全 文 ：RP-HPLC法同时测定红葱中异红葱乙素 、红葱乙素 、红葱甲素含量＊
刘西京 1, 2, 3 ,阎玺庆 1, 2 ,李玲1, 2 ,王乃利 1, 2
(1.深圳清华大学研究院 ,深圳 518057;2.深圳中药及天然药物研究中心 , 深圳 518057;3.深圳职业技术学院 , 深圳 518055)
　＊深圳市南山区科技局项目(合同编号:南科院 2007018)
　第一作者　Tel:(0755)26957685;Fax:(0755)26711832;E-mail:lxj 1975@yahoo.com.cn
摘要 　目的:同时测定红葱中 3个主要有效成分异红葱乙素 、红葱乙素 、红葱甲素的含量。方法:采用 PhenomenexLunaC18色
谱柱(250 mm×4.6mm, 5μm);流动相为乙腈(A)-水(B),梯度洗脱 [ 0min(40% A);10min(50% A);15min(80% A)] ,流
速 1 mL· min-1;检测波长 254nm, 柱温:25 ℃。结果:异红葱乙素 、红葱乙素 、红葱甲素浓度分别在 6.72 ～ 56.0 μg· mL-1(r
=0.9993)、11.52～ 96.0 μg· mL-1(r=0.9990)和 3.08 ～ 61.6 μg· mL-1(r=0.9997)与峰面积呈良好线性关系;平均加样回
收率(n=9)分别为 98.71%, 97.43%, 98.73%。结论:HPLC法同时测定红葱中异红葱乙素 、红葱乙素和红葱甲素的含量 ,方
法简便快速 , 结果准确 ,可用于红葱药材的质量控制。
关键词:高效液相色谱法;红葱;异红葱乙素;红葱乙素;红葱甲素
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2009)05-0735-04
RP-HPLCsimultaneousdeterminationofisoeleutherin,
eleutherinandeleutherolinEleutherineamericanaMerr.etHeyne＊
LIUXi-jing1, 2, 3 , YANXi-qing1, 2 , LILing1, 2 , WANGNai-li1 , 2
(1.ResearchInstituteofTsinghuaUniversityinShenzhen, Shenzhen518057, China;
2.TraditionalChineseMedicines＆NaturalProductsResearchCenterinShenzhen, Shenzhen518057, China;
3.ShenzhenPolytechnic, Shenzhen518055, China)
Abstract　Objective:TodevelopanHPLCforcontentdeterminationofthreebiologicalyactivecomponents(isoe-
leutherin, eleutherinandeleutherol)inEleutherineamericanaMer.etHeyne.Methods:Theanalyticalprocedure
forthedeterminationofthreenaphthoquinonederivativeswasestablished.OptimumHPLCseparationwasapplied
onPhenomenexLunaC18 column(250 mm×4.6 mm, 5 μm)withlineargradientelutionbyacetonitrile(A)and
water(B)asmobilephase.Theflowrate, detectionwavelengthwereadjustedto1.0 mL·min-1 and254 nm, re-
spectively.Thecolumntemperaturewas25 ℃.Results:Thecalibrationcurveswerelinearintherangesof6.72 -
56.0 μg·mL-1(r=0.9993)forisoeleutherin, 11.52-96.0 μg·mL-1(r=0.9990)foreleutherinand3.08 -
61.6 μg·mL-1(r=0.9997)foreleutherol, respectively;Theaveragerecoveries(n=9)were98.71%, 97.43%,
98.73%, respectively.Conclusion:TheHPLCmethodwasdevelopedforthesimultaneousdeterminationofthe
contentsofisoeleutherin, eleutherinandeleutherolinEleutherineamericanaMer.etHeyne.Themethodissimple,
rapidandaccurate, andcanbeusedforthequalitycontroloftheherbalmedicine.
