. Under these conditions，a flocculation rate of 47. 81% and a total saponins loss rate of 9. 53% were achieved. CONCLU-
SION Compared with traditional tannin removing process，chitosan flocculation purification process can effectively retain the active
ingredients in the solution and has good process stability，which is suitable for industrial production.
KEY WOＲDS:Lysimachia capillipes Hemsl.;total saponin;capilliposide B;capilliposide C;chitosan;HPLC-ELSD
细梗香草(Lysimachia capillipes Hemsl. )又名香
排草、满山香，为报春花科珍珠菜属植物细梗香草的
干燥全草。细梗香草主要含有黄酮类及皂苷类成
分［1-2］，总皂苷主要含三萜皂苷 B(capilliposide B，
LC-B，C58H96O24)和三萜皂苷 C(capilliposide C，LC-
C，C57 H94 O24)
［3］。细梗香草总皂苷可抑制 PC-3、
BGC-823 和 SK-OV-3 细胞生长，有显著抗肿瘤活
性［4］。本实验采用壳聚糖絮凝法纯化细梗香草总
皂苷中间体，以絮凝率和总皂苷损失率为指标，用正
交实验对絮凝工艺进行了研究，并与传统去除鞣质
工艺进行对比，为进一步分离单体成分奠定基础。
1 仪器与试药
LC － 20A 高效液相色谱仪(日本岛津公司) ，
Alltech ELSD － 2000ES蒸发光散射检测器(美国奥
泰公司) ，A － 10 全自动空气源(北京中惠普分析
技术研究所) ，LC － 4012 低速离心机 (科大创新
股份有限公司中佳分公司) ，Spectrum 紫外分光光
度计(上海光谱仪器有限公司) ，S － H280 － Pr 磁
力搅拌器 (美国赛洛捷克公司) ，Mettler Toledo 实
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中国药学杂志 2014 年 7 月第 49 卷第 13 期 Chin Pharm J，2014 July，Vol. 49 No. 13
验室 pH 计 (瑞士梅特勒-托利多公司) ，Millipore
Synerg 超纯水系统(美国密理博公司)。壳聚糖
(国药集团化学试剂有限公司，脱乙酰度 80. 0% ～
95. 0%) ，乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均
为分析纯。
LC-B和 LC-C(自制) ，经面积归一化法计算，纯
度均大于 98%。
细梗香草中间体(自制，批号 20130601，含 LC-
B 21. 71%，LC-C 24. 01%)。
2 细梗香草中间体 HPLC含量测定方法
2. 1 色谱条件
色谱柱:Agilent TC-C18柱(4. 6 mm × 250 mm，5
μm) ;流动相:乙腈-0. 3% HOAc(42∶ 58) ;流速:1. 0
mL·min －1;柱温:40 ℃;分析时间:45 min。ELSD
参数:漂移管温度 100 ℃;气体流速 3. 2 L·min －1;
增益系数:1。
2. 2 对照品溶液制备
精密称取 LC-B、LC-C 适量，加流动相配成 LC-
B 0. 524 mg·mL －1，LC-C 0. 504 mg·mL －1的储备
液，冷藏备用。
2. 3 供试品溶液制备
精密称取细梗香草中间体 10 mg，用体积分数
70%乙醇溶液定容至 25 mL，摇匀，备用。
2. 4 系统适用性考察
取对照品及供试品溶液，按“2. 1. 1”项下色谱
条件测定，LC-B、LC-C达到基线分离，分离度均大于
1. 5，理论塔板数按 LC-C计算不低于 5 000，见图 1。
图 1 细梗香草 LC-C，LC-B 对照品(A)和总皂苷中间体供
试品(B)HPLC图谱
1 －三萜皂苷 C;2 －三萜皂苷 B
Fig. 1 HPLC Chromatogram of LC-C，LC-B standard substance
(A)and the total saponins intermediate samples (B)
1 － LC-C;2 － LC-B
2. 5 线性关系考察
精密吸取对照品溶液 4、8、12、16、20、24 μL，进
样测定，以峰面积自然对数(Y = lnA)为纵坐标，以
进样量自然对数(X = lnρ)为横坐标，绘制标准曲
