全 文 ：中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2016, 47(11) · ·1454
银桔利咽含片是由金银花、肿节风、苦玄参、
桔梗、甘草、冰片和薄荷脑等制成的中药成方制剂，
具有疏风清热、解毒利咽的功效，临床用于改善急
性咽炎引起的咽痛、咽痒等症状。中国药典 2015
年版 (ChP 2015) 一部中将绿原酸 (1) 作为金银花
的质控指标，将异嗪皮啶 (2) 和迷迭香酸 (3) 作为
银桔利咽含片中绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸和苦玄参苷 IA 的
HPLC 波长切换法测定
唐德智
(广西南宁食品药品检验所，广西南宁 530021)
摘要：建立了高效液相色谱 -波长切换法测定银桔利咽含片中的绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸和苦玄参苷 IA。采用
Agilent TC-C18色谱柱，以乙腈 (A) ∶ 0.2％磷酸 (B) 为流动相，梯度洗脱，切换波长检测：327 nm(0～ 12 min) 测定绿原酸、
342 nm(12～ 25 min) 测定异嗪皮啶和迷迭香酸、264 nm(25～ 50 min) 测定苦玄参苷 IA。这 4个化合物分别在 6.0～
108.0、1.0～ 18.0、1.4～ 24.5和 0.9～ 16.6 g/ml浓度范围内线性关系良好，平均回收率分别为 99.85％、99.31％、
99.46％和 99.30％，RSD分别为 1.4％、1.6％、1.1％和 1.4％。
关键词：银桔利咽含片；绿原酸；异嗪皮啶；迷迭香酸；苦玄参苷 IA；高效液相色谱；含量测定
中图分类号：TQ460.7+2；O657.7+2 文献标志码：A 文章编号：1001-8255(2016)11-1454-03
DOI：10.16522/j.cnki.cjph.2016.11.024
收稿日期：2016-04-23
作者简介：唐德智(1974—)，男，副主任中药师，从事中药制剂质
量控制。
Tel：0771-3132340
E-mail：tangdz7497@163.com
Determination of Chlorogenic Acid, Isofraxidin, Rosmarinic Acid and
Picfeltarraenin IA in Yinjie Liyan Hanpian by Wavelength Switching-HPLC
TANG Dezhi
(Guangxi Nanning Institute for Food and Drug Control, Nanning 530021)
ABSTRACT: An HPLC method combined with wavelength switching technique was established for the
determination of chlorogenic acid, isofraxidin, rosmarinic acid and picfeltarraenin IA in Yinjie Liyan Hanpian. An Agilent
TC-C18 column was used, with the mobile phase of acetonitrile (A)∶0.2％ phosphoric acid (B) by gradient elution, at
the switching detection wavelength of 327 nm (0—12 min) for chlorogenic acid, 342 nm (12—25 min) for isofraxidin
and rosmarinic acid, 264 nm (25—50 min) for picfeltarraenin IA. The method was found to be linear for the above four
compounds in the ranges of 6.0—108.0, 1.0—18.0, 1.4—24.5 and 0.9—16.6 g/ml, respectively. Their average recoveries
were 99.85％, 99.31％, 99.46％ and 99.30％, with RSDs of 1.4％, 1.6％, 1.1％ and 1.4％, respectively.
