全 文 ：2014 年 11 月
第 34 卷 第 11 期
基础医学与临床
Basic ＆ Clinical Medicine
November 2014
Vol． 34 No． 11
收稿日期:2014-04-10 修回日期:2014-06-20
基金项目:国家自然科学基金(81260196) ;内蒙古自治区高等学校青年科技英才支持计划(NJYT-13-B20) ;内蒙古自治区
高等学校科学研究重点项目(NJZZ12306，NJZZ14271);国家社会科学基金(13CＲK009) ;内蒙古自然科学基金
(2013MS1176，2014MS0892，2014BS0802，2014MS0814) ;赤峰学院科研创新团队建设计划(20130901A)
* 通信作者(corresponding author):whongquan@ alu． fudan． edu． cn
文章编号:1001 -6325(2014)11 -1468 -04 研究论文
类叶升麻苷通过诱导
血红素加氧酶 - 1 的表达抑制 MPP + 诱导的 PC12 细胞损伤
王洪权1* ，王玉敏2，崔其福1，赵伟丽1，成 龙3
(赤峰学院 医学院 附属医院 1. 神经内科;2. 肿瘤内科，内蒙古 赤峰 024005;
3. 中国医学科学院 药用植物研究所 药理毒理研究中心，北京 100097)
摘要:目的 探讨类叶升麻苷(AS)是否在 PC12 细胞中诱导血红素加氧酶-1(HO-1)的表达进而抑制 1-甲基-4-苯
基吡啶(MPP +)诱导的神经毒性损伤。方法 类叶升麻苷(1、20 和 30 μmol /L)处理 PC12 细胞 12 h，利用反转录
PCＲ(ＲT-PCＲ)检测 HO-1 mＲNA表达、Western blot方法和免疫荧光方法检测 HO-1 蛋白的表达。1mmol /L MPP +
单独或与 AS处理细胞，或 HO-1 抑制剂锌原卟啉(ZnPP)预处理细胞 1 h，MTT法检测细胞活力。结果 与正常对照
组相比，AS可在 PC12 细胞中诱导 HO-1 mＲNA和蛋白的表达，AS诱导的 HO-1 表达主要集中在胞浆内。HO-1 抑
制剂 ZnPP减弱 AS对 MPP +诱导损伤的抑制作用。结论 AS可在 PC12 细胞中诱导 HO-1 的表达，可能参与 AS对
MPP +诱导损伤的抑制作用。
关键词:类叶升麻苷;血红素加氧酶-1;1-甲基-4-苯基吡啶;神经保护
中图分类号:Ｒ 741. 05 文献标志码:A
Acteoside attenuates MPP + -induced
PC12 cell injury through heme oxygenase-1 expression
WANG Hong-quan1* ，WANG Yu-min2，CUI Qi-fu1，ZHAO Wei-li1，CHENG Long3
(1. Dept． of Neurology;2. Dept． of Oncology，Affiliated Hospital，Chifeng Medical College，Chifeng University，Chifeng 024005;
3. Ｒesearch Center for Pharmacology and Toxicology，Institute of Medicinal Plant Development，CAMS，Beijing 100097，China)
Abstract:Objective To investigate whether acteoside (AS)can protect PC12 cells against MPP + -induced
neurotoxicity through induction of HO-1 expression． Methods PC12 cells were stimulated with AS(1、20 and
30 μmol /L)for 12 h，ＲT-PCＲ was used to analyze HO-1 mＲNA expression，and Western blot and confocal mi-
croscopic analysis was applied to determine the expression of HO-1 protein． Cells were pre-incubated with vehicle
or AS for 2 h，followed by incubation with 1 mmol /L MPP + for another 24 h，or cells were pretreated with Zinc
Protoporphyrin (ZnPP)for 1 h in the absence or presence of AS and then exposed to MPP + for 24 h，cell viability
was measured by MTT assay． Ｒesults AS significantly reduced MPP + -induced the loss of cell viability． AS in-
duced the expression of HO-1 in PC12 cells at mＲNA and protein level． Acteoside-induced HO-1 which was pre-
DOI:10.16352/j.issn.1001-6325.2014.11.034
王洪权 类叶升麻苷通过诱导血红素加氧酶-1 的表达抑制 MPP +诱导的 PC12 细胞损伤
dominantly localized to the cytoplasm． The HO-1 inhibitor ZnPP markedly abolished the neuroprotective effect of
