全 文 ：Journal of Tropical Medicine Vol．9 No．2 Feb．2009
基金项目：国家自然科学基金 （No．30070702）；广东省科技重点专
项 （No．2003A3080502）； 广东省自然科学基金 （No．
07301310）；深圳市科技计划项目（No．200326）。
作者简介 ：孟光 ，女 ，主任医师 ，研究方向为花粉变应原的基础与
应用。
*通讯作者：刘志刚，男，教授，博士生导师，E-mail：lzg＠szu．edu．cn
·基础研究论著·[文章编号] 1672-3619（2009）02-0174-03
过敏性疾病是临床上的常见病 、多发病 ，世界卫生组
织将其列为当前世界性重大卫生学问题之一。在引起过敏
性反应的众多变应原中，植物花粉作为主要的吸入性变应
原 ，能够诱发人体产生Ⅰ型超敏反应 ，引发人体产生过敏
性鼻炎、支气管炎症、甚至哮喘等不良反应 ［1－3］。
空气中花粉飘散种类、数量及分布规律与其所处的地
理位置有着密切的联系 。 早在 1989 年 Jaggi 和 Chowdhury
等 ［4，5］就已发现了棕榈科植物花粉 （如椰子 ）具有致敏性 ，
并且在不同棕榈科植物花粉之间存在一定的交叉反应。前
期我国海南省海口市气传花粉调查中发现 ， 在 5 米和 20
米高度空气中均能收集到相当数量的棕榈科属花粉，对过
敏个体来说具有潜在的致敏威胁 ［6］。
王棕（Roystonea regia），别名大王椰子，棕榈科王棕属
常绿乔木，为南方绿化美化的首选树种。王棕的花期较长，
王棕花粉变应原的分析与鉴定
孟光 1， 姚敏 1， 刘志刚 2*， 宋娟娟 2， 李春林 1
（1． 海口市人民医院耳鼻咽喉科， 海口 570208； 2． 深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所，
深圳 518060）
【摘要】 目的 对我国南方常见的棕榈科植物王棕花粉（Roystonea regia pollen ）变应原蛋白进行分离、分
析与鉴定，为标准化变应原疫苗的研制提供基础。 方法 取常规方法制备的王棕花粉浸出液 ，采用 SDS-PAGE
分离王棕花粉蛋白质组分，测定其相对分子量，同时用 10 例对王棕花粉过敏的患者血清作 Western-blot 鉴定其
变应原及主要变应原成分。结果 SDS-PAGE 显示王棕花粉有 10 条可辨蛋白带，其中主要条带有 8 条， 分别为
100000、66000、38000、36000、29000、30000、24000、16000 和 14000 Mr，Western-blot 结果表明 ，10 例王棕花粉过
敏患者血清全部呈阳性反应 ， 有 66000、24000、16000 和 14000 Mr 共 4 条致敏条带 ， 其中分子量在 16000 和
14000 Mr 的蛋白为主要变应原。 结论 王棕花粉变应原的分析与鉴定为临床王棕花粉变态反应疾病的诊断和
治疗奠定了基础。
【关键词】 王棕花粉； 变应原； SDS-PAGE； Western-blot
中图分类号：R392．8 文献标识码：A
Analysis and Characterization of Allergen in Roystonea regia Pollen
MENG Guang1， YAO Min1， LIU Zhi-gang2*， SONG Juan-juan2， LI Chun-lin1
（1． Depterment of Otorhinolaryngology， Haikou Peoples Hospital， Haikou 570208； 2． Allergy and
Immunology Institute， School of Medicine， Shenzhen University， Shenzhen 518060， China）
【Abstract】 Objective To characterize allergenic components of Roystonea regia pollen． Method Roystonea
regia pollen protein was extracted and analyzed by SDS-PAGE to characterize the allergenic components． Roystonea
regia pollen extracts were analyzed by immunolblotting． Result SDS-PAGE suggested that the extract of coco pollen
displayed 10 major protein bands with sizes of 100000， 66000， 38000， 36000， 29000， 30000， 24000， 16000 and