Key Words: Yinjie Liyan Hanpian; chlorogenic acid; isofraxidin; rosmarinic acid; picfeltarraenin IA; HPLC; content
determination
肿节风的质控指标，将苦玄参苷 IA(4) 作为苦玄参
药材的质控指标。而现行质量标准仅测定肿节风中
的 2，不能全面反映其内在质量 [1]。本研究建立了
HPLC-波长切换法同时测定银桔利咽含片中的 1～
4，方法操作简便，重现性好，结果准确，可为银
桔利咽含片的质量控制提供参考。
1 仪器与试药
1200系列液相色谱仪，配有四元泵、自动进样器、
柱温箱、可变波长紫外检测器和色谱化学工作站 ( 美国
Agilent公司 )。
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1( 含 量 96.6 ％， 批 号 110753-201314)、2( 含 量
99.5％，批号 110837-201206)、3( 含量 98.8％，批号
111871-201203) 和 4( 含量 100％，批号 111745-200501) 对
照品均购自中国食品药品检定研究院；银桔利咽含片 (广
西万通制药有限公司，规格 0.7 g，批号 131010、140312、
140714、140812和 140915)；甲醇、乙腈和磷酸均为色谱纯，
水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 溶液配制
混合对照品贮备液：分别精密称取 1对照品
15 mg、2对照品 2.5 mg、3对照品 3.4 mg以及 4
对照品 2.3 mg，置同一 50 ml棕色量瓶中，加甲
醇溶解并定容，摇匀，即得浓度为 300、50、68和
46 g/ml的 1、2、3和 4对照品贮备液，避光保存。
供试品溶液：取本品 10片，研细，精密称取
细粉 2 g，置 25 ml棕色量瓶中，加 50％甲醇 20 ml，
超声处理 (500 W，33 kHz)30 min，放冷，用 50％
甲醇定容，摇匀，经微孔滤膜 (0.45 m) 过滤即得，
避光保存。
阴性样品溶液：按银桔利咽含片质量标准的处
方比例和制备工艺，分别制成不含金银花、肿节风
和不含苦玄参的阴性样品，按照供试品溶液制备方
法制备阴性样品溶液。
2.2 色谱条件
色谱柱 Agilent TC-C18柱 (4.6 mm×150 mm，
5 m ) ；流动相 乙腈 (A) ∶ 0.2％磷酸 (B)，梯度
洗脱；检测波长 0～ 12 min为 327 nm(1)、12～
25 min为 342 nm(2、3)、25～ 50 min为 264 nm
(4) ；流速 1.0 ml/min；柱温 30 ℃；进样量 10 l。
梯度洗脱程序见表 1。
表 1 梯度洗脱程序
Tab.1 Gradient Elution Procedure
t/min A/％ B/％
0 10 90
5 10 90
12 18 82
25 35 65
50 35 65
2.3 专属性试验
分别精密吸取供试品溶液、混合对照品贮备液
的稀释液 (精密吸取“2.1”项下混合对照品贮备液
5.0 ml，置 25 ml棕色量瓶中，用甲醇稀释定容，摇匀，
即得，浓度为 60、10、14和 9 g/ml)和阴性样品溶液，
分别进样，记录色谱图。结果显示，1～ 4分离完全，
阴性样品不干扰测定。色谱图见图 1。
2.4 线性试验、检测限 (LOD) 和定量限 (LOQ)
精密吸取“2.1”项下混合对照品贮备液 0.5、1.0、
3.0、5.0、7.0和 9.0 ml，分别置 25 ml棕色量瓶中，
用甲醇稀释定容，摇匀，制成系列浓度混合对照品
溶液。分别进样，测定峰面积。以浓度 c为横坐标，
峰面积 A为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。
LOD和 LOQ结果见表 2。
2.5 精密度、稳定性和重复性试验
精密吸取“2.4”项下中间浓度混合对照品溶液，
按“2.2”项下色谱条件，连续进样 6次，1～ 4峰
面积的 RSD分别为 1.1％、0.8％、1.2％和 0.9％。
取同批供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，
分别在 1、2、4、8、12和 24 h进样，测定峰面积，
1～ 4峰面积的 RSD分别为 1.5％、1.5％、1.7％和
1.4％，表明供试品溶液在 24 h内稳定。
取同批银桔利咽含片，按“2.1”项下方法制
备供试品溶液，共 6份，分别进样测定，结果样品
中 1的平均含量为 0.73 mg/g，RSD为 1.4％；2平
均含量为 0.12 mg/g，RSD为 1.5％；3平均含量为
0.16 mg/g，RSD为 1.4％；4平均含量为 0.11 mg/g，
RSD为 1.2％。
2.6 回收率试验
取已测定含量的银桔利咽含片 20片，研细，
精密称取 1 g，共 9份，置 25 ml棕色量瓶中，按
低、中、高剂量，分别精密加入混合对照品溶液
(含 1 0.15 mg/ml、2 0.02 mg/ml、3 0.03 mg/ml、4
0.02 mg/ml)4.0、5.0和 6.0 ml，各 3份，按“2.1”
