全 文 ：doi:10. 3969 / j. issn. 1000-484X. 2013. 09. 003
①本文受国家自然科学基金(81060369)和青海省应用基础研究项
目(2010-Z-722)资助
②青海大学医学院，西宁 810001
作者简介:王 刚(1966 年－) ，男，博士，副教授，主要从事肿瘤免疫
研究，E-mail:wanggangqh@ 163． com。
雪灵芝水提物对淋巴细胞增殖及 Th1 型细胞因子表达的影响①
王 刚 王海燕 张 华 贺菊香 吉利宾② 杨歆睿② (青海大学医学院病理学教研室，西宁 810001)
中国图书分类号 Ｒ392. 12 文献标识码 A 文章编号 1000-484X(2013)09-0905-05
［摘 要］ 目的:探讨雪灵芝水溶性提取物对淋巴细胞增殖及其 Th1 型细胞因子表达的影响。方法:体外培养的小鼠脾
淋巴细胞及人外周血单个核细胞(PBMC)经不同浓度雪灵芝水提物处理。采用 MTT 法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平;应用
ELISA双抗体夹心法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中 IL-2和 IFN-γ 水平;ＲT-PCＲ 与实时定量 PCＲ 检测人 PBMC 中 NF-кB
p65、IL-2 及 IFN-γ的 mＲNA表达。结果:雪灵芝水提物在 0． 025 ～ 0． 2 mg /ml浓度范围，对小鼠脾淋巴细胞增殖具有浓度依赖
性的促进作用;0． 05 mg /ml 和 0． 1 mg /ml雪灵芝处理组 IL-2水平高于对照组(P＜0． 05) ，0． 4 mg /ml雪灵芝处理组 IFN-γ水平
高于对照组(P＜0． 05) ;相对于对照组，0． 2 mg /ml雪灵芝处理组人 PBMC的 NF-кB p65、IL-2 及 IFN-γ mＲNA相对表达系数分
别为 204． 76、4． 31 和 40． 46。结论:雪灵芝水提物对小鼠脾淋巴细胞增殖以及小鼠脾淋巴细胞、人 PBMC中 Th1 型细胞因子的
表达具有促进作用。
［关键词］ 雪灵芝;淋巴细胞;细胞增殖;Th1 型细胞因子
Effects of Arenaria kansuensis aqueous extract on lymphocytes proliferation and
Th1 cytokine production
WANG Gang，WANG Hai-Yan，ZHANG Hua，HE Ju-Xiang，JI Li-Bin，YANG Xin-Ｒui． Department of Pathology，
Medical College of Qinghai University，Xining 810001，China
［Abstract］ Objective:To investigate the effects of Arenaria kansuensis aqueous extract (AKAE)on lymphocytes proliferation
and Th1 cytokine expression． Methods:Mice spleen lymphocytes and human peripheral blood monouclear cells(PBMC)were treated
with AKAE at various concentration in vitro;the proliferation level of mice spleen lymphocytes was observed by MTT assay;the level of
IL-2 and IFN-γ produced by mice spleen lymphocytes were tested by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ;ＲT-PCＲ and real-
time PCＲ were used to detect the mＲNA expression of NF-кB p65，IL-2 and IFN-γ in human PBMC． Ｒesults:The proliferation of
mice spleen lymphocytes was dose-dependently enhanceed by AKAE treatment at concentration of 0. 025 ～ 0． 2 mg /ml;in culture su-
pernatant of mice spleen lymphocytes，the level of IL-2 was increased after AKAE treatment at dose of 0. 05 mg /ml and 0. 1 mg /ml
(P＜0． 05) ，and the level of IFN-γ was increased after AKAE treatment at dose of 0. 4 mg /ml (P＜0． 05) ;compared with control
