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脓性改变), JGFC有减轻子宫平滑肌增生程度 , 未见化脓性改
变 , 提示 JGFC除对子宫肌瘤有治疗作用外 ,还有一定程度的
抗炎作用。见表 2。
2.3　大鼠激素水平的比较　由表中结果得知:模型组与正常
组比较 , 大鼠血清中雌二醇的含量明显上升 , 而 JGFC有降低
雌二醇和黄体酮含量的趋势。由于模型组大鼠血清中黄体酮
的含量较正常组低 , 难以分析药物对黄体酮水平的影响 , 这可
能与大鼠的生理周期及外源注射黄体酮影响了内源性黄体酮
分泌的原因。见表 2。
表 2　4组大鼠子宫病理学和激素水平变化的比较(-x±s)
组别 数量 子宫平滑肌增生程度 雌二醇(pg/ml)孕酮(ng/mg)
正常组 10 4.4±0.89　 19.8±11.99　 12.74±8.90　
空白对照组 9 1.33±1.63　 25.75±9.89＊ 5.19±3.24　
米非司酮组 10 1.67±1.15　 25.3±18.04　 4.65±3.62　
JGFC 9 0.6±0.96　 19.07±6.68# 4.63±3.42#
　　与正常组比较 , ＊P<0.05,与空白对照组比较 , #P<0.05
3　讨论
何任 [ 1]认为妇人子宫肌瘤 “症之所以成 , 必因寒湿 ” 。
JGFC方中以桂枝辛甘而温 , 通利血脉 , 茯苓甘淡渗湿 ,且补正
气 , 2味共为君药 ,瘀久则化热 , 则有丹皮 、芍药凉血散血 , 化瘀
消症;桃仁性能破血 , 去瘀生新 , 共为臣佐;合而成方 , 寒温并
施 ,邪正兼顾 , 即为化瘀 ,消癥之平剂。现代医学认为:乳腺增
生 、子宫内膜异位症 、子宫肌瘤等病症与机体雌激素水平过高
而黄体酮拮抗不足密切相关 ,设法降低雌激素 、孕激素浓度是
治疗措施的首选 ,西医常采用米非司酮这一雌激素受体部分
激动剂与雌二醇竞争雌激素受体 , 从而达到减弱雌激素作用
的目的 [ 2 ～ 3] 。本次实验表明 , JGFC治疗组与米非司酮组能降
低大鼠子宫系数 、宫颈直径 、宫体直径 , 有统计学差异 , 减少子
宫平滑肌增生程度 , 降低雌二醇和黄体酮含量的趋势 , 提示
JGFC是治疗雌二醇和黄体酮水平异常升高致子宫肌瘤 、子宫
内膜异位症 、乳腺增生等症的有效药物。
参考文献:
[ 1]何任.金匮方百家医案评议 [ M] .杭州:浙江科学技术出版社 ,
1991.361～ 365.
[ 2]李家泰 .临床药理学 [ M] .第 2版 .北京:人民卫生出版
社 , 1999.813.
[ 3]朱会利 ,任凤和 .他莫昔芬治疗乳腺囊肿增生病 [ J] .新药与临
床 , 1997, 16(3):176.
