全 文 ：黄草乌 HPLC指纹图谱分析方法研究*
汪丽娅 1　张文生2　杜树山2　孟繁蕴 2　倪雪梅 2
(1北京师范大学图书馆　北京 100875)
　汪丽娅 ,女 , 26岁 ,理学硕士 ,助理馆员
(2北京师范大学资源学院资源药物与中药资源研究所　北京 100088)
摘要:目的　建立黄草乌指纹图谱的高效液相色谱分析法。方法 　利用高效液相色谱法 ,采用
Ag ilent Zorbax SB-C18(4. 6mm ×250mm , 5 μm)色谱柱 ,乙腈 -磷酸三乙胺溶液为流动相 ,梯度洗
脱 ,流速 1. 0mL /m in, 检测波长为 267 nm ,建立黄草乌高效液相指纹图谱方法。结果　研究建立
的高效液相指纹图谱有良好的重现性 ,不同产地的黄草乌共有 15个色谱峰(RSD≤3%, n =15),共
有峰相对峰面积有一定的差异。结论　该方法效果良好 ,结果稳定可靠 ,可为提高黄草乌质量控制
标准提供参考。
关键词:黄草乌;高效液相色谱法;指纹图谱
中图分类号:R284.2
Analysis on fingerprint ofAconitum vilmorin ianum Kom. by HPLC
WANG L i-ya1 , ZHANGW en-sheng2 , DU Shu-shan2 , MENG Fan-yun2 , NIXue-mei2
(1 L ibrary of BeijingNormal University, Be ijing 100875)
(2 Institute of NaturalM ed ic ine and Chinese M edic ine Resources, Beijing Normal University,
Beijing 100088)
Abstract:Objective　To find an analy tica lme thod o f fingerprint o f Aconitum vilmorinianum Kom. by
HPLC. Method　 In the HPLC procedure the chromatography co lumn w as Ag ilent Zorbax SB-C18 (4. 6
mm ×250 mm , 5 μm), the mobile phase w as so lu tion of ace tonitrile and trie thy lam ine phosphate in
gradient e lu tion w ith a flow velocity of 1. 0mL /m in, and the detection w ave leng th was 267 nm. Result　
The fingerprint in this HPLC procedure had a good repeatability. There w e re 15 common peaks in
Aconitum vilmorinianum Kom. grow n in different areas (RSD≤3%, n =15). The re lative areas peak o f
common peaks w ere differen.t Conclusion　This procedure has a good ou tcome which is stable and
re liable, and can be a re ference for the standard of qua lita tive control ofAconitum vilmorinianum Kom.
Key words:Aconitum vilmorinianum Kom. ;HPLC;fingerprint
　　黄草乌 Aconitum vilmorinianum Kom. (1909);
Hand. -Mazz. (1939)是一种民间常用草药 ,为毛茛
科植物黄草乌块 , 原植物为黄草乌 Aconitum vil-
morinianum Kom. [ A. mairei Lev.l ] (又名:昆明乌头
《拉汉种子植物名称》)集中分布在云南的中部 、西
部以及四川 (会理 )和贵州西部等地山地灌丛中 [ 1] 。
有剧毒 ,临床主要应用于风湿关节疼痛 、跌打损伤的
治疗。继往研究发现用乙醚和甲醇联合提取的方法
能够更好地提取乌头类总生物碱;同时液相色谱的
流相常用甲醇 、乙腈 、三乙胺 、磷酸 [ 2 -3] 。本实验参
考上述方法并进行了适当的改进 ,建立了黄草乌高
效液相指纹图谱的分析方法 。
1　仪器与材料
