全 文 ：黑草药材 HPLC指纹图谱的研究*
刘吉成，陈大建
(广西玉林食品药品检验所，玉林 537000)
摘要 目的:以不同产地的黑草为研究对象，建立黑草药材的 HPLC指纹图谱，为科学评价和有效控制黑草药材的质量提供科
学依据。方法:以木犀草素成分为参照峰，采用 HPLC法建立黑草药材的指纹图谱;色谱柱:Agilent Extend － C18(250 mm × 4. 6
mm，5 μm) ，流动相:乙腈与 0. 7%冰醋酸，梯度洗脱;流速:1. 0 mL·min －1;检测波长:350 nm;柱温:35 ℃;进样量:10 μL。结
果:10 批次黑草药材中共有 12 个指纹图谱峰，经相似度计算，整体相似性好。结论:本文建立的指纹图谱有较强的针对性，为
黑草药材的研究以及制定黑草药材的质量控制标准提供科学依据。
关键词:黑草;木犀草素;芹菜素;香叶木素;高效液相色谱;指纹图谱
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2013)03 － 0424 － 05
* 广西自然科学基金项目(桂科自 0991068)
第一作者 Tel:13877502503;E － mail:liujichenggood@ 126． com
HPLC fingerprint study of the herb of Buchnera cruciata*
LIU Ji － cheng，CHEN Da － jian
(Yulin of Guangxi Institute for Food and Drug Control，Yulin 537000，China)
Abstract Objective:To establish the HPLC fingerprint of the herb of Buchnera cruciata Hamilt． from different
regions，and provide the scientific foundation for quality evaluation and quality control of the crude drug．Methods:
HPLC method was adopted and luteolin was used as an internal standard compound to build the HPLC fingerprint．
The Agilent Extend － C18 column(250 mm × 4. 6 mm，5 μm)was used，UV detection wavelength was set at 350
nm，and the column temperature was 35 ℃ ． The mobile phase was a linear gradient of acetonitrile and 0. 7% glacial
acetic acid at the flow rate of 1. 0 mL·min －1 ． Results:Twelve peaks were identified in HPLC fingerprint of ten
batches samples of B． cruciata，and the overall similarity was good according to the similarity calculation． Conclu-
sion:The fingerprint was specific and the established method can be used for research and quality control of the
crude drug of B． cruciata．
Key words:Buchnera cruciata Hamilt;luteolin;apigenin;diosmetin;HPLC;fingerprint
黑草系玄参科植物鬼羽箭属植物 Buchnera cru-
ciata Haimlt．干燥的全草，又名幼克草、克草、黑骨
草、羽箭草［1］，主要分布于广西、湖南、江西、福建、
云南、广东、海南等省区［2］。其味微苦、寒，性凉，具
有清热、凉血、解毒等功效，用于治疗流行感冒、中暑
腹痛、蛛网膜下腔出血、暑热口渴、腹痛、荨麻疹等疾
患［1 － 2］，钟正贤等［3 － 4］报道黑草具有抗凝、抗炎、镇
痛、抗过敏等药理作用。卢文杰［5］已经从黑草中分
离出有木犀草素、芹菜素、香叶木素、d －甘露醇、β －
谷甾醇、正二十七烷醇等 11 种化学成分，陈家源
等［6］已经鉴定出 33 种长链脂肪烃和脂肪酸类化合
物，本文作者已经报道应用 HPLC 测定不同产地黑
草药材中的木犀草素和芹菜素的含量［7］。
中药的疗效是多种活性成分共同协同作用的结
果，单一成分难以全面衡量生药及其制剂的质量和
疗效，本文首次应用 HPLC 方法对不同产地的黑草