Keywords:HPLC;EleutherineamericanaMer.etHeyne;isoeleutherin;eleutherin;eleutherol
红葱为鸢尾科 (Iridaceae)红葱 (Eleutherinea-
mericanaMerr.etHeyne)的全草或鳞茎 ,又名小红
蒜 、红葱头 、百步还阳 。其味苦 、性凉 ,有清热解毒 、
利尿除湿 、活血散瘀 、消肿止痛 、止血之功效 [ 1] 。化
学成分研究表明 ,红葱中主要含有萘醌衍生物 [ 2 ～ 8]
及其葡萄糖苷[ 9] ,以及少量的蒽醌[ 3 ～ 5] 。经本课题
组研究 ,结合文献研究 [ 5, 6] ,红葱中的萘醌衍生物是
治疗心血管疾病方面的主要物质基础 ,并以异红葱
乙素(isoeleutherin)、红葱乙素(eleutherin)、红葱甲
素(eleutherol)3个成分为主 。为了更好地控制药材
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质量 ,保证临床疗效 ,本文建立了反相高效液相色谱
法同时测定红葱中的 3个主要成分。
1　仪器与试药
Agilent1100型高效液相色谱仪(二极管阵列检
测器 , Agilent1100化学工作站)。对照品异红葱乙
素 、红葱乙素 、红葱甲素均为本实验室从红葱药材中
分离纯化所得 ,并经波谱分析确定其结构 [ 3, 7] ,经高
效液相色谱法检测 ,以峰面积归一化法计算纯度均
在 98%以上 ,符合要求 ,结构见图 1。药材红葱采自
云南西双版纳和广西柳州 ,并由王乃利教授鉴定为
EleutherineamericanaMerr.etHeyne的鳞茎;乙腈为
色谱纯 ,水为重蒸水 ,其余试剂均为分析纯 。
图 1　异红葱乙素(Ⅰ )、红葱乙素(Ⅱ)、红葱甲素(Ⅲ)结构式
Fig1　Chemicalstructuresofisoeleutherin(Ⅰ ), eleutherin(Ⅱ ), and
eleutherol(Ⅲ)
2　实验方法与结果
2.1　溶液制备
2.1.1　对照品储备液 精密称取对照品异红葱乙
素 5.6 mg、红葱乙素 9.6 mg、红葱甲素 7.7 mg,置同
一 100 mL棕色量瓶中 ,用乙醇溶解并稀释至刻度 ,
摇匀 ,即得浓度分别为 0.056, 0.096, 0.077 mg·
mL-1的混合溶液(现配现用 ,配制后 2 h之内完成
测定)。
2.1.2　供试品溶液 取干燥的红葱样品粉末(60
目)约 0.1 g,精密称定 ,每次加乙醇 3 mL,超声(500
W, 53 kHz)提取 10 min, 3000 r· min-1离心 5 min,
吸取上清液 。如上操作共 3次 ,合并上清液 ,用乙醇
定容至 10 mL棕色量瓶中 ,用 0.45 μm微孔滤膜滤
过 ,即得供试品溶液(现配现用 ,配制后 2 h之内完
成测定)。
2.2　色谱条件 采用 PhenomenexLunaC18色谱柱
(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相为乙腈(A)-水
(B),梯度洗脱 [ 0 min(40% A);10 min(50% A);
15 min(80%A)] ,流速 1 mL· min-1;检测波长 254
nm;柱温 25 ℃;进样量 20 μL。在上述色谱条件下 ,
异红葱乙素 、红葱乙素 、红葱甲素的保留时间分别为
11.7, 12.5, 14.2 min, 3个成分分离良好 ,理论塔板
数大于 2000,分离度大于 1.5,见图 2。
图 2　2号样品(A)与对照品(B)色谱图
Fig2　ChromatogramsofsampleNo.2(A)andchemicalreferencesub-
stances(B)
1.异红葱乙素(isoeleutherin)　 2.红葱乙素(eleutherin)　 3.红葱甲
素(eleutherol)
2.3　线性关系考察 分别精密吸取 “2.1.1”项下
的异红葱乙素 、红葱乙素 、红葱甲素对照品储备液适
量 ,制成 5个浓度水平的混合对照品溶液:6.72,
11.2, 22.4, 33.6, 56.0 μg· mL-1 (异红葱乙素);