W aters 2695高效液相色谱仪 , Waters 2996 UV
检测器 , M illennium32工作站 , Ag ilent Zorbax SB-C18
(4. 6mm ×250mm , 5μm)色谱柱 。W aters oasis TM
HLB Catridge分离小柱 。
黄草乌的块根:2004年 11月采集于云南省华宁 、
石门坎 、风筝山 、锡城 、武定 ,并由中国科学院昆明植
物研究所鉴定。乌头碱对照品:国药品生物制品鉴定
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北京中医药大学学报
Journal of Beijing University o f T raditiona l ChineseM edic ine
　 　第 29卷第 8期 2006年 8月
Vo .l 29 No. 8 Aug. 2006
所提供。甲醇 、乙腈为色谱纯 ,其余试剂均为分析纯。
2　方法和结果
2. 1　供试品溶液的制备
黄草乌药材 ,用清水洗净表面泥土后 ,以蒸馏
水 、去离子水分别快速淋洗 3遍 ,于 60℃烘箱烘干 ,
粉碎机粉碎 。称取样品 2. 5 g于 100mL锥形瓶中 ,
加 25 mL乙醚超声 10m in ,过滤取上清液 ,旋干 ,水
溶解 ,通过分离小柱 2 ～ 3次 ,甲醇洗脱分离小柱 2
～ 3次 ,将洗脱液定容至 10 mL,作为待测样品。
2. 2　参照物溶液的制备
精密称取乌头碱对照品适量 ,用甲醇稀释成每
1 mL含 0. 2 mg的溶液 ,作为参照物溶液 。
2. 3　检测方法和条件的选择
2. 3. 1　流动相的确定:试验过程中选择了多种流动
相系统:①甲醇(A)∶0.1%三乙胺 (B),梯度洗脱;
②乙腈 (A)∶0.025 mol /L磷酸水溶液 (B),梯度洗
脱;③乙腈 (A)∶磷酸三乙胺溶液 (B),梯度洗脱;
磷酸三乙胺溶液为 0.025 mo l /L磷酸∶0.1%三乙
胺为 3∶1。以上 3种的洗脱梯度为:A:10% 10 m in
20% 30m in 30% 20m in 95% 10 m in 100%;B:90%
10m in
80% 30m in 70% 20m in 5% 10m in 0%。结
果表明 ,流动相以③系统为佳 ,各色谱峰分离度好 ,
保留时间适中 ,故选择该系统作为流动相 。
2. 3. 2　检测波长 、柱温及流速的选择:试验过程中
采用二级管阵列检测器 ,结合乌头碱的光谱图选择
测定波长 ,结果在 260 ～ 270 nm波长范围内出现的
色谱峰数适中 ,各色谱峰相互之间分离度较好 ,稳定
性较好 ,以 267 nm图形最好。同时对柱温 (25 ℃,
30 ℃)及流速 (0. 8、1. 0、1. 2 mL /m in)也进行了考
察 。试验结果表明 ,当柱温 30℃、流速 1. 0 mL /m in
时 ,各色谱峰分离度较好 ,保留时间适中。
2. 4　检测方法
色谱条件:采用上述试验筛选确定的条件 。测
定方法:分别精密吸取参照物溶液及供试品溶液各
20 μL,注入液相色谱仪 ,记录 70 m in的色谱图 ,即
得 。供试品色谱中 ,以参照物乌头碱对应的色谱峰
(S)的相对保留时间和峰面积为 1,计算各指纹峰的
相对保留时间及相对峰面积比值。
2. 5　检测方法的稳定性 、精密度 、重复性考察
稳定性试验:取同一供试品溶液 ,分别在 0、6、
24 h检测指纹图谱。精密度试验:取同一批供试品
溶液 ,连续进样 5次 ,检测指纹图谱。重复性试验:
取同一批供试品溶液 5份 ,精密称定 ,按供试品溶液
的制备方法 ,制备成供试品溶液 ,检测指纹图谱。结
果表明 ,各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比
值基本没有明显变化 (RSD均在 3%内),符合指纹
图谱要求 。
2. 6　黄草乌指纹图谱及技术参数
2. 6. 1　指纹图谱及共有指纹峰的标定:按上述方法
检测 15批黄草乌的指纹图谱 ,图 1为对照品乌头碱
的图谱。结果表明:15批黄草乌的指纹图谱的色谱
峰均在 70 m in之内全部出完 ,其中有 15个色谱峰
是 15批黄草乌共有的 ,因此 ,确定他们为共有指纹
图谱峰(见图 2)。
图 1　参照物(乌头碱)图谱
图 2　黄草乌指纹图谱( s.乌头碱 )
2. 6. 2　共有指纹峰面积及保留时间比值:以参照物
峰(S)的相对保留时间和峰面积为 1,计算 15批指
纹图谱中 15个共有指纹峰的相对保留时间为:1
(0.525 ～ 0. 527), 2(0. 714 ～ 0. 716), 3(0. 734 ～
