全 文 ：第 33 卷 第 10 期
2014 年 10 月
分析测试学报
FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis)
Vol. 33 No. 10
1199 ～ 1203
收稿日期:2014 － 05 － 15;修回日期:2014 － 06 － 28
基金项目:广州市应用基础研究计划重点项目(2011J4100058) ;高等学校博士点基金项目(20104425110014)
* 通讯作者:胡英杰，博士，研究员，研究方向:中药新药研发，Tel:020 － 36585143，E － mail:yingjiehu@ gzucm. edu. cn
doi:10. 3969 / j. issn. 1004 －4957. 2014. 10. 018
通光散总苷的肿瘤细胞化疗增敏活性
与质量控制方法研究
吴斯东，朱瑞静，沈小玲，胡英杰*
(广州中医药大学 热带医学研究所 中药新药发现实验室，广东 广州 510405)
摘 要:中药通光散(Marsdenia tenacissima)用于肿瘤治疗，研究其抗肿瘤或肿瘤化疗增敏活性提取物具有重
要意义。研究发现，浓度为 10 μg /mL的通光散总苷对白血病 K562、宫颈癌 HeLa、肝癌 HepG2、口腔上皮癌
KB-3-1 4 种人类肿瘤细胞的生长无影响，细胞活力均达到 98%以上，以此为工作浓度联用紫杉醇处理肿瘤细
胞，发现与单用紫杉醇组相比，联用后能够显著增强紫杉醇的体外抗肿瘤作用。对活性提取物开展的分析方
法研究中，选择 6 种通光散苷元乙衍生物单体(化合物 1 ～ 6)作为专属性对照品，采用 Phenomenex Luna C18色
谱柱，在 230 nm下以甲醇 － 0. 1%乙酸水进行梯度洗脱，获得了对通光散总苷中 25 个成分的良好色谱分离，
以及对 6 种专属性指标成分的辨识;在色谱图中指标成分 1 ～ 6 的色谱峰面积之和为可检测成分总峰面积的
43. 39%。同时建立了通光散总苷中专属性指标成分 1 的含量测定方法。所得方法的峰面积精度、含量测定
重现性、样品稳定性等数据的相对标准偏差(ＲSD)为 0. 16%～ 0. 55%，样品测定的线性范围为 0. 86 ～ 6. 45
μg，方法回收率为 100. 4% ± 1. 2%;测得指标成分 1 的含量为 0. 74%。
关键词:通光散;总苷;通光散苷元乙酯类衍生物;高效液相色谱;化疗增敏
中图分类号:O657. 72;TQ460. 72 文献标识码:A 文章编号:1004 － 4957(2014)10 － 1199 － 05
HPLC Assays of Total Glycosides Extracted from Marsdenia tenacissima
with Chemosensitive Effect
WU Si-dong，ZHU Ｒui-jing，SHEN Xiao-ling，HU Ying-jie*
(Laboratory of Chinese Herbal Drug Discovery，Tropical Medicine Institute，Guangzhou
University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China)
Abstract:Chinese materia medica Tong-Guang-San(Marsdenia tenacissima)is used for treatment of
cancer． Developing a bioactive fraction from this plant with optimized components as antitumor agent
or chemosensitizer is of great importance． This paper reports results of methodological research for
quality control of extract of total glycosides(ETG) ，a chemosensitive fraction screened out． In our
study，ETG at the concentration of 10 μg /mL did not affect the growth of human leukemia cell line K562，
human cervical carcinoma cell line HeLa，human hepatoma cell line HepG2 and human oral epidermoid
carcinoma cell line KB-3-1(Cell viability ＞ 98%)，but when 10 μg /mL ETG was used in combination
with paclitaxel，the cytoxicity of paclitaxel against above tumor cells was significantly increased． By em-
ploying a Phenomenex Luna C18 column as stationary phase，methanol － 0. 1% HAc as mobile phase for