group，the relative expression of NF-кB p65，IL-2 and IFN-γ mＲNA in human PBMC treated by 0． 2 mg /ml AKAE were 204. 76，
4. 31 and 40. 46 respectively． Conclusion:AKAE could enhance the proliferation of mice spleen lymphocytes and promote the Th1 cy-
tokine expression of mice spleen lymphocytes and homo PBMC．
［Key words］ Arenaria kansuensis;Lymphocytes;Cell proliferation;Th1 cytokine
雪灵芝(Arenaria kansuensis)为青藏高原特有
的石竹科蚤缀属草本植物，分布于海拔 4 000 米以
上的高山草甸和砾石带。雪灵芝的藏药名为“阿仲
嘎保”，意为“采天地灵气之人间仙草”，以全草入
药。据藏医典籍记载雪灵芝具有“治疗胃肠之溃
疡、膨胀、癌症、瘰疬并能健胃助消”［1］。近年来国
内研究表明，雪灵芝具有抗炎、抗氧化、促消化以及
对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌具有预防作用［2-5］。
本研究组的前期研究显示，在一定的浓度范围内，雪
灵芝水提物对体外培养的胃癌细胞系，具有增殖抑
制作用。本文通过观察雪灵芝水提物对体外培养小
鼠脾淋巴细胞增殖水平以及小鼠脾淋巴细胞和人
PBMC中 Th1 型细胞因子表达的影响，探索雪灵芝
是否对发挥抗肿瘤作用的免疫细胞及细胞因子具有
激活作用。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 动物与细胞 清洁级昆明小鼠，4 ～ 6 周龄，
·509·王 刚等 雪灵芝水提物对淋巴细胞增殖及 Th1 型细胞因子表达的影响 第 9 期
体重(20±2)克，购自青海省地病所实验动物中心;
健康人外周血采自研究组工作人员。
1． 1． 2 主要试剂与仪器 雪灵芝水提物冻干粉剂
由本实验室制备，冻干粉剂用 PBS溶解(浓度 4 mg /
ml) ;四氮唑盐(MTT)、胰蛋白酶、ＲPMI1640 培养基
均购自 Gibco 公司;胎牛血清购自 Hyclone 公司;刀
豆蛋白(ConA)、植物血凝素(PHA)及二甲基亚砜
(DMSO)购自 Sigma 公司;红细胞裂解液购自碧云
天生物技术研究所;小鼠 IL-2与 IFN-γ 的 ELISA 试
剂盒购自 eBioscience 公司;Trizol 购自 Invitrogen 公
司;AMV 逆转录酶、Taq DNA 聚合酶购自 Promega
公司;SYBＲ Green 实时定量 PCＲ 试剂盒购自 QIA-
GEN公司;荧光定量 PCＲ 仪(FQD-48A 型，杭州博
日科技有限公司) ;酶标仪(Ｒayto ＲT-6000 型，深圳
雷杜生命科学股份有限公司)。
1． 2 方法
1． 2． 1 小鼠脾淋巴细胞悬液制备 颈椎脱臼法处
死小鼠，75%酒精浸泡，无菌条件下分离脾脏，置皿
中剔除脂肪和结缔组织，将脾组织研碎后用生理盐
水混悬，经 200 目滤网过滤，收集滤液，1 500 r /min
离心 5 分钟后弃上清，加入 3 倍体积红细胞裂解液，
置冰上裂解 1 分钟，4℃离心弃上清后重复裂解一
次，用含 2%小牛血清 Hank s 液洗涤离心细胞两
次，台盼蓝染色测细胞活力≥95%，用含 10%胎牛
血清的 ＲPMI1640 培养基按 2 ×106cells /ml 制备细
胞悬液。
1． 2． 2 四氮唑盐(MTT)法检测小鼠脾淋巴细胞增
殖 按 100 μl /孔接种小鼠脾淋巴细胞悬液于 96 孔
培养板，各孔加入含 ConA(终浓度 1 μg /ml)培养液
50 μl;各处理组每孔加入含相应浓度雪灵芝水提物
的培养液 50 μl，对照组(0 mg /ml组)加入等量培养
液，每组设 5 复孔。37℃ 5% CO2 培养 44 小时，每
孔加 20 μl MTT(5 mg /ml) ，继续培养 4 小时。小心
吸弃上清，各孔加入 150 μl DMSO，振荡溶解 5 分钟，
酶标仪检测490 nm波长OD值，结果以刺激指数
(SI)表示:SI=实验组 OD值 /对照组 OD值。
1． 2． 3 体外培养小鼠脾淋巴细胞上清中 IL-2 及
IFN-γ水平检测 按 1 ml /孔接种小鼠脾淋巴细胞
悬液于 24 孔培养板，各孔加终浓度为 1 μg /ml 的
ConA;处理组加入相应浓度雪灵芝水提物，对照组
(0 mg /ml组)加入等量培养液。培养 48 小时后离
心收集培养上清，－70℃保存待测。IL-2 及 IFN-γ
ELISA检测严格按试剂盒说明书操作。