生药材进行指纹图谱研究，为科学评价和有效控制
黑草药材的质量提供科学依据。
1 仪器、材料与试剂
仪器:Agilent 1100 型高效液相色谱仪;XS －
205Du电子分析天平(瑞士梅特勒公司) ;KQ －
250DB型数控超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公
—424— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(3)
DOI:10.16155/j.0254-1793.2013.03.014
司) ;Millipore Synergy － UV超纯水机。
材料:实验所用黑草药材分别采集于广西桂林、
广西柳州、广西河池、广西南宁和贵州等地。样品产
地及编号如下:桂林阳朔(1 号)、贵州贵阳(2 号)、
桂林兴安(3 号)、桂林恭城(4 号)、广西河池(5
号)、广西柳州(6 号)、桂林龙胜(7 号)、广西南宁(8
号)、柳州融水(9 号)、桂林荔浦(10 号) ，各样品采
集时间均为 2011 年 8 ～ 9 月份。样品经广西中医药
研究院卢文杰教授鉴定，为玄参科鬼羽箭属植物黑
草(Buchnera cruciata Hamilt．)。
木犀草素对照品购于中国食品药品检定研究院
(批号为 111520 － 200201) ，芹菜素和香叶木素对照
品由广西中医药研究院卢文杰教授提供。
试剂:甲醇、乙腈均为色谱纯(美国 Fisher 公
司) ，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 色谱柱:Agilent Extend － C18(250
mm × 4. 6 mm，5 μm) ;流动相:乙腈(A)－ 0. 7%冰
醋酸(B) ，梯度洗脱(0 ～ 20 min:10% A→30% A;
20 ～ 40 min:30% A→75% A;40 ～ 60 min:75% A→
100%A) ;流速:1. 0 mL·min －1;检测波长:350 nm;
柱温:35 ℃;进样量:10 μL;理论板数以木犀草素峰
计不得少于 5000。
2. 2 供试品溶液的制备 取粉碎的药材约 1 g，精
密称定，再精密加入甲醇 50 mL，称定重量，放水浴上
回流 90 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重
量，混匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
2. 3 参照物溶液的配制 取木犀草素对照品 10
mg，精密称定，置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻
度，摇匀，即得。
2. 4 方法学考察
2. 4. 1 精密度试验 取 10 号药材干燥粉末约 1 g，
精密称定，按“2. 2”项下方法制备供试品溶液，按
“2. 1”项下色谱条件连续进样 6 次，记录色谱图，考
察仪器的精密度。结果表明，各色谱峰相对保留时
间的 RSD在 0. 03% ～0. 15%之间;各色谱峰相对峰
面积的 RSD在 0. 27% ～2. 39%之间，表明仪器的精
密度较好。
2. 4. 2 重复性试验 取 10 号药材粉末 6 份，每份
约 1 g，精密称定，按“2. 2”项下方法制备供试品溶
液，在“2. 1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，
考察方法的重复性。结果表明，6 份样品中各色谱
峰的相对保留时间的 RSD在 0. 05% ～0. 38%之间，
各色谱峰的相对峰面积的 RSD 在 0. 61% ～ 2. 73%
之间，表明重复性良好。
2. 4. 3 稳定性试验 取重复性试验项下一供试品
溶液，按“2. 1”项下色谱条件，分别在 0、4、8、12、24
h进行检测，考察供试品溶液的稳定性。结果表明，
各色谱峰的相对保留时间的 RSD 在 0. 01% ～
0. 05% 之间，各色谱峰的相对峰面积的 RSD 在
0. 33% ～ 1. 83% 之间，表明供试品溶液的稳定性
良好。
2. 4. 4 延长时间测试滞后峰 取重复性试验项下
一供试品溶液，按“2. 1”项下色谱条件进样分析，梯
度洗脱 120 min，记录色谱图。60 min后无其他色谱
峰出现。
2. 5 黑草指纹图谱的建立
2. 5. 1 各产地黑草药材的指纹图谱采集 取 10 批
不同产地的黑草药材粉末约 1 g，精密称定，按
“2. 2”项下方法制备供试品溶液，并按“2. 1”项下色
谱条件进行测定，记录 10 批次黑草药材的 HPLC 色
谱图，用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹
图谱相似度评价系统 A 版》计算机软件建立黑草
药材指纹图谱，黑草药材 HPLC 色谱图见图 1 和
图 2。
图 1 10 号黑草生药指纹图谱(S －木犀草素峰)
