全 文 ： 论 著
刺苋花粉特异性变应原成分的分析研究
赵绮华*　陈丽金　王锡忠　刘永平
(广州医学院第二附属医院过敏反应科 ,广东 广州 510260)
　　摘要　目的:分析刺苋花粉的抗原成分以及刺苋花粉特异性变应原组分 , 为刺苋花粉变应原的纯化和标准
化变应原疫苗的研制提供理论依据。方法:取刺苋花粉浸出液 , 经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-
PAGE)分离 , 以 16例刺苋花粉过敏的病人血清为探针 ,进行免疫印迹(W estern b lotting), 检测刺苋花粉浸出
液的致敏组分。结果:SDS-PAGE显示可辨蛋白条带有 11条 , 分子量在 15 ～ 80 kD之间 , 其中主带有 9条 ,分
子量依次为 18 kD、24 kD、29 kD、35 kD、39 kD、40 kD、42 kD、62 kD、 78 kD。W estern b lotting结果表明 , 16份
刺苋花粉过敏患者的血清全部呈阳性反应 ,浸出液中共有 4条致敏条带 , 其中主要致敏蛋白的分子量是 78 kD
和 40 kD。结论:刺苋花粉 78 kD和 40 kD的变应原为主要特异性变应原。
关键词　刺苋花粉;变应原;SDS-PAGE;W estern b lotting
中图分类号　R392. 8　文献标识码:A　文章编号:1008 - 1836(2005)04 -0001 - 03
Analysis of the Specific Antigen ic Components ofAmaranthus Sp inosus
ZHAO Qi-hua, CHEN Li-jin, WANG X i-zhong , LIU Yong-ping
(Departmen t of Allergy, Second A ffiliated Hospital of Guangzhou Medica l College, Guangzhou 510260, China)
Abstrac t　Objective:To inve stiga te the antigen ic com ponents of Am aranthus spinosus po llen, and to lay
theo re tical base fo r the pu rifica tion of Am a ranthus spino sus pollen alle rgens and the standa rdiza tion o f a lle rgen ic
vacc ine. M ethods:The crude ex tract w as separated by SDS-PAGE. The a llerg en prote ins w ere analy zed by Weste rn
b lo tw ith serum ob ta ined from alle rg ic sub jec ts as probe s. R esu lts:SDS-PAGE analysis revea led tha t Am aran thus
spinosus pollen pro te ins comprised a t lease eleven disc re te pro tein bands w ith the mo lecu la rwe igh t rang ing from 15 kD
to 80 kD, nine ma in bandsw ith them o lecularw eight be ing 18 kD, 24 kD, 29 kD, 35 kD, 39 kD, 40 kD, 42 kD, 62
kD, 78 kD re spec tive ly. W estern blo t assay indicated tha t the c rude ex trac t reacted w ith serum obtained from six teen
Am aranthus spinosus po llen-alle rg ic sub jec ts and conta ined four alle rgen bands in tota l, and tha t the 78 kD and 40 kD
bands we re the m ajor alle rgenic com ponen ts. Conclu sions:The 78 kD and 40 kD bands w ere the m ajor alle rgens o f
Am aranthus spinosus.