AS against MPP + -induced neurotoxicity． Conclusions Acteoside induces HO-1 expression，thereby attenuates
MPP + -induced PC12 cell injury．
Key words:acteoside;heme oxygenase-1;MPP +;neuroprotection
氧化应激 (oxidative stress，OS)损伤在帕金森
病(Parkinsons disease，PD)的发病机制及其多巴胺
能神经元死亡中发挥重要作用［1］。针对抗 OS 的策
略则成为 PD有效的治疗途径。
研究显示上调 HO-1 的表达具有广泛的细胞
保护作用。HO-1 在帕金森病中的作用引起了广
大研究者的注意［2-3］。一些化合物通过诱导 HO-1
的表达可在帕金森疾病模型中发挥神经保护作
用［4］。因此鉴定出具有诱导 HO-1 表达的化合物
成为目前国际的研究热点。类叶升麻苷(acte-
oside，AS)是一种糖苷类，具有神经保护活性，其可
以抑制 1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyri-
dinium ion，MPP +)诱导的细胞损伤［5-6］，但其神经
保护机制有待于进一步研究。本研究探讨 AS 是
否能够在 PC12 细胞中上调 HO-1 的表达，明确后
者上调是否参与其对 MPP +诱导损伤的抑制作用。
1 材料与方法
1. 1 试剂
类叶升麻苷(winherb medical technology Inc) ，
HO-1 抗体(#SPA895，Stressgen) ，HO-1 抑制剂锌原
卟啉 ZnPP(SC-200329)和免疫印迹化学发光试剂
(Santa cruz)，PVDF 膜(Millpore 公司)。MTT 和
MPP +(Sigma公司)。
1. 2 细胞存活率的检测
MTT法检测细胞活力，参照文献［7］。PC12 细
胞(ATCC)接种在含 5% 胎牛血清，10% 马血清，
100U /ml青霉素，100μg /mL 链霉素的 DMEM 培养
基中 (pH7. 2)，37℃，5% CO2 温育。
1. 3 ＲT-PCＲ检测 HO-1 mＲNA表达
Trizol提取总 ＲNA。HO-1 和 β-actin PCＲ 反应
条件为:94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，54 ℃30 s，和72 ℃
45 s共 25循环。根据文献设计合成引物，扩增出的
片段大小为 HO-1(322 bp)，β-actin(494 bp)。扩增
产物经 1. 2%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，紫外下拍
照记录。
1. 4 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测 HO-1
表达
依据参照文献［8］中方法。使用 ＲIAP缓冲液裂
解细胞，用 BCA试剂测定蛋白含量，通过电泳缓冲液
调整各组含量为 5 μg /L，每个样本上样量为 50 μg，
在 10%聚丙烯酞胺凝胶(SDS-PAGE)进行电泳后转
移至 PVDF膜，预染蛋白标准分子质量确定蛋白分子
质量标准位置。用含 10%脱脂奶粉吐温盐缓冲液
(TBS)液封闭，TBS洗 15 min ×3;加入 1抗，4 ℃振荡
孵育过夜，TBST洗 10 min ×3;1∶ 10 000加入辣根过
氧化物酶标记相应的二抗，37 ℃振荡孵育 1 h，TBS
洗10 min ×3;按 ECL试剂盒进行荧光显色反应。暗
室中曝光，显影，定影。用分析软件 Bio-Ｒad 分析每
个条带的吸光度值，以目的蛋白丰度 /β-actin 蛋白吸
光度比值的均数 ±标准差来表示。以 β 肌动蛋白作
为内参照，计算待测蛋白条带积分吸光度与 β肌动蛋
白的比值，表示待测蛋白的相对表达水平。
1. 5 免疫荧光检测 HO-1 在细胞内定位
参照文献中的方法［9］。
1. 6 统计学分析
结果以均数 ±标准差(x ± s)表示。资料采用
GraphPad Prism 4. 0 software (GraphPad Software，
Inc. ，San Diego，CA)进行统计分析，多样本均数比
较用单因素方差分析。
2 结果
2. 1 类叶升麻苷抑制 MPP +诱导的细胞存活率的
下降
1 mmol /L MPP +作用 PC12 细胞 24 h 后，细胞
存活率较对照组显著下降(P ＜ 0. 05)。AS(20 和
30 μmol /L)预处理 2 h 后，可明显抑制 MPP +所导
致的细胞存活率的下降(P ＜ 0. 05)(图 1)。
2. 2 类叶升麻苷在 PC12细胞中诱导HO-1的表达
20 和 30 μmol /L AS 可明显上调 HO-1 mＲNA
(图 2A，表 1)。AS 可以诱导 HO-1 蛋白的表达
(图 2B，表 1)。
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基础医学与临床 Basic ＆ Clinical Medicine 2014. 34(11)
*P ＜ 0. 05 compared with control;#P ＜ 0. 05 compared
with MPP + treated group
图 1 类叶升麻苷对MPP +诱导的 PC12 细胞
存活率的影响
Fig 1 The effect of acteoside on MPP + induced