Fig 1 The typical fingerprint of sample 10 of B． cruciata(S － luteolin)
图 2 10 批不同产地黑草药材叠加图谱
Fig 2 HPLC overlapping chromatograms for ten beaches of B． cruciata
—524—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(3)
2. 5. 2 参照色谱峰的确定 本实验中的木犀草素
为黑草中已知主要成分，而且木犀草素所在指纹图
谱中的 S号峰保留时间适中，峰面积明显，故选用木
犀草素(S号峰)作为参照峰。
2. 5. 3 指纹图谱与共有峰的确定［8 － 11］采用《中药
色谱指纹图谱相似度评价系统 A版》计算机软件对
实验数据进行分析评价。根据软件使用手册，对指
纹图谱数据的相关参数进行自动匹配，标定出其共
有峰。并生成对照指纹图谱。
运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 A
版》计算机软件对指纹图谱数据分析，10 批次图谱
都匹配的色谱峰标定为共有指纹图谱峰。本文共标
定有 12 个共有指纹峰(图 1) ，其匹配数据见表 3，相
似度软件设置，选择 10 号黑草药材的 HPLC 图谱为
参照图谱，以平均数法作为生成对照指纹图谱的方
法，设定时间窗宽度为 0. 4 min ，软件自动匹配图
谱，系统根据黑草药材的共有模式，生成对照指纹图
谱为黑草指纹图谱。
本文选定以指纹图谱峰面积大，保留时间适中的
已知成分木犀草素 － S号峰为参照峰。以参照峰的保
留时间和峰面积作为 1，分别计算 10批黑草药材共有
指纹峰的相对保留时间和相对峰面积(见表 1、表 2)。
表 1 10 批黑草药材样品共有峰相对保留时间
Tab 1 Relative retention time of common peaks for ten batches of B． cruciata in fingerprints
峰号
(peak No．)
样品号(sample No．)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
RSD /%
1 0. 4565 0. 4559 0. 4581 0. 4555 0. 4583 0. 4555 0. 4553 0. 4552 0. 4565 0. 4566 0. 24
2 0. 5862 0. 5856 0. 5872 0. 5857 0. 5869 0. 5857 0. 5851 0. 5851 0. 5862 0. 5864 0. 12
3 0. 7162 0. 7156 0. 7163 0. 7162 0. 7161 0. 7162 0. 7153 0. 7151 0. 7162 0. 7163 0. 06
4 0. 7651 0. 7648 0. 7640 0. 7653 0. 7635 0. 7653 0. 7647 0. 7641 0. 7651 0. 7655 0. 08
S 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 0. 00
5 1. 0525 1. 0529 1. 0489 1. 0524 1. 0482 1. 0524 1. 0525 1. 0521 1. 0525 1. 0531 0. 16
6 1. 1668 1. 1677 1. 1644 1. 1671 1. 1646 1. 1671 1. 1676 1. 1676 1. 1668 1. 1671 0. 10
7 1. 2025 1. 2035 1. 1987 1. 2030 1. 1988 1. 2030 1. 2032 1. 2029 1. 2025 1. 2027 0. 15
8 1. 4632 1. 4641 1. 4563 1. 4638 1. 4576 1. 4638 1. 4639 1. 4637 1. 4632 1. 4638 0. 20
9 2. 2941 2. 2956 2. 2827 2. 2951 2. 2856 2. 2959 2. 2954 2. 2967 2. 2938 2. 2972 0. 21
10 2. 3528 2. 3547 2. 3419 2. 3548 2. 3448 2. 3548 2. 3543 2. 3561 2. 3528 2. 3531 0. 20
11 2. 4047 2. 4069 2. 3936 2. 4070 2. 3966 2. 4070 2. 4064 2. 4085 2. 4047 2. 4052 0. 20
表 2 10 批黑草药材样品共有峰相对峰面积
Tab 2 Relative areas of common peaks for ten batches of B． cruciata in fingerprints
峰号