11.52 , 19.2, 38.4, 57.6, 96.0 μg· mL-1 (红葱乙
素);3.08, 9.24, 15.4, 30.8, 61.6 μg· mL-1 (红葱
甲素)。用 0.45 μm微孔滤膜滤过 ,取续滤液 20
μL,在上述色谱条件下进样测定 ,以峰面积 Y为纵
坐标 ,以进样浓度 X(μg· mL-1)为横坐标进行线性
回归 ,得异红葱乙素 、红葱乙素和红葱甲素的回归方
程分别为:
Y=46.27X+96.67 r=0.9993
Y=55.56X-12.54 r=0.9990
Y=132.6X+98.49 r=0.9997
结果表明异红葱乙素 、红葱乙素和红葱甲素浓度分
别在 6.72 ～ 56.0, 11.52 ～ 96.0, 3.08 ～ 61.6 μg·
mL-1范围内 ,与峰面积呈良好的线性关系 。
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2.4　精密度试验 精密吸取同一供试品溶液 20
μL,连续进样 5次 ,测定峰面积 。结果异红葱乙素 、
红葱乙素 、红葱甲素峰面积的 RSD分别为 1.5%,
2.6%, 1.6%。说明仪器的精密度良好 。
2.5　重复性试验 按 “ 2.1.2”项下方法平行制备 5
份供试品溶液 ,分别进样测定 ,计算含量。结果样品
中异红葱乙素 、红葱乙素 、红葱甲素含量的平均值
(n=5)分别为 0.17%, 0.28%, 0.18%;RSD分别为
2.0%, 2.7%, 2.0%。说明方法的重复性良好 。
2.6　稳定性试验 取同一供试品溶液 ,分别在 0,
2, 4, 8, 16, 24 h进样测定 。结果异红葱乙素和红葱
甲素峰面积的 RSD(n=6)分别为 1.5%和 0.87%,
说明样品中异红葱乙素和红葱甲素在 24 h内稳定
性良好;而红葱乙素在溶液中不稳定 ,随着时间的推
移 ,峰面积逐渐下降。有鉴于此 ,在棕色瓶中配制样
品的供试品溶液 ,考察其稳定性 ,结果发现峰面积在
2 h内基本稳定 ,未见明显下降 , RSD(n=5)为
2.3%,可达到测定要求 ,故在测定该成分时 ,注意要
迅速 ,供试品溶液要避光保存 ,现配现用。
2.7　加样回收率试验 称取已知含量(异红葱乙
素 、红葱乙素 、红葱甲素含量分别为 0.17%,
0.28%, 0.18%)的红葱粉末约 0.05 g,精密称定 ,共
9份 ,每 3份为 1组 ,每组分别加入混合对照品溶液
(异红葱乙素 、红葱乙素 、红葱甲素浓度分别为
0.084 , 0.168, 0.104 mg· mL-1)1.2, 1.0 , 0.8 mL,
按照 “2.1.2”项下方法操作 ,并测定含量 ,计算平均
回收率。结果异红葱乙素高 、中 、低 3个加入量的回
收率 (n=3)分别为 98.72%(RSD=2.6%),
99.44%(RSD=3.0%), 98.53%(RSD=2.1%),平
均值(n=9)为 98.71%;红葱乙素高 、中 、低 3个加
入量的回收率 (n=3)分别为 97.16%(RSD=
1.9%), 96.38%(RSD=2.6%), 98.74%(RSD=
2.4%),平均值(n=9)为 97.43%;红葱甲素高 、中 、
低 3个加入量的回收率 (n=3)分别为 98.14%
(RSD=1.6%), 98.87%(RSD=1.5%), 99.19%
(RSD=3.1%),平均值(n=9)为 98.73%。
2.8　样品测定 取收集的不同产地 5个批次的红
葱药材各 3份 ,分别按照 “2.1.2”项下方法制备供
试品溶液 ,按色谱条件测定 ,用标准曲线计算含量 ,
结果见表 1。
表 1　不同批次红葱药材中异红葱乙素 、红葱乙素 、红葱甲素的百分含量(n=3)
Tab1　Contentofisoeleutherin, eleutherinandeleutherolindifferentEleutherineamericanaMerr.etHeynehabitats
样品号(sampleNo.) 产地及采集时间(habitatandcolectedtime) 异红葱乙素(isoeleutherin)红葱乙素(eleutherin)红葱甲素(eleutherol)总量(total)
1 广西柳州(Liuzhou, Guanagxi), 2004-10 0.15(3.6) 0.26(3.4) 0.15(1.8) 0.56