(收稿日期:2007-07-30。)
紫丹活血片微生物检查方法学验证
解翠珠 , 李应芬
(云南省曲靖市食品药品检验所 , 云南 曲靖 655000)
　　摘　要:目的:建立紫丹活血片微生物限度检查标准方
法。方法:按《中国药典 》 2005版的有关要求 , 通过接种代表
性的阳性菌株 ,采用常规法 、薄膜过滤法 、稀释法进行方法学
验证。结果:常规法对金黄色葡萄球菌 、大肠杆菌 、黑曲霉菌
的回收率均高于 70%, 对枯草杆菌 、白色念珠菌的回收率均低
于 70%, 采用薄膜过滤法每筒冲洗 400ml(分 4次),可以消除
样品对枯草杆菌 、白色念珠菌的抗菌活性 ,使其正常生长;控
制菌检查采用稀释法进行检查。结论:本样品可以采用薄膜
过滤法及稀释法进行测定。
关键词:紫丹活血片;微生物限度检查;常规法;薄膜过滤
法;稀释法;冲洗量;方法学验证
中图分类号:R927.1 文献标识码:A
文章编号:1007-2349(2007)12-0034-02
紫丹活血片具有活血化瘀 , 理气止痛之功能 ,临床用于气
滞血瘀所致胸痹(冠心病心绞痛)、眩晕(脑动脉硬化)。当建
立药品的微生物限度检查法时 ,应进行方法的验证 ,以证明所
采用的方法适合于该药品的细菌 、霉菌及酵母菌数的测定及
控制菌检查 [ 1] 。按《中国药典》 2005版的有关要求 , 通过接种
代表性的阳性菌株 ,发现紫丹活血片具有抑菌活性 , 采用薄膜
过滤法 ,可以消除紫丹活血片抑菌活性 , 确定了薄膜过滤法的
最佳冲洗量和实验条件 ,建立了微生物限度检查方法。
1　仪器与材料
1.1　仪器　HTY-Ⅲ型智能集菌仪 , (杭州泰林医疗器械厂
生产;开放式一次性薄膜过滤器 , 北京牛牛基因技术有限公
司 ,批号:20051005)。
1.2　样品　紫丹活血片(云南天利药业有限公司生产 , 规格
0.4g/粒 , 批号 20060301)。
1.3　培养基　胆盐乳糖增培养基(批号 , 05222),玫瑰红钠琼
脂培养基(批号 , 030710), 营养琼脂培养基(批号 , 050328),改
良马丁琼脂培养基(批号 , 010315), 营养肉汤培养基(批号 ,
041010), PH7.0氯化钠 -蛋白胨缓冲液(批号 , 050217)
1.4　菌种 　大肠埃希菌 (Escherichiacoli)[ CMCC(F)
44102] 、枯草芽孢杆菌(Bacilussubtilis)[ CMCC(B)63 501] 、
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[ CMCC(B)26 003] 、
白色念珠菌(Candidaalbicans)[ CMCC(F)98 001] 、黑曲霉
(Aspergilusniger)[ CMCC(F)98 003] (中国药品生物制品检
定所提供)。
34 云 南 中 医 中 药 杂 志　　　　　　　　　　2007年第 28卷第 12期DOI :10.16254/j.cnki.53-1120/r.2007.12.026
2　方法验证
微生物限度检查的验证实验按中国药典 2005版微生物
限度检查法(附录Ⅺ J)[ 1]常规法和薄膜过滤法进行。
2.1　菌液制备　取上述经 34℃培养 18 ～ 24h的大肠埃希菌 、
金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物 1ml, 加入
9ml0.9%氯化钠溶液中 , 10倍稀释至 10-5 ～ 10 -7备用;取经
24℃培养 18 ～ 24h的白色念珠菌霉菌液体培养物 1ml, 加入
9ml0.9%氯化钠溶液中 , 10倍稀释至 10-5备用;取经培养一
周的黑曲霉菌斜面物 ,加 0.9%氯化钠溶液 3ml, 洗下孢子 , 转
移至另一空管 , 标准比浊后 , 取 1ml加入 0.9%氯化钠溶液中
10倍稀释至 10-4备用。
2.2　菌液的检验　取上述金黄色葡萄球菌 、枯草杆菌 、大肠
埃希菌 10-5 ～ 10-7稀释液各 1ml, 用 45℃营养琼脂培养基
20ml注皿 , 各平行测定两皿 , 30 ～ 35℃培养 48h, 计数 ,应约为
50 ～ 100cfu/ml;取上述白色念珠菌 10-5 ～ 10-6稀释液及上述
黑曲霉菌 10～ 4孢子悬液各 1ml, 用 45℃琥红琼脂培养基 20ml
注皿 , 各平行测定两皿 , 23 ～ 28℃培养 , 逐日观察计数 ,应约为
50 ～ 100cfu/ml。结果见表 1。