线，结果 LC-B回归方程为 Y = 1. 481X + 13. 17(r =
0. 999 5) ，进样量在 2. 096 ～ 12. 576 μg 内呈良好的
线性关系;LC-C 回归方程为 Y = 1. 437X + 12. 99
(r = 0. 999 5) ，进样量在 2. 016 ～ 12. 096 μg 内呈良
好线性关系。
2. 6 精密度实验
精密吸取对照品溶液，进样 8 μL，连续测定 5
次，LC-B 和 LC-C 峰面积值 ＲSD 分别为 2. 09%、
1. 79%，表明精密度良好。
2. 7 重复性实验
精密称取同一批总皂苷样品 6 份，按“2. 1. 3”
项下配制供试品溶液，进样测定，LC-B、LC-C平均含
量分别为 21. 72%、24. 02%，ＲSD 分别为 1. 96% 、
1. 74%，表明重复性良好。
2. 8 稳定性实验
取供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12、24 h 进样
测定，LC-B、LC-C的 ＲSD分别为 1. 90%，2. 57%，表
明样品在 24 h内稳定。
2. 9 回收率实验
取已知含量总皂苷样品 6 份，精密称定，分别加
入等量对照品溶液(LC-B:0. 508 4 mg·mL －1，LC-
C:0. 675 0 mg·mL －1) ，按“2. 1. 3”项下制备供试品
溶液，进样测定，计算回收率。结果 LC-B、LC-C 的
平均加样回收率分别为 100. 3%、99. 32%;ＲSD 分
别为 1. 49%、0. 98%，见表 1，2。
3 壳聚糖絮凝工艺研究
3. 1 壳聚糖溶液制备［5］
精密称取壳聚糖 2. 50 g，置 250 mL 量瓶内，加
入 1%醋酸溶液溶胀 24 h，摇匀，稀释至刻度，即得
1%壳聚糖醋酸溶液。
3. 2 总皂苷水溶液制备
取总皂苷粉末适量，精密称重，置 1 000 mL 量
瓶内，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3. 3 总皂苷水溶液絮凝率测定［6］
吸取絮凝后上清液，稀释 1 倍，以蒸馏水为空
白，在波长 405 nm测定其吸光度。
絮凝(澄清)率% =(絮凝前的浑浊度 －絮凝后
的浑浊度)/絮凝前的浑浊度 × 100%
3. 4 总皂苷损失率测定
·4111· Chin Pharm J，2014 July，Vol. 49 No. 13 中国药学杂志 2014 年 7 月第 49 卷第 13 期
精密吸取絮凝后上清液，按“2. 1. 1”项下的色
谱条件测定总皂苷含量，计算总皂苷损失率。
总皂苷损失率% =(絮凝前总皂苷含量 －絮凝
后总皂苷含量)/絮凝前总皂苷含量 × 100%
3. 5 单因素实验
3. 5. 1 壳聚糖加入量考察 取 5 份总皂苷水溶液，
每份 100 mL，分别加入壳聚糖溶液 10，20，30，40，50
mL磁力搅拌 10 min，于 50 ℃水浴静置 3 h 后，离
心，取上清液，测定吸光度和总皂苷含量，计算絮凝
率和总皂苷的损失率。结果加入量为 30 mL 时，絮
凝率最高，损失率相对较少，见图 2。
3. 5. 2 总皂苷质量浓度考察 取 5 份总皂苷水溶
液，每份 100 mL，质量浓度分别为 0. 6，0. 8，1. 0，
1. 2，1. 4 mg·mL －1，分别加入壳聚糖溶液 30 mL，照
“2. 5”项下操作并测定，结果总皂苷质量浓度以
0. 6 ～ 1. 0 mg·mL －1为宜，见图 3。
3. 5. 3 絮凝温度考察 取总皂苷水溶液 6 份，每份
100 mL，分别于 20、30、40、50、60、70 ℃加入壳聚糖
溶液 30 mL，照“2. 5”项下操作并测定，结果体系温
度选择 50 ～ 60 ℃为宜，见图 4。
3. 5. 4 絮凝时间考察 取总皂苷水溶液 6 份，每份
100 mL，分别于 50 ℃加入壳聚糖溶液 30 mL，磁力
搅拌 10 min，恒温水浴静置 1，2，3，4，5，6 h，离心，取
上清液，照“2. 5”项下测定。结果絮凝超过 4 h，澄
清率达到最高并稳定在 46%以上，总皂苷损失率基
本保持不变，见图 5。
表 1 细梗香草三萜皂苷 B加样回收率结果 . n = 6
Tab. 1 Ｒesult of recovery test of LC-B. n = 6
No. m(sample)/mg m(original)/mg m(spiked)/mg m(found)/mg Ｒecovery /% Average /% ＲSD /%
1 10. 22 2. 22 2. 03 4. 25 99. 51 100. 3 1. 49
2 10. 28 2. 23 2. 03 4. 30 102. 0
3 10. 15 2. 20 2. 03 4. 21 99. 07
4 10. 24 2. 22 2. 03 4. 27 101. 0