K ey words　 am aranthus spino sus;a llerg en;SDS-PAGE;Weste rn b lo tting
作者简介:赵绮华(1957. 8 -),女 , 实验师。
研究方向:免疫学。
*通讯作者:E-m a il:tom zqh@ tom. com
　　刺苋 ,苋科苋属 ,别名野勒苋 、野苋菜 、土苋菜
等 。刺苋花粉是一种重要的致敏原 ,中国气传花粉
调查发现全国各地都有分布。气传致敏花粉是非常
重要的吸入性变应原 ,可导致过敏性疾病 (变应性
鼻炎 、哮喘 、花粉症)是人们所公认的。在不同地区
或同一地区的不同季节 ,因当地植物生活特性及气
候条件的不同 ,其空气中的气传花粉也不同 ,各地具
有不同的特点[ 1] 。花粉变态反应属于环境性疾病 ,
严格说来 ,凡有高等植物生长的地方均有可能有花
粉症病人的存在。花粉过敏病人除见于变态反应科
外 ,还可见于内科 、耳鼻喉科 、小儿科 、皮肤科 、眼科 ,
甚至有些花粉过敏病人还表现为各种神经症状而出
现在神经精神病科[ 2] 。由于空气中常年均有花粉
飘散 ,其高峰期在每年 7 ～ 8月份 ,故使病人在不同
季节受到不同程度的损害 ,甚至发生过敏性休克而
危及病人的生命。目前关于我国刺苋花粉特异性变
应原成分的分析和鉴定尚未见报道。本文采用
SDS-PAGE和W estern b lotting的方法对刺苋花粉的
变应原成分进行分析 、鉴定 ,这也是我国首次对刺苋
花粉致敏组分的报道。
1
第 33卷第 4期 广 州医 学院 学报 V o.l 33N o. 4
　2005年 8月 ACADEM IC JOURNAL OF GUANGZHOU M EDICAL COLLEGE Aug. 2005
1　材料和方法
1. 1　主要试剂
丙烯酰胺 、甲叉双丙烯酰胺 、甘氨酸 、过硫酸铵 、
SDS、四甲基乙二胺 (TEMED)、TWEEN-20、羊抗人
IgE-HRP购自 Sigma;蛋白标准品 、 PVDF 膜购自
B IO-RAD;Tris购自 Roche;其他试剂为国产分析纯
试剂。
1. 2　主要仪器设备
低温离心机:Hereaus M ultifuge 3s-R、制冷机:
GRANT FM-70、分光光度计:安玛西亚 U ltrospec
2100 Pro 、 真 空 冷 冻 干 燥 机:LABLONCOL
FREEZONE 6升立式 真空泵 195、凝胶成像系统:
B IO-RAD hUniversal hood Ⅱ-S. N 76S /00417、直流
稳压器:BIO-RAD Pow e r /PAC3000、垂直板电泳槽:
B IO-RAD m ini-Pro tean 3 cell、转膜电泳槽:BIO-RAD
m ini-Trans-B lo t。
1. 3　刺苋花粉的采集和粗浸液的制备
在广州新滘敦和乡一无污染的荒地 ,由专业技
术人员定时采集花穗。除杂质 ,自然风干 。参照乔
秉善编变态反应学实验技术 [ 3 ] ,用研钵磨碎花穗 ,
过 80目筛(孔径 0. 2 mm)。用丙酮和乙醚 (2∶1)脱
脂 3次以上 。将欲脱脂的材料按 1∶3(w /v)的比例
浸泡在脱脂液中 ,在室温下不断搅动 , 1 ～ 2 h后 ,将
上清液倒掉 ,换入新鲜溶剂 ,继续搅动 ,如此反复脱
脂 ,直到溶剂不再浑浊为止 ,以保证材料水溶性的有
效成分更容易在水溶液中浸出提取 ,也可防止在提
取过程中出现乳化现象。脱脂后置于通风橱室温自
然风干 ,过 160目筛 (孔径 0. 097 mm )后分装。提
取:用缓冲盐水 (配方:氯化钠 5. 0 g,磷酸二氢钾
0.36 g,磷酸氢二钠 1. 43 g,苯甲醇配成 0. 5%,蒸馏
水 1 L, pH 7. 0,所有化学药品采用分析纯 )以 ρ=
3%的浓度在 4度浸泡材料 3 d,其间每天用磁力搅
拌器搅拌 2 h。最后 5 000 r /m in离心 20m in除去杂
质 ,吸取上清液。透析 、冻干备用。
1. 4　血清来源与制备
以临床病史 、皮试和 UniC ap(Pharmacia)检测为
依据 ,选取 2003年 10月到 2004年 12月本科门诊
刺苋过敏病人 16例 。取无刺苋过敏史 、皮试和
Un iCap(Pharmacia)刺苋检测阴性为对照。取其血
液分离血清 ,分装 ,置 - 80 ℃保存。
1. 5　SDS-PAGE
参照蛋白质电泳实验技术[ 4 ] ,采用不连续系统
进行垂直板电泳 ,对刺苋浸液组分进行分析 。浓缩
胶浓度为 4%,分离胶浓度 7. 5% ～ 17%。蛋白分子
量标准购自 B io-Rad公司。样品 (蛋白浓度为 30
mg /mL)和上样缓冲液 1∶2混合 ,置沸水浴处理 3