(peak No．)
样品号(sample No．)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
RSD /%
1 0. 1278 0. 0505 0. 0531 0. 0295 0. 0597 0. 0295 0. 1165 0. 1087 0. 1278 0. 0479 53. 69
2 0. 7254 0. 8364 0. 4636 0. 4786 0. 4804 0. 4786 0. 5944 0. 4572 0. 7254 0. 4502 25. 06
3 0. 1425 0. 2777 0. 1069 0. 0904 0. 0979 0. 0904 0. 1006 0. 0774 0. 1425 0. 1149 46. 80
4 0. 1079 0. 2393 0. 1090 0. 1447 0. 0777 0. 1447 0. 0550 0. 0663 0. 1079 0. 0658 48. 98
S 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 0. 00
5 0. 0243 0. 0642 0. 0234 0. 0200 0. 0158 0. 0200 0. 0107 0. 0157 0. 0243 0. 0153 64. 31
6 0. 2840 0. 6450 0. 3260 0. 2591 0. 2310 0. 2591 0. 2590 0. 2964 0. 2840 0. 3784 37. 48
7 0. 0831 0. 1487 0. 0983 0. 1557 0. 0789 0. 1557 0. 0534 0. 0732 0. 0831 0. 0748 38. 02
8 0. 0194 0. 0462 0. 0248 0. 0319 0. 0172 0. 0319 0. 0109 0. 0170 0. 0194 0. 0179 43. 75
9 0. 0120 0. 0282 0. 0137 0. 0152 0. 0276 0. 0143 0. 0125 0. 0116 0. 0119 0. 0090 43. 02
10 0. 0264 0. 0653 0. 0369 0. 0361 0. 0605 0. 0361 0. 0262 0. 0239 0. 0264 0. 0183 43. 88
11 0. 0498 0. 1018 0. 0623 0. 0455 0. 0988 0. 0455 0. 0585 0. 0353 0. 0498 0. 0305 42. 04
2. 5. 4 共有峰的指认 利用对照品对照法对共有
峰进行指认，取木犀草素、芹菜素、香叶木素对照品，
配制成适量浓度的溶液，按照“2. 1”项下的色谱条
件，分别进样 10 μL，得出 3 种对照品的保留时间分
别与色谱图上 S峰、6 号峰、7 号峰保留时间一致;并
通过在线紫外吸收光谱对照，S 峰、6 号峰、7 号峰分
别与木犀草素、芹菜素、香叶木素对照品峰一致，由
此可以确定 S峰为木犀草素，6 号峰为芹菜素，7 号
—624— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(3)
为香叶木素。
2. 5. 5 黑草药材相似度评价 本文采用指纹图谱
相似度软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统
2004A版》计算。软件设置采用的对照图谱生成
法是平均值，时间窗是 0. 4 min，系统自动匹配。
黑草药材 HPLC 指纹图谱相似度计算结果见表
3。结果表明 10 批药材与对照指纹图谱的相似
度值均大于 0. 9，与对照指纹图谱有良好的相似
性，10 批不同产地黑草药材与对照图谱叠加图谱
见图 2。
表 3 黑草药材 HPLC指纹图谱相似度计算结果
Tab 3 Results of similarity analysis in fingerprints for ten batches of B． cruciata
编号
(serial number)
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
对照指纹图谱
(reference fingerprint)
S1 1. 000 0. 943 0. 967 0. 910 0. 982 0. 987 0. 832 0. 995 0. 996 0. 987 0. 982
S2 0. 943 1. 000 0. 963 0. 881 0. 946 0. 942 0. 918 0. 936 0. 951 0. 934 0. 963
S3 0. 967 0. 963 1. 000 0. 91 0. 995 0. 978 0. 943 0. 980 0. 979 0. 982 0. 994
S4 0. 910 0. 881 0. 910 1. 000 0. 908 0. 957 0. 799 0. 919 0. 933 0. 926 0. 941