1． 2． 4 人 PBMC中 Th1 细胞因子 mＲNA 表达检测
健康人外周静脉血经 60% Percoll 密度梯度离心，
分离人 PBMC，PBS洗涤 2 次，用含 10%胎牛血清的
ＲPMI1640 培养基调整细胞浓度为 1×106 ml－1，按 2
ml /孔，接种于 6 孔板，各孔加入终浓度 5 μg /ml 的
PHA。处理孔加入相应浓度雪灵芝水提物，对照孔
(0 mg /ml)加入等量培养液。培养 8 小时后收集细
胞，Trizol法抽提总 ＲNA 并合成 cDNA 第一链。配
制 25 μl PCＲ反应体系:ddH2O 16 μl，10×PCＲ 缓冲
2． 5 μl，dNTP Mix(Each 2． 5 mmol /L)2 μl，MgCl2
(25 mmol /L)1． 5 μl，Taq 酶(5 U /μl)0． 2 μl，cDNA
1 μl、上、下游引物(表 1，10 μmol /L)各 1 μl;经
94℃变性 5 分钟，94℃ 30 秒，55℃ 45 秒，72℃ 45
秒扩增 33 个循环，72℃延伸 5 分钟。扩增产物进行
2%琼脂糖凝胶电泳并观察拍照。配制 20 μl 荧光
定量 PCＲ 体系:ddH2O 7 μl，2 × QuantiFast SYBＲ
Green PCＲ 预混液 10 μl，cDNA 1 μl，上、下游引物
(10 μmol /L)各 1 μl 。按 95℃变性 5 分钟，95℃ 15
秒，60℃ 45 秒(测荧光 1 次)扩增 40 个循环;之后
从 60℃至 95℃，以 0． 2℃台阶升温，进行熔解曲线
分析。各组样品设 3 复孔，以管家基因 GAPDH 为
内参照，以对照组作标准校比，2－ΔΔCt 法进行相对定
量分析。
1． 3 统计学方法 采用 SPSS19 软件进行统计学处
理，实验数据以 x±s 表示，组间比较采用单因素方
差分析，采用 LSD 法进行显著性检验，检验水准
为 α= 0． 05。
表 1 引物序列与产物大小
Tab． 1 Primer sequence and product size
Gene Sense primer (5-3) Anti-sense primer (5-3) Product (bp)
NF-кB p65 AGCACAGATACCACCAAG CAGCATTCAGGTCGTAGT 319
IL-2 ACTCACCAGGATGCTCACAT CAAGTCAGTGTTGAGATGA 297
IFN-γ AGGTCATTCAGATGTAGCGGA CGACAGTTCAGCCATCACT 313
GAPDH GCTCTCCAGAACATCAT TCGTTGTCATACCAGGA 347
·609· 中国免疫学杂志 2013 年第 29 卷
2 结果
2． 1 雪灵芝水提物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
MTT法检测结果显示，0． 05 ～ 0． 4 mg /ml 雪灵芝
水提物处理组 SI 高于对照组(P ＜ 0． 05) ，同
时 0． 025 ～ 0． 4 mg /ml处理组 SI 高于 0． 8 mg /ml 组
(P＜0. 05) ，其中 0． 2 mg /ml 组 SI 为 1． 98±0． 51(图
1)。
2． 2 雪灵芝水提物对小鼠脾淋巴细胞分泌 Th1 型
的影响 ELISA 检测结果显示，0． 05 ～ 0． 1 mg /ml
雪灵芝水提物处理组小鼠脾淋巴细胞培养上清中
IL-2水平明显高于对照组(P＜0． 05) ;而 0． 4 mg /ml
雪灵芝水提物处理组 IFN-γ 水平明显高于对照组
(P＜0． 05，表 2)。
2． 3 雪灵芝水提物对人 PBMC 中 NF-κB p65、IL-2
及 IFN-γ mＲNA 表达的影响 ＲT-PCＲ 扩增出与预
期大小一致的 NF-кB p65、IL-2 及 IFN-γ 条带;荧
光实时定量PCＲ结果显示，0． 2mg /ml雪灵芝水提物
图 1 雪灵芝水提物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
Fig． 1 The effect of AKAE on proliferation of mice
spleen lymphocytes
Note:* ．P＜0．05 vs 0 mg/ml group;﹟． P＜0．05 vs 0．8 mg/ml group．
表 2 不同浓度雪灵芝水提物对小鼠脾淋巴细胞分泌 IL-2
及 IFN-γ的影响 (pg /ml，x±s，n=5)
Tab． 2 The effect of different concentration AKAE on IL-
2 and IFN-γ production of mice spleen
lymphocytes (pg /ml，x±s，n=5)
Concentration(mg /ml) IL-2 IFN-γ
0 55． 88±7． 20 29． 11±4． 67
0． 05 155． 9±29． 641) 42． 37±6． 82