cell viability in PC12 cells(x ± s，n =3)
Cells were incubated with various concentrations of ac-
teoside for 12 hours;A. the HO-1 mＲNA;B. HO-1
protein level
图 2 类叶升麻苷诱导 PC12 细胞 HO-1 的表达
Fig 2 Acteoside induces HO-1 expression in PC12
cells(x ± s，n =3)
表 1 类叶升麻苷诱导 PC12 细胞 HO-1 的表达
Table 1 Acteoside induces HO-1 expression
in PC12 cells(x ± s，n =3)
group HO-1 mＲNA HO-1 protein
control 100 ± 18 100 ± 41
AS 1 μmol /L 137 ± 26 163 ± 70
AS 20 μmol /L 226 ± 48* 322 ± 67*
AS 30 μmol /L 339 ± 73＊＊ 380 ± 126＊＊
＊P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01 compared with control．
2. 3 类叶升麻苷诱导HO-1蛋白的表达位于胞质内
AS 可在 PC12 细胞中诱导 HO-1 的表达，而
HO-1 的表达升高主要集中在胞质内(图 3)。
PC12 cells were treated with 30 μmol /L acteoside for 12
hours，and was examined by immunochemical staining of
HO-1 and confocal microscopic analysis; cells were
stained with an anti-HO-1 antibody(middle panel)and
nuclei with DAPI(left panel)Scale bar = 5 μmol /L
图 3 免疫荧光染色显示类叶升麻苷在 PC12 细胞
诱导 HO-1 蛋白的表达
Fig 3 Acteoside induces HO-1 protein expression
in PC12 cells by immunochemical staining
2. 4 类叶升麻苷通过上调 HO-1 表达抑制 MPP +
诱导的细胞损伤
AS(30 μmol /L)预处理 2 h 后，可明显抑制
MPP +所导致的细胞存活率的下降(P ＜ 0. 05) (图
4) ，而 HO-1 抑制剂 ZnPP 可以减弱 AS 对 MPP +诱
导细胞损伤的抑制作用(P ＜ 0. 05) (图 4)。
*P ＜ 0. 01 compared with control;#P ＜ 0. 05 compared
with MPP + treated group;△P ＜ 0. 05 compared with
MPP + plus AS group
图 4 类叶升麻苷通过上调 HO-1 表达抑制MPP +
诱导的细胞损伤
Fig 4 Acteoside protect against MPP + induced
neurotoxicity by upregulating HO-1
expression(x ± s，n =12)
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王洪权 类叶升麻苷通过诱导血红素加氧酶-1 的表达抑制 MPP +诱导的 PC12 细胞损伤
3 讨论
血红素加氧酶-1 (heme oxygenase-1，HO-1)是
一个具有保护作用的在应激早期发挥反应的抗氧
化酶蛋白，其参与游离血红素(Heme)降解的限速
酶，其分子质量为 32 ku，HO-1 催化血红素产生 CO、
胆绿素和游离铁［13］。大量研究表明，其细胞保护作
用引起了广大研究者的注意［10-11］。HO-1 在 PD 中
具有神经保护作用［14］。最近研究显示，通过药理学
途径上调 HO-1 表达可抑 MPP +引起的神经毒性损
伤。虾青素(astaxanthin)可通过促进 HO-1 的表达
从而保护 PC12 细胞受 MPP +介导的 NOX2 来源的
ＲOS氧化损伤［12］。1，2，3，4，6-O-五没食子酰葡萄
糖通过 PI3K和 EＲK /Nrf2 通路促进 HO-1 的表达从
而保护 PC12 细胞受 MPP +介导的氧化损伤［4］。
类叶升麻苷具有神经保护活性。AS 在帕金森
病模型中具有神经保护作用，AS 可通过抗氧化和
抗凋亡机制抑制 MPP + 诱导的神经毒性损伤［5-6］。
上调 HO-1 表达在 PD 具有神经保护作用。因此本
研究以 HO-1 为切入点，研究 AS 的新的药理学作
用。发现类叶升麻苷可在体外诱导 HO-1 mＲNA和
蛋白的表达，进一步免疫荧光染色显示类叶升麻苷
可在 PC12 细胞中诱导 HO-1 的表达，而 HO-1 的表
达升高主要集中在胞质内。HO-1 抑制剂 ZnPP 可
以减弱类叶升麻苷对 MPP +诱导细胞损伤的抑制作
用，这表明 HO-1 表达上调参与类叶升麻苷对 MPP +
诱导细胞损伤的抑制作用机制。
综上所述，本研究鉴定出类叶升麻苷为一个新
的诱导 HO-1 表达的新的化合物。本研究阐明了类
叶升麻苷新的药理作用，即其可通过上调 HO-1 的
表达抑制 MPP +诱导的神经毒性损伤。为进一步探
讨其抑制氧化应激相关疾病的神经保护作用机制
奠定了基础。
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