S5 0. 982 0. 946 0. 995 0. 908 1. 000 0. 986 0. 908 0. 993 0. 989 0. 993 0. 994
S6 0. 987 0. 942 0. 978 0. 957 0. 986 1. 000 0. 862 0. 992 0. 996 0. 994 0. 994
S7 0. 832 0. 918 0. 943 0. 799 0. 908 0. 862 1. 000 0. 859 0. 858 0. 866 0. 909
S8 0. 995 0. 936 0. 98 0. 919 0. 993 0. 992 0. 859 1. 000 0. 997 0. 995 0. 990
S9 0. 996 0. 951 0. 979 0. 933 0. 989 0. 996 0. 858 0. 997 1. 000 0. 995 0. 993
S10 0. 987 0. 934 0. 982 0. 926 0. 993 0. 994 0. 866 0. 995 0. 995 1. 000 0. 991
S对* 0. 982 0. 963 0. 994 0. 941 0. 994 0. 994 0. 909 0. 990 0. 993 0. 991 1. 000
*“S对”(reference fingerprints)
3 讨论与分析
3. 1 检测波长的选择 利用 Agilent 1100 型高效液
相色谱仪，进行全波长扫描，本着指纹图谱的确认必
须遵循信息量最大化的原则，对 220 nm、254 nm、
280 nm、350 nm扫描的各波长下的色谱图进行分析
比较，结果在 350 nm处供试品的各色谱分离峰达到
基线分离，基线平稳，信息量最大［9］，故选定 350 nm
为检测波长。
3. 2 提取方法的选择 本实验对不同提取溶剂
(甲醇、50%甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯、氯仿) ，不同
提取时间段(15 min、30 min、60 min、120 min)和不
同的提取方法［超声提取(功率:2500 W，频率:
40 kHz)和回流提取］进行比较，结果发现，甲醇加
热回流 90 min 提取的供试品溶液，色谱峰数多，组
分含量高，信息较丰富。
3. 3 实验创新点 从黑草 10 批样品的高效液相色
谱指纹图谱中可以看出，不同产地黑草药材各色谱
峰的相对保留时间基本一致，所含成分基本相同，符
合指纹图谱的要求。本实验对黑草药材所建立的指
纹图谱，为黑草药材的质量控制提供参考，进而对
于其相应制剂的质量控制也会起积极的作用。
天然产物常因产地和生长年限不同，各成分含量
有一定的差异，在图谱中也可看出各色谱峰相对
峰面积有较大差异，说明有效成分的含量有较大
差别。
3. 4 实验的不足 本实验所测定的 10 批次黑草药
材样品中，有 9 批次是从广西各地采集的，只有 1 批
是从贵州(2 号样品)采集的，采集时间也较接近，故
得到的指纹图谱存在一定的局限性，只在一定程度
上代表了黑草药材指纹特征的代表性，应收集更多
地区的药材，获取更多信息，以更好地保证指纹图谱
的广泛性和代表性。
参考文献
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监督管理局)． Guangxi Zhuang Autonomous Region pieces of Chi-
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Ying(张 颖) ，et al． Research on Pharmacological Action of
Ethanol － extractive from Buchbera Cruciata Ham． (黑草醇提取物
的药理作用的研究)． J Guangxi Tradit Chin Med(广西中医药) ，
2012，35(1) :49
(下转第 438 页)
—724—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(3)
连翘苷的含量，结果均检出连翘酯苷 A 和连翘苷，
但浓度均较低，线性关系不佳，因此暂无法同时定量
测定。
3. 6 小结 本研究最初目的是为了通过测定连翘酯
苷 E的含量来反映痰热清注射液成品中连翘的质量
变化。当然，只测定 1 个成分，尚不足以反映连翘的
整体情况。本研究只是一种测定方法的初探，作者将
继续研究痰热清注射液中多成分的同时测定。
参考文献
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(本文于 2012 年 6 月 25 日收到)
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