14000 Mr． Western-blotting indicated that the extracts of Roystonea regia pollen had four bands that reacted with IgE in
the sera from Roystonea regia pollen allergic patients． The molecular weight of the four bands was about 66000， 24000，
16000 and 14000 Mr． Two proteins were the major allergen． Conclusion Allergenic components of Roystonea regia
pollen were Characterized in this study， which will be used as a base for diagnosis and therapy of Roystonea regia pollen
related allergy．
【Key words】 roystonea regia pollen； allergen； SDS-PAGE； western-blot
174· ·
热带医学杂志 2009年 2月第 9卷第 2期
花粉产量较大。海南，由于地处热带季风区，常年有风且风
力大， 使得属于虫媒花的王棕花粉得以在空气中飘散，成
为海口地区重要的致敏花粉 ［7，8］。 目前国内外尚无对王棕
花粉过敏原进行研究的报道 ， 本研究通过 SDS-PAGE、
Western blotting 等方法对王棕花粉进行分离， 获取王棕花
粉天然的主要变应原， 同时对其变应原特性进行鉴定，为
标准化变应原疫苗的研制提供理论依据，为海南地区临床
过敏诊断和特异性免疫治疗打下基础。
1 材料与方法
1．1 材料
王棕花粉采自海南省海口市；患者血清由海口市人民医
院提供；血清来自本研究所 10 个对王棕花粉过敏的患者，所
有患者也对一些花粉及植物源性食物（如胡萝卜、花生或苹
果等）过敏，皮肤点刺试验＋＋以上，－80℃冻存。
1．2 主要试剂
丙烯酰胺（Acr） （BBI）； 十二烷基硫酸钠 （SDS） （BIO
－ RAD）；亚甲基双丙烯酰胺（Bis）、过硫酸铵（AP）、四甲基
乙二胺 （TEMED）、 三羟甲基氨基甲烷 （Tris）、 联苯二胺
（DAB） （AMRESCO）；上样缓冲体系 、蛋白 Marker 和预染
蛋白 Marker（MBI Fermentas）；生物素标记的 IgE 二抗 、辣
根过氧化物酶标记的亲和素 （链霉亲和素 ） （Kirkegaard ＆
Perry Laboratories）；硝酸纤维膜（NC 膜）（Gelman Laboratory）；
DEAE-Cellulose DE-52 （Amersham Pharmacia）。 其余均为国
产分析纯试剂。
1．3 王棕花粉变应原的提取
取王棕花粉于液氮中充分研磨 ，按 1∶3 的比例用丙酮
低温浸泡去脂至上清澄清 。 去丙酮 ，干燥后称重 ，以 1∶20
比例加入 Coca’s 液（氯化钠 5 g，碳酸氢钠 2．75 g，结晶酚
4 g 加蒸馏水至 1000 ml， pH 8．2），搅拌提取 72 h，静置
0．5 h 后 ，上清液对蒸馏水透析 ，冷冻干燥浓缩 ，以上均在
4℃进行。
1．4 王棕花粉变应原进行 SDS-PAGE
采用 SDS-PAGE 体系分离粗提液中蛋白质组分并测
定分子量。 分离胶 12％、浓缩胶 5％，考马斯亮蓝 R-250 染
色液染色，脱色后用凝胶成像及分析系统拍照并分析其相
对分子量。
1．5 王棕花粉变应原免疫学特性鉴定
采用 Western blotting 方法对王棕花粉变应原进行免
疫学特性鉴定。 具体步骤如下：①用 BIO-RAD 转移槽将凝
胶中的蛋白条带转移至硝酸纤维膜上；②用 TBS 洗涤硝酸
纤维膜 2 次 ，每次 5 min；③将膜用 1％ BSA 封闭液封闭
（4℃过夜）； ④用含 0．05％吐温－20 的 TBST 洗膜 3 次，每
次 5 min； ⑤加一抗 （用 1％ BSA-TBST 进行 1∶9 稀释 ），
37℃孵育 2 h； ⑥同上洗膜 3 次后加入 1∶1000 倍稀释的二
抗-生物素 ，室温孵育 2 h；⑦同上洗膜 3 次后加入 1∶1000
倍稀释的链霉亲和素-HRP， 室温孵育 2 h； ⑧同上洗膜 5
次 ，DAB（3，3′-二氨基联苯胺 ）显色 ，摄像后分析其相对分
子质量。
2 结果
2．1 王棕花粉粗浸液的 SDS-PAGE 电泳
王棕花粉粗提液进行 SDS-PAGE 电泳后用考马斯亮蓝
染色，脱色后利用凝胶成像系统拍照。结果发现，王棕花粉主