5 10. 22 2. 22 2. 03 4. 22 98. 52
6 10. 24 2. 22 2. 03 4. 29 101. 9
表 2 细梗香草三萜皂苷 C加样回收率结果 . n = 6
Tab. 2 Ｒesult of recovery test of LC-C. n = 6
No. m(sample)/mg m(original)/mg m(spiked)/mg m(found)/mg Ｒecovery /% Average /% ＲSD /%
1 10. 22 2. 45 2. 71 5. 15 99. 63 99. 32 0. 98
2 10. 28 2. 47 2. 71 5. 18 100. 0
3 10. 15 2. 44 2. 71 5. 08 97. 42
4 10. 24 2. 46 2. 71 5. 16 99. 63
5 10. 22 2. 45 2. 71 5. 16 100. 0
6 10. 22 2. 45 2. 71 5. 15 99. 63
图 2 壳聚糖加入量对絮凝效果的影响
Fig. 2 Effect of chitosan dosage on flocculation rate and loss rate
图 3 细梗香草总皂苷质量浓度对絮凝效果的影响
Fig. 3 Effect of mass concentration of the total saponins inter-
mediate on flocculation rate and loss rate
图 4 优选壳聚糖絮凝工艺絮凝温度对澄清效果的影响
Fig. 4 Effect of temperature on flocculation rate and loss rate
图 5 优选壳聚糖絮凝工艺絮凝时间对澄清效果的影响
Fig. 5 Effect of flocculation time on flocculation rate and loss
rate
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中国药学杂志 2014 年 7 月第 49 卷第 13 期 Chin Pharm J，2014 July，Vol. 49 No. 13
3. 5. 5 pH值考察 取总皂苷水溶液 6 份(pH 值
4. 12) ，每份 100 mL，分别调 pH 值至 3. 0、4. 0、5. 0、
6. 0、7. 0、8. 0，于 50 ℃加入壳聚糖溶液 30 mL，照
“2. 5”项下操作并测定，结果随着 pH 值增加，絮凝
率先升高而后降低，而 pH值过高时，总皂苷损失率
增加。因此，pH值在 3 ～ 5 之间为宜，见图 6。
3. 6 正交实验优选壳聚糖絮凝工艺
根据单因素实验结果，选择壳聚糖加入量、总皂
苷质量浓度、pH 值和絮凝温度进行 L9(3
4)正交实
验，以絮凝率和总皂苷损失率为指标，采用加权评分
法，考察上述 4 因素对絮凝效果的影响，因素水平见
表 3。
加权评分值 =絮凝率 × 60% +(1 －损失率)×
40%
影响絮凝率和总皂苷损失率的重要程度依次为
B ＞ D ＞ C ＞ A，因素 B具有显著性影响，最佳工艺为
A2B1C1D3。因素 C 无显著性影响，为便于生产，拟
不调 pH 值，优选工艺为:总皂苷质量浓度为 0. 6
mg·mL －1，每 100 mL总皂苷水溶液加入壳聚糖溶
液 30 mL，絮凝温度 60 ℃，絮凝时间 4 h。
3. 7 工艺验证实验
按优选的絮凝工艺进行 3 批验证实验，结果平
均澄清率为 47. 81%，总皂苷平均损失率为 9. 53%，
ＲSD分别为 1. 30%、1. 51%，表明工艺稳定可行，见
表 6。
图 6 优选壳聚糖絮凝工艺体系 pH对澄清效果的影响
Fig. 6 Effect of pH on flocculation rate and loss rate
表 3 优选壳聚糖絮凝工艺正交实验因素水平表
Tab. 3 Factors and their coded levels in orthogonal array de-
sign
Levels
Factors
A
Chitosan dosage /mL
B
Concentration /mg·mL －1
C
pH
D
Temperature /℃
1 20 0. 6 3 40
2 30 1. 0 4 50
3 40 1. 4 5 60
3. 8 壳聚糖絮凝法和传统除鞣质方法的比较
分别用石灰乳沉淀法、明胶沉淀法、酸性沉淀
法、碱性醇沉法等传统除鞣质方法［7］与壳聚糖絮凝
法比较，结果传统除鞣质方法的絮凝能力较强，但对
总皂苷成分的吸附能力也较强，总皂苷的损失率较
高，壳聚糖絮凝法能有效的保留溶液中的有效成分，
见表 7。
表 4 优选壳聚糖絮凝工艺正交实验结果
Tab. 4 Orthogonal array design and corresponding experimental
results
No.