0． 1 371． 95±82． 111) 45． 68±9． 11
0． 2 32． 47±5． 59 48． 93±9． 37
0． 4 19． 32±4． 53 87． 70±16． 541)
Note:Compared with 0 mg /ml group，1)P＜0． 05．
处理组 IL-2 mＲNA 表达水平较对照组明显升高;
0. 1 mg /ml和 0． 2 mg /ml处理组 NF-кB p65 及 IFN-
γ mＲNA 表达水平明显高于对照组。0． 2 mg /ml 处
理组的 NF-кB p65、IL-2及 IFN-γ 相对表达量，分别
为 185． 75±19． 7、4． 31±0． 05 和 36． 67±5． 48。熔解
曲线分析显示，3 种扩增产物峰值单一，说明没有引
物二聚体和非特异性条带形成(图 2)。
3 讨论
雪灵芝的药用研究始于上世纪末，国内研究者
进行的植化研究显示，雪灵芝含有多糖、三萜皂苷、
β-咔波啉生物碱及环肽等活性物质［6］。在免疫相
关的研究方面，彭宝珠等［2］通过巴豆油致小鼠耳肿
胀、蛋清 /角叉菜胶致大鼠足肿胀等炎症模型以及观
察小鼠胸腺、脾脏及淋巴结重量变化的实验研究，显
示雪灵芝具有抗炎和免疫调节作用;李凤文等［7］研
究报道，雪灵芝具有促进小鼠脾细胞增殖、增强小鼠
迟发性变态反应、提高小鼠抗体生成细胞数和小鼠
血清溶血素水平以及增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能
力等免疫增强作用。
本课题组之前进行的体外抑瘤研究显示，雪灵
芝水提物在 0． 1 ～ 0． 8 mg /ml浓度范围，对体外培养
人胃癌 MG803 细胞增殖呈现出明显的剂量依赖性
抑制效应，IC50 =(0． 134 ± 0． 005)mg /ml(另文报
道)。由此，本文为了解雪灵芝水提物在上述抑瘤
有效浓度下，是否对与机体抗肿瘤免疫密切相关的
淋巴细胞增殖和 Th1 型细胞因子表达具有促进作
用，进行了探索。
首先，淋巴细胞中 Th1 型 T 细胞亚群通过产生
IL-2、IFN-γ 及 IL-12 等细胞因子，对巨噬细胞吞噬
功能、DC 细胞成熟、NK 细胞与 CTL 细胞毒作用发
挥正性调节，是机体抗肿瘤免疫的主要执行者。本
研究显示，在 0． 025 ～ 0． 4 mg /ml 浓度范围，雪灵芝
对小鼠脾淋巴细胞增殖具有明显促进作用。其中
0． 025 ～ 0． 2 mg /ml 处理组 SI 呈浓度依赖性升高，
0. 2 mg /ml组 SI达 1． 98;然而，随雪灵芝作用浓度
进一步增加，小鼠脾淋巴细胞增殖水平开始呈下降
趋势，0． 8 mg /ml 处理组 SI 仅为 0． 82，明显低于其
他处理组。这种药物作用浓度与细胞增殖水平之间
的非线性关系，提示雪灵芝对淋巴细胞增殖可能具
有与浓度高低密切相关的双向调节作用。
其二，ELISA检测结果显示，在小鼠脾淋巴细胞
培养上清中，0． 5 mg /ml和 0． 1 mg /ml 组 IL-2水平、
0． 4 mg /ml组 IFN-γ 水平均高于对照组;实时定量
PCＲ结果显示，0． 2 mg /ml 处理组人 PBMC 的 IL-2
·709·王 刚等 雪灵芝水提物对淋巴细胞增殖及 Th1 型细胞因子表达的影响 第 9 期
图 2 雪灵芝水提物对人 PBMC中 IL-2及 IFN-γ mＲNA表达的影响
Fig． 2 The effect of AKAE on mＲNA expression of p65，IL-2 and IFN-γ in human PBMC
mＲNA表达明显升高，0． 1 ～ 0． 2 mg /ml 组人 PBMC
的 IFN-γ和 p65 mＲNA表达显著升高。由于 p65 蛋
白是构成核转录因子(NF-κB)的主要亚基，p65 的
升高可促进 NF-κB核转位，在 Th0 细胞向 Th1 分化
及表达 IL-2、IFN-γ 的过程中具有正反馈调节作
用［8-10］。提示雪灵芝可能通过 NF-κB 信号通路，纠
·809· 中国免疫学杂志 2013 年第 29 卷
正 Th1 /Th2 偏移，增强机体抗肿瘤免疫。
综合上述淋巴细胞增殖和细胞因子表达的研究
结果，我们认为，0． 05 ～ 0． 4 mg /ml 是雪灵芝激活淋
巴细胞增殖、促进 Th1 细胞因子表达，从而发挥抗肿
瘤免疫的最佳效应浓度范围，而这一范围与我们前
述的体外抑瘤效应浓度高度重合。这为进一步开展
荷瘤鼠研究，探讨雪灵芝是否具有体内肿瘤抑制与
免疫激活双重作用，提供了依据。
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(编辑 许四平)
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(编辑 许四平)
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·909·王 刚等 雪灵芝水提物对淋巴细胞增殖及 Th1 型细胞因子表达的影响 第 9 期