表 1　实验用菌液检验(菌落计数结果) (cfu/ml)
实验方法 金葡菌 10-6 枯草杆菌 10-5 白色念珠菌 10-5 黑曲霉 10-4 大肠杆菌 10-6
常规法 80、 80 67、 64 74、 77 60、 81 41、 52
薄膜过滤法 / 98、 96 142 / /
　　注:表中(/)常规法已通过
2.3　供试液制备　取样品 10g, 加 pH7.0无菌氯化钠 -蛋白
胨缓冲液 100ml, 混匀 , 取适量 3000转 /分离心 10min作为
1∶10的供试液 。
2.4　回收率的测定
2.4.1　细菌数霉菌数常规法测定　试验组:取 1∶10供试液
1ml、50 ～ 100cfu试验菌同时加入平皿中 , 立即倾注琼脂培养
基 , 待凝固后 ,置规定温度培养 24 ～ 72h逐日观察结果 。菌液
组:测定每一菌株所加的试验菌数(同菌液检验)。 供试品对
照组:取 1∶10供试液 1ml加入平皿中 , 立即倾注琼脂培养
基 , 待凝固后 ,置规定温度培养 24 ～ 72h逐日观察结果 , 测定
供试品本底菌数。
2.4.2　细菌数薄膜过滤法测定　取 1∶10的供试液 1ml, 注
入开放式滤器(先用少量缓冲液润湿滤器),用 pH7.0无菌氯
化钠 -蛋白胨缓冲液冲洗滤膜 , 每次 100ml共 4次(总冲洗
400ml),加 1ml(50 ～ 100cfu)试验菌 , 抽干后 , 取出滤膜菌面朝
上贴入规定琼脂平板培养基中 , 置规定温度培养 48h, 结果见
表 2。
表 2　细菌 、霉菌及酵母菌计数方法的验证回收率测定结果(%)
实验方法 金葡菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 大肠杆菌
常规法 72.5 5.3 3.2 100.0 76.7
薄膜过滤法 / 100.0 100.0 / /
　　注:表中(/)常规法已通过
2.5　回收率的计算　按如下公式计算试验组的加菌回收率:
回收率 =(试验组 -供试品对照组)÷菌液组 ×100%
2.6　控制菌检查方法的验证
2.6.1　常规法　取 1∶10供试液 10ml加入 100ml胆盐乳糖
培养基中 ,同时加入上述大肠埃希菌液 1ml, 置 35℃培养 24h;
取稀释液 10ml加入 100ml胆盐乳糖培养基 , 置 35℃培养 24h,
作为阴性对照;取 1∶10供试液 10ml加入 100ml胆盐乳糖培
养基中 ,同时加入上述金黄色葡萄球菌液 1ml, 置 35℃培养
24h,作为阴性菌对照组。另取 1∶10供试液 1ml加入 10ml胆
盐乳糖发酵培养基中 , 同时加入上述大肠埃希菌液 1ml, 置
35℃培养 24h;取稀释液 1ml加入 10ml胆盐乳糖发酵培养基
中置 35℃培养 24h, 作为阴性对照;取 1∶10供试液 1ml加入
10ml胆盐乳糖发酵培养基中 , 同时加入上述金黄色葡萄球菌
液 1ml, 置 35℃培养 24h, 作为阴性菌对照组。
2.6.2　稀释法　取 1∶10供试液 10ml加入 200ml胆盐乳糖
培养基中 ,同时加入上述大肠埃希菌液 1ml, 置 35℃培养 24h;
取稀释液 10ml加入 200ml胆盐乳糖培养基 , 置 35℃培养 24h,
作为阴性对照;取 1∶10供试液 10ml加入 200ml胆盐乳糖培
养基中 ,同时加入上述金黄色葡萄球菌液 1ml, 置 35℃培养
24h,作为阴性菌对照组。
3　结果
从表 2结果可以看出:该供试品接种 5株阳性试验菌株 ,
常规法对枯草杆菌 、白色念珠菌回收率均低于 70%, 对大肠埃
希菌 、金黄色葡萄球菌 、黑曲霉菌回收率均高于 70%;薄膜过
滤法对枯草杆菌 、白色念珠菌回收率均高于 70%。说明该样
品具有抑菌活性 , 细菌数 、霉菌数 、酵母菌均需采用薄膜过滤
法进行测定。见表 3。
表 3　控制菌的检查结果
实验方法 大肠埃希菌 大肠菌群 阴性菌对照组
常规法 - + -
稀释法 + + -
4　结论
从表 2 ～ 3结果可以看出 , 通过接种 5株阳性试验菌株 ,
经方法学验证 , 细菌数 、霉菌数 、酵母菌均需采用薄膜过滤法
进行测定;控制菌大肠埃希菌需采用稀释法进行检查。
参考文献:
[ 1]国家药典委员会.中华人民共和国药典 [ M].北京:化学工业出
版社.2005.94.
(收稿日期:2007-06-21。)
352007年第 28卷第 12期 　　　　　　　　　　云 南 中 医 中 药 杂 志