2 云南西双版纳(Xishuangbanna, Yunnan), 2006-11 0.17(3.6) 0.28(3.7) 0.18(3.6) 0.63
3 云南西双版纳(Xishuangbanna, Yunnan), 2007-02 0.11(3.2) 0.24(1.1) 0.12(2.2) 0.47
4 云南西双版纳(Xishuangbanna, Yunnan), 2007-10 0.18(2.7) 0.33(0.68) 0.19(1.2) 0.70
5 云南西双版纳(Xishuangbanna, Yunnan), 2008-04 0.06(0.68) 0.24(2.7) 0.13(4.3) 0.43
　注(note):括号内为 RSD值(RSDintheparenthesis, %)
3　讨论
3.1　供试品溶液制备方法考察 首先比较了回流
提取和超声提取 2种方法对样品的处理:回流提取
采用 1 g样品用 15 mL乙醇提取 2次 ,异红葱乙素 、
红葱乙素和红葱甲素 3个主成分的含量测定结果基
本与按 “2.1.2”方法制备溶液所测结果一致 ,但回
流提取的溶液杂质较多 ,还需氯仿的进一步萃取 ,步
骤烦琐 ,所以选择超声提取方法。在溶剂的选择考
察中 ,按 “ 2.1.2”项下方法分别以甲醇和乙醇为溶
剂提取药材 ,结果表明 3个主成分含量测定结果基
本一致 ,考虑到甲醇的毒性 ,确定以乙醇作为提取
溶剂。
3.2 　流动相的选择　实验曾采用甲醇 -水 、乙腈
-水体系 ,结果发现 ,甲醇 -水体系峰形不对称 ,分
离度不好 ,采用梯度洗脱基线有所漂移;乙腈 -水体
系分离效果较好 ,基线平稳 ,各成分峰形 、分离度良
好。随着乙腈比例的增加 ,保留时间缩短 ,但分离度
降低 ,甚至难以分离 。尤其是初始乙腈比例 ,小于
40%,保留时间延长 ,大于 40%则保留时间缩短 ,但
以降低分离效果为代价 ,并且在保留时间 10 min之
前 ,梯度变化必须缓慢 ,否则仍会影响峰形和分离
度。经反复实验筛选 ,最终确定采用乙腈(A)-水
(B),梯度洗脱 [ 0 min(40% A);10 min(50% A);
15 min(80% A)] 。
3.3　检测波长的确定　DAD检测器在 200 ～ 600
nm全波长扫描 ,结果表明 ,异红葱乙素 、红葱乙素和
红葱甲素 3个成分均在 254 nm处有最大吸收 ,且该
波长下测定 ,干扰小 ,方法灵敏 ,因此确定检测波长
为 254 nm。
3.4 　专属性　在确定的色谱条件下 ,异红葱乙素 、
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红葱乙素和红葱甲素与其他萘醌衍生物 、蒽醌衍生
物以及降解产物分离良好 。采用 DAD对该 3个成
分的色谱峰进行扫描(200 ～ 400 nm),所得图谱的
形状 、吸收带位置及相对强度与对照品图谱比较一
致 ,结果提示 ,在本文实验条件下 ,这 3个成分峰为
单一组分。
3.5　小结　本实验室曾对红葱的氯仿 、乙酸乙酯 、
正丁醇的提取物进行体外活性筛选 ,发现氯仿提取
物扩张大鼠主动脉条的作用最强 ,经过化学分离 、鉴
定 ,表明氯仿提取物中主要为萘醌类衍生物 ,以异红
葱乙素 、红葱乙素 、红葱甲素的含量为主。正丁醇中
则含有大量的萘醌苷 ,体外测试无扩张主动脉的活
性 ,推测萘醌苷元为主要活性成分。故本实验采用
反相高效液相色谱法 ,针对红葱中主要萘醌衍生物
异红葱乙素 、红葱乙素和红葱甲素作为指标进行研
究 ,方法稳定 、可靠 ,分离效果良好 。本文药材批次
仍较少 ,还需更多的数据进一步考察产地 、采集时间
等对主要成分的影响 。此外 ,在实验中发现 ,红葱乙
素较不稳定 ,尤其是在溶液中 ,随着时间的推移 ,容
易降解 ,浓度降低 ,提示药材贮藏条件宜置通风干燥
处 。其稳定性还有待进一步研究 ,为药材的贮藏 、制
剂提供坚实的理论基础。
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(本文于 2008年 9月 4日收到)
—738— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(5)