要有 10 余条深浅不一的蛋白区带（图 1），其中主带有 8 条 ，
分别为 100000、66000、38000、36000、29000、30000、24000、
16000 和 14000 Mr， 其中 25000～116000 Mr 之间区带蛋白
含量最丰富。
2．2 王棕花粉特异性变应原鉴定
收集王棕花粉过敏患者的阳性血清对王棕花粉粗提
液进行免疫印迹 ， 结果显示 ， 王棕花粉提取液中可与过
敏性病人血清 IgE 结合的蛋白质分子量分别为 66000、
24000、16000 和 14000 Mr， 其中分子量为 16000 和 14000
Mr 的为主要变应原（图 2）。
图 1 王棕花粉粗提液 SDS-PAGE 电泳
Fig． 1 SDS-PAGE analysis of Roystonea regia pollen extract
M： Standard molecular weight markers；1 ： SDS-PAGE analysis of
Roystonea regia pollen extract．
图 2 王棕花粉粗提液的免疫印迹图
Fig． 2 Western blotting of Roystonea regia pollen extract
M： Standard molecular weight markers；1－10：IgE immunoblots of
sera from 10 Roystonea regia pollen allergic patients．
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Journal of Tropical Medicine Vol．9 No．2 Feb．2009
（上接第 173 页）
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染非常敏感，而且成本也低廉，但其脑脊
液的收集非常困难，而脑脊液是衡量广州管圆线虫病变的
重要指标，我们还需要建立相关实验技术。 在后续的实验
中我们将进一步摸索广州管圆线虫对猕猴的感染情况 ，这
些工作也将为猕猴感染模型的构建打下一定的基础。
（致谢： 感谢本教研室詹希美教授在虫源方面所提供的
帮助，感谢本校病理实验中心李艳老师在病理检查中的大力
协助，感谢广东省中医院陈琳检验师在蛋白检测中的支持！ ）
［参 考 文 献］
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林金祥 ，周晓农 ，李莉莎 ，等 ． 铜锈环棱螺作为广州管圆线
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（收稿日期：2008－09－16；修回日期：2008－11－07）
［1］
［2］
［3］
［4］
［5］
［6］
3 讨论
花粉症 （枯草热 ）是吸入或接触致敏性花粉所致 ，对
人类造成的危害很大 。 由于吸入飘散在大气中的花粉 ，
大约有 20％的人会被引发 IgE 介导的过敏性疾病 ［9］。 自
从1963年对北美最主要的致敏花粉豚草进行初步分离纯
化以来，国内外已分析了梯牧草、松属、杨属、车前属、橄榄
属和柏树等 10 余种花粉过敏原蛋白成分， 很多花粉变应
原也已经被克隆和表达 ，如桦树花粉 ［10］、 梯牧草花粉 ［11］、
豚草花粉等 ［12］。 然而，目前还没有对王棕花粉变应原进行
研究的报道，孟光等 ［7］在对海口地区热带植物花粉致敏性
调查中发现 ，王棕花粉阳性率为 22％（110 ／ 500），因此 ，开
展具有海南热带特色的致敏花粉变应原的研究工作显得
尤为突出。
世界卫生组织 （WTO）提供用于过敏性疾病诊断的变
应原目录中，目前尚未收录有热带地区气传致敏花粉变应
原。 本研究通过对王棕花粉的传统提取方法略加改进后，
经 SDS-PAGE 分析发现王棕花粉粗提液中约有 10 条的蛋
白带，其中可与过敏性病人血清 IgE 结合的蛋白质分子量
分 别 为 66000、24000、16000 和 14000 Mr， 而 分 子 量 为
16000 和 14000 Mr 的为主要变应原 。 另外 ，SDS-PAGE 实
验分离到的蛋白含量高的条带与患者血清中王棕花粉变
应原特异性 IgE 结合率并不一定高。 本研究为热带地区气
传致敏花粉王棕花粉变应原的相关研究提供了实验依据，
也为王棕花粉变应原标准化的制定奠定了实验基础，有利
于过敏反应诊断及脱敏治疗的深入研究。
［参 考 文 献］
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（收稿日期：2008－08－26；修回日期：2008－10－16）
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