项下方法制备供试品溶液，测定并计算回收率。
结果 1～ 4的平均回收率 (n=9) 分别为 99.85％、
99.31％、99.46％和 99.30％，RSD分别为 1.4％、
1.6％、1.1％和 1.4％。
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Ａ：对照品溶液，B：供试品溶液，C：缺金银花、肿节风阴性样品，D：缺苦玄参阴性样品
1-1；2-2；3-3；4-4
图 1 典型色谱图
Fig.1 Typical Chromatograms
表 2 1 ～ 4 的线性回归方程、LOD 和 LOQ
Tab.2 Linear Regression Equations of Compounds 1—4 and Their LODs & LOQs
成分 回归方程1) 线性范围/g·ml-1 LOD/g·ml-1 LOQ/g·ml-1
1 A=3.225×103c-8.39 6.0～108.0 0.015 0.049
2 A=2.885×103c-3.24 1.0～18.0 0.009 0.031
3 A=1.492×103c-6.69 1.4～24.5 0.009 0.032
4 A=6.97×102c-3.25 0.9～16.6 0.008 0.028
注：1)r>0.999
2.7 样品测定
取 5批银桔利咽含片，研细，精密称取 2 g，
各 3份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，分别
进样测定峰面积，代入“2.4”项下回归方程，计算
样品中 1～ 4的含量，结果见表 3。
表 3 样品测定结果 1)/mg·g-1
Tab. 3 Results of determination/mg·g-1
批号 1 2 3 4
131010 0.74(1.2) 0.15(1.3) 0.13(1.5) 0.12(1.4)
140312 0.69(1.3) 0.13(1.2) 0.15(1.2) 0.12(1.2)
140714 0.73(1.4) 0.12(1.5) 0.16(1.4) 0.11(1.2)
140812 0.68(1.5) 0.13(1.4) 0.16(1.3) 0.13(1.1)
140915 0.66(1.3) 0.11(1.3) 0.14(1.4) 0.12(0.9)
注：1) 括号内为 RSD(％，n=3)
3 讨论
检测波长的选择：取对照品溶液，在 200～
400 nm波长范围内进行 UV扫描，结果显示，1在
327 nm波长处有最大吸收，2、3在 342 nm波长处
有最大吸收。4在 264 nm波长有最大吸收。为了使
被检测成分更好地检出，利用 Agilent 1200型紫外
检测器可变波长功能，选择 327 nm为 1的检测波长，
342 nm为 2、3的检测波长，264 nm为 4的检测波长。
提取条件的确定：考察了供试品溶液的处理
方法。分别进行甲醇索氏提取、加热回流及超声振
荡提取的操作，结果表明，超声振荡提取效果较
好，故采用超声振荡法提取。再分别以乙醇、甲醇、
(下转第 1482页 )
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参考文献：
[1] USA FDA. Targeted drug development:why are many
diseases lagging behind? [EB/OL]. http://www.fda.gov/
AboutFDA/ReportsManualsForms/Reports/ucm454955.htm
2015.http://www.fda.gov/AboutFDA/ReportsManualsForms/
Reports/ucm454955. htm.
[2] Center for Health Policy. Breakthrough therapy designation:
exploring the qualifying criteria [EB/OL]. [2015-04-24].
http://www.fda.gov/downloads/AboutFDA/CentersOffices/
OfficeofMedicalProductsandTobacco/CDER/UCM447165.
pdf
[3] Center for Drug Evaluation and Research. Good review
practice: management of breakthrough Therapy-Designated
Drugs and Biologics [EB/OL]. [2016-03-11]. http://www.
fda.gov/downloads/AboutFDA/CentersOffi ces/Offi ceofMedi
calProductsandTobacco/CDER/ManualofPoliciesProcedures/
UCM407009.pdf
[4] Chabner BA. Early accelerated approval for highly targeted
cancer drugs [J]. N Engl J Med, 2011, 364(12): 1087—
1089.