0.735), 4(0. 826 ～ 0. 828), 5(0. 987 ～ 0. 989), 6
(1.019 ～ 1. 020), 7(1. 043 ～ 1. 045), 8(1. 073 ～
1.074), 9(1. 179 ～ 1. 181), 10(1. 207 ～ 1. 209), 11
(1.431 ～ 1. 434), 12(1. 517 ～ 1. 518), 13(1. 574 ～
1.576), 14(1. 650 ～ 1. 653), 15(1. 988 ～ 1. 990);其
峰面积与参照物 (S)面积的比值为 1(5. 530 ～
5.736), 2(1. 090 ～ 1. 251), 3(0. 391 ～ 0. 526), 4
(0.201 ～ 0.298), 5(1. 953 ～ 2. 015), 6(0. 931 ～
1.152), 7(0.258 ～ 0. 512), 8(0. 614 ～ 0. 758), 9
(0.470 ～ 0.615), 10(0. 872 ～ 1. 015), 11(5. 671 ～
5.745), 12(0. 112 ～ 0. 364), 13(0. 093 ～ 0. 248), 14
(0. 440 ～ 0. 598), 15(0. 470 ～ 0. 645)。
2. 6. 3　黄草乌药材指纹图谱:取不同来源地黄草乌
药材 ,分别按 2. 1项下方法制备供试品溶液 ,进样 ,
记录各样品在 70 m in内的指纹图谱 (见图 3)。结
果黄草乌药材均显示基本相同的特征峰 ,但相对峰
549 第 8期 汪丽娅等　黄草乌 HPLC指纹图谱分析方法研究
面积有所不同。
图 3　不同产地黄草乌指纹图谱叠加图
3　讨论
在供试品溶液的制备过程中 ,选择了甲醇 、乙
醚 、碱性甲醇 (pH 9 ～ 10)、碱性乙醚 (pH 9 ～ 10)对
供试品进行超声提取 。结果文中选用的乙醚超声提
取供试品通过分离小柱的方法效果较好。
在指纹图谱建立过程中 ,在选择了W aters
χTerra RP18柱 (3. 9 mm ×150 mm , 5 μL) ;W aters
μBondapak NH2 125／ (3. 9 mm ×300 mm , 10 μm);
Ag ilent Zo rbax SB -C18(4. 6 mm ×250 mm , 5 μm)3
种色谱柱进行了黄草乌的指纹图谱分析 。结果文中
选用的 Ag ilent Zo rbax SB -C18(4. 6 mm ×250 mm , 5
μm)色谱柱的分离效果理想 。
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(收稿日期:2005-11-03)
(上接第 547页)
鉴定为 3 , 3, 5, 5-四甲氧基-4, 4-二-β-D-葡萄糖双环
氧木脂素。
化合物 Ⅹ :红色结晶 ,熔点 285 ～ 286 ℃,与藏红
花酸共薄层 ,斑点颜色 , Rf值相同;与藏红花酸混合
熔点不下降 ,故鉴定为藏红花酸 。
化合物Ⅺ:白色针晶 ,熔点 168 ～ 169 ℃, Libe r-
mann反应阳性 , Molish反应阴性。13C-NMR (CDC l3)
δ:37. 3(C-1), 31. 7(C-2), 71. 8(C-3), 42. 3(C-4),
140. 7(C-5), 121. 7(C-6), 33. 9 (C-7), 31. 9(C-8),
50. 2(C-9), 36. 1(C-10), 21. 1(C-11), 39. 8(C-
12), 45. 8(C-13), 56. 1(C-14), 24. 4(C-15), 28. 2
(C-16), 56. 8(C-17), 11. 9(C-18), 18. 9(C-19),
39.8(C-20), 21. 2(C-21), 138. 3(C-22), 129. 3(C-
23), 51. 2(C-24), 29. 1(C-25), 19. 4(C-26), 21. 2
(C-27), 24. 3(C-28), 11. 8(C-29)。以上数据与文
献 [ 10]报道豆甾醇对照一致 ,鉴定为豆甾醇 。
化合物Ⅻ:白色针晶 ,熔点 140 ～ 142 ℃, Libe r-
mann反应阳性 , Molish反应阴性。与 β-谷甾醇共薄
层 ,斑点颜色 , Rf值相同 ,与 β-谷甾醇混合熔点不下
降 ,故鉴定为 β-谷甾醇。
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550 北京中医药大学学报　 　 　 　　　　　　　　　　　　　　第 29卷