m in,离心 ,取上清每孔上样 15 μL。电泳电压采用
100 V ,待溴酚蓝指示剂达底部电泳完毕 ,用考马斯
亮蓝染色过夜 ,用脱色液充分脱色 。用凝胶成像分
析系统计算蛋白质的分子量 。
1. 6　Western b lo tting
通过免疫印记分析刺苋浸出液的致敏组分 [ 5] 。
PVDF膜先用 100%甲醇浸泡 30 s,然后连同电泳后的
SDS-PAGE一起浸泡在转膜液 20 m in,依次按纤维
垫—滤纸—凝胶— PVDF膜 —滤纸—纤维垫的顺序
夹在转印架 ,恒压 100 V ,电转移 1 h。转膜后用丽春
红染色 ,确证蛋白转到 PVDF膜上。已转印的膜用封
闭液封闭 ,后依次加一抗 (病人血清或阴性对照血清 )
和二抗 (羊抗人 IgE-HRP)孵育 ,采用二氨基联苯胺
(DAB)显色 ,其间每次操作膜都漂洗干净。
2　结　果
2. 1　刺苋花粉粗浸液蛋白成分的分析
刺苋花粉粗浸液蛋白经用不同浓度的 SDS-
PAGE多次反复分析 ,显示可辨蛋白条带有 11条 ,
条带分布在 15 kD ～ 80 kD之间 ,其中主带有 9条 ,
分子量分别为 18 kD、 24 kD、 29 kD 、35 kD、39 kD、
40 kD、42 kD、 62 kD、78 kD (见图 1)。由图可见 ,
刺苋花粉主要抗原成分分布在 29 kD ～ 78 kD ,该区
域的蛋白条带清晰 ,而 24 kD以下的条带呈弥散状 ,
可能与刺苋花粉粗浸液的特性有关。
图 1　刺苋花粉粗提液 SDS-PAGE结果(考马斯亮蓝染色)
Fig. 1　 SDS-PAGE of Am aran thus sp inosus pollen extract
(C oomassie br illiant b lue sta in)
2. 2　Western b lo tting鉴定花蟹致敏蛋白
取对刺苋花粉过敏的病人(16例)的血清作为一
抗 ,同时取正常人血清作阴性对照 ,分别进行免疫印
记 , 16例病人血清均有阳性带出现 ,其中 78 kD和 40
2
广州医学院学报 (JGZMC)　2005, 33(4)
kD抗原分别与 13个和 15个刺苋花粉过敏的病人血
清特异性 IgE显阳性反应 , 阳性反应率为 81%和
94%,为刺苋花粉主要特异性变应原 。 (见图 2)
图 2　刺苋花粉致敏蛋白W estern b lotting图
F ig. 2　W estern b lotting of sand sw imm ing Amaran thus
sp inosus pollen allergen
1 ～ 3:Amaranthus sp inosusl positive serum;4:negative serum
3　讨　论
气传花粉在变态反应学举足轻重 ,引起了国内
外学者的高度重视 ,纷纷对气传花粉的分布进行了
调查[ 6 ～ 11] ,使广大医务工作者加深了对花粉致病的
认识。花粉最主要的致敏成分是蛋白质 [ 12] ,其中包
括主要 、次要变应原及其他非特异性蛋白质成
分 [ 13] ,临床使用的刺苋粗浸液由于未进行纯化和标
准化 ,使不同批次变应原成分和浓度有差异 ,使用这
种未经定性和定量的变应原浸液进行临床研究和治
疗 ,可造成临床结果间缺乏同一的比较标准 [ 14] ,并
影响临床疗效 ,甚至发生严重的不良反应 。本研究
通过 SDS-PAGE分析 ,显示可辨蛋白条带有 11条 ,
分子量在 15 ～ 80 kD之间 ,其中主带有 9条 ,分子量
依次为 18 kD、24 kD、29 kD、35 kD、39 kD、40 kD、42
kD、62 kD、78 kD。Weste rn b lotting结果表明 , 16份
刺苋花粉过敏患者的血清全部呈阳性反应 ,浸出液
中共有 4条致敏条带 ,其中主要致敏蛋白的分子量
是 78 kD和 40 kD。根据其结果可通过生化技术除
去非致敏蛋白和对疫苗进行标准化 ,以提高特异性
诊断的准确性和免疫治疗的有效性。
免疫治疗是唯一可能影响变应性疾病自然病程
的治疗措施 ,而变应原提取物的质量对临床特异性
诊断的准确性和治疗的有效性都是至关重要的 ,因
此 , 1998年WHO发布的脱敏治疗指导文件指出:所
有的变应原疫苗都应该标准化 ,以保证变应原浓度 、
生物活性及免疫效能 [ 15] 。本研究采用免疫印迹技
术对刺苋花粉的变应原成分进行分析 、鉴定 ,为刺苋
花粉变应原的纯化和标准化变应原疫苗的研制提供
理论依据 。
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(收稿日期　2005 -04 - 06)
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