[5] USA FDA. Driving biomedical innovation: Initiatives for
improving products for patients [EB/OL]. http://www.fda.
gov/AboutFDA/ReportsManualsForms/Reports/ucm274333.
htm
[6] Horning SJ, Haber DA, Selig WKD, et al. Developing
standards for breakthrough therapy designation in oncology
[J]. Clin Cancer Res, 19(16): 4297—4304.
[7] Food and Drug Administration Safety and Innovation Act [S].
3187, 2012.
[8] Center for Drug Evaluation and Research. Novel new drugs
2014 summary: January 2015 [EB/OL] . [2015-04-17] .
http://www.fda.gov/downloads/Drugs/DevelopmentApproval
Process/DrugInnovation/UCM430299.pdf
[9] USA FDA. Fast track designation request performance
[EB/OL]. [2015-04-17]. http://www.fda.gov/AboutFDA/
CentersOffi ces/Offi ceofMedicalProductsandTobacco/CBER/
ucm122932.htm
[10] USA FDA. Fast track approvals for drugs, 1998-2006
[EB/OL] . [2015-03-05] . http://www.fda.gov/Drugs/
DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelo
pedandApproved/DrugandBiologicApprovalReports/
NDAandBLAApprovalReports/ucm2007016.htm
(上接第 1456页 )
30％甲醇、50％甲醇和 70％甲醇作为提取溶剂，采
用超声振荡法提取供试品，并考察超声振荡时间。
结果表明，以 50％甲醇超声提取 30 min效果较好。
阴性样品溶液的制备：据报道，金银花药材
和肿节风药材中均含有 1[2]。因此按银桔利咽含片
的处方和制备工艺，制备缺金银花、肿节风的阴性
样品。
梯度洗脱条件的考察：参考 ChP 2015及相关
文献中 1～ 4的含量测定方法 [3—7]，采用等度洗脱
法，分离结果均不理想，故考虑采用梯度洗脱。分
别比较了甲醇∶ 1％冰乙酸、甲醇∶ 0.2％磷酸、乙
腈∶ 1％冰乙酸和乙腈∶ 0.2％磷酸等流动相系统，
结果显示采用乙腈∶ 0.2％磷酸为流动相，待测组
分出峰时间理想，分离效果和峰形均较好，故选用。
参考文献：
[1] 国家食品药品监督管理局 . 国家药品标准 WS-5320
(B-0320)-2012Z[S]. 2012.
[2] 姚志红 , 潘宇明 , 戴 毅 , 等 . 肿节风水提物及其市售制剂
的 HPLC特征图谱研究 [J]. 中草药 , 2010, 41(9): 1457—
1460.
[3] 肖小武 , 李婷婷 , 宁火华 , 等 . HPLC测定肿节风片中异秦
皮啶和迷迭香酸的含量 [J].中成药 , 2010, 32(7): 1145—
1147.
[4] 宁德生 , 方 宏 , 梁小燕 , 等 . 苦玄参苷类成分的积累动态
研究 [J]. 广西植物 , 2012, 32(1): 134—137.
[5] 石天松 . HPLC波长切换法同时测定消炎灵片中异嗪皮啶、
迷迭香酸和苦玄参苷 IA[J]. 中成药 , 2012, 34(6): 1077—
1080.
[6] 张新建 , 郭美华 , 马妍妍 , 等 . RP-HPLC法测定清炎滴
丸中苦玄参苷 IA的含量 [ J] . 中华中医药学刊 , 2014,
32(10): 2425—2427.
[7] 郑 娟 , 茅 纯 . HPLC波长切换法同时测定小儿咳喘灵颗
粒中 (R,S)-告依春、绿原酸和甘草苷的含量 [J] . 中国现
代应用药学 , 2015, 32(6): 727—731.