Factors
A B C D
Flocculation rate
/%
Loss rate
/%
score
1 1 1 1 1 46. 56 14. 46 62. 15
2 1 2 2 2 31. 67 9. 23 55. 31
3 1 3 3 3 42. 67 27. 54 54. 59
4 2 1 2 3 48. 75 8. 01 66. 05
5 2 2 3 1 36. 43 20. 23 53. 77
6 2 3 1 2 38. 22 15. 40 56. 77
7 3 1 3 2 51. 88 12. 45 65. 94
8 3 2 1 3 44. 76 12. 97 61. 67
9 3 3 2 1 21. 34 24. 06 43. 18
K1 57. 35 64. 71 60. 20 53. 03
K2 58. 86 56. 92 54. 85 59. 34
K3 56. 93 51. 51 58. 10 60. 77
Ｒ 1. 933 13. 20 5. 350 7. 737
表 5 优选壳聚糖絮凝工艺方差分析表
Tab. 5 Analysis of variance of chitosan flocculation method
Factors SS df F ratio P
A 6. 024 2 1. 000
B 264. 224 2 42. 589 ＜ 0. 05
C 43. 603 2 7. 028
D 101. 675 2 16. 389
S 6. 20 2
表 6 优选壳聚糖絮凝工艺验证实验结果
Tab. 6 Ｒesult of validation test
No. Flocculation rate /% Loss rate /%
1 48. 12 9. 69
2 47. 81 9. 49
3 47. 50 9. 41
Average∕% 47. 81 9. 53
ＲSD∕% 1. 30 1. 51
表 7 化学絮凝法澄清实验结果
Tab. 7 Flocculation rates and loss rates using different methods
Method Flocculation rate /% Loss rate /%
Ca(OH)2 method 64. 47 ＞ 80
Gelatin precipitation method 50. 94 14. 94
Acid precipitation method 59. 11 74. 32
Alkaline alcohol precipitation method 52. 20 ＞ 80
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4 讨 论
4. 1 壳聚糖用量过大，则皂苷损失率增大，其原因
可能是壳聚糖的加入使溶液中有效成分自身的稳定
性受到一定程度的破坏，有效成分与蛋白质、鞣酸
等大分子物质同时沉降出来，导致总皂苷含量的降
低［8］;而且，会使溶液中微粒的表面因吸附过量的
絮凝剂而形成空间保护层，发生再稳定现象，阻止架
桥结构的形成，影响絮凝效果。
4. 2 总皂苷质量浓度过高则损失率增加明显，主要
是因为总皂苷易被所形成的沉淀吸附、包裹。
4. 3 随着温度升高，溶液中的大分子杂质与壳聚糖
分子相互碰撞的几率增大，加速了絮凝沉淀过程，有
利于溶液澄清。但当温度过高时(＞ 60 ℃) ，化学
反应速度加快，形成的絮凝体细小，水合作用增
加，含水量高，难于处理;且温度过高，壳聚糖分子
易发生老化［9］，影响澄清效果。
4. 4 壳聚糖是阳离子型絮凝剂，具有吸附交联和电
荷中和双重作用。当 pH 值过低时，药液自身稳定
性下降，使大部分杂质不能去除，药液混浊。而 pH
值过高时，体系中负电荷增加，带正电荷的壳聚糖
电荷中和作用负荷增加，影响絮凝效果。
4. 5 以蒸馏水为空白，用分光光度法在波长 200 ～
900 nm 内扫描总皂苷水溶液吸光度 A，结果在 405
nm处有较高吸光度，因此，选择在 405 nm 测定吸
光度。
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中国药学杂志 2014 年 7 月第 49 卷第 13 期 Chin Pharm J，2014 July，Vol. 49 No. 13