gradient elution，and 6 ester derivatives of tenacigenin B(1 －6)as reference markers，an HPLC method
was used for the qualitative analysis of ETG，with well separation of 25 components and identification of
the 6 structurally characteristic markers． The summed peak area for 1 －6 accounted for 43. 39% of the to-
tal peak area． The quantitative analysis of reference 1 was also completed，with relative standard devia-
tions(ＲSD)for peak area，repeatability of measured concentration and stability of sample within 0. 16% －
0. 55%，linear range of 0. 86 －6. 45 μg，and recoveries of 100. 4% ±1. 2%． The method was applied in
the determination of total glycosides of Marsdenia tenacissima with reference 1 amount of 0. 74%．
分析测试学报 第 33 卷
Key words:Marsdenia tenacissima;total glycosides;tenacigenin B ester derivative;HPLC;che-
mosensitivity
通光散(Marsdenia tenacissima)是萝藦科牛奶菜属植物，又名乌骨藤，主要分布于我国西南各省。
通光散干燥藤茎为中药材，收载于中国药典 2010 年版［1］。民间多用于治疗肿瘤等疾病［2］。以通光散水
提取物为原料的中药注射剂 “消癌平”已被批准用于肿瘤化疗［3 － 4］。通光散的化学成分迄今已有较多
报道，C21甾体类物质是其主要的生理活性物质
［5］。本课题组在国际上首次报道了其中具有逆转肿瘤多
药耐药(MDＲ)作用、有助于耐药肿瘤治疗的通光散苷元乙(Tenacigenin B)脂溶性衍生物［6］。一方面，
通光散中究竟是水溶性成分还是脂溶性化合物具有确切的体内外抗肿瘤活性，或者体内外增效肿瘤化
疗药物的作用?亟待研究澄清。另一方面，由于该药材含有多种化学结构和理化性质均很近似的 C21甾
体去氧糖苷和苷元［7］，单体成分分离得率不高，研究通光散的适宜提取物作为有效部位进行抗肿瘤药
物或肿瘤化疗增敏药物开发具有重要意义;在药物的可行性研究中，有效性与质量可控性是重要的前
提性条件。通光散主要的化学成分 C21甾体去氧糖苷及游离苷元富含于总苷部位。为此，本文首次报道了
通关散总苷单独或联合紫杉醇对多种人源性肿瘤细胞株的体外抗肿瘤作用。研究结果表明总苷在 100 μg /
mL及以下浓度无明显体外抗肿瘤作用;在低至 10 μg /mL的工作浓度下能增敏紫杉醇(Taxol)的体外抗肿
瘤作用。在此基础上，本文针对通光散总苷建立了基于特征指标成分群的 HPLC定性定量分析方法。
1 实验部分
1. 1 仪器、试剂与材料
Dionex高效液相色谱仪，配置 PDA-100、UVD-170U、ELSD检测器及 Chromeleon色谱工作站(美国
戴安公司) ，BS224S型电子分析天平(德国 Sartorius公司) ，甲醇、乙腈、异丙醇(色谱纯，德国 Merck
公司) ，色谱用水由利迪超纯水机(中国)制备，有机溶剂和化学试剂为国产分析纯。通光散对照品
11α-O-Tigloyl-12β-O-acetyl-tenacigenin B(1) ，11α，12β-di-O-Tigloyl-tenacigenin B(2) ，11α-O-2-Methyl-
butanoyl-12β-O-tigloyl-tenacigenin B(3) ，11α-O-(2-Methylbutanoyl)-12β-O-benzoyl- tenacigenin B(4) ，Te-
nacissimoside A(5)和 Marsdenoside C(6)由笔者分离，并通过波谱分析鉴定结构;纯度经 HPLC 面积归
一化法检测，含量均大于 98. 5%。人源性肝癌细胞株 HepG2、白血病细胞株 K562 购于中国科学院上
海细胞库，人口腔上皮癌细胞系 KB-3-1 和人宫颈癌细胞系 HeLa 由香港浸会大学 Tse A. K. 博士馈赠。
研究用植物材料于 2011 年 10 月采自云南省蒙自市，经中国科学院华南植物园植物分类学王发国博士
鉴定为通光散 ［Marsdenia tenacissima(Ｒoxb. )Wight et Arn. ］。
1. 2 通光散总苷的制备
通光散藤茎粉碎成粗粉，取 500 g，加 10 倍量的 80%乙醇加热回流提取 3 次，每次 2 h，合并乙醇
提取液，减压浓缩至流浸膏，加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取各 3 次，分取有机相，减压浓
缩，得到乙酸乙酯浸膏，真空干燥至恒重(5. 75 g) ，得率为 1. 15%。定性反应:乙酸乙酯浸膏的
Liebermann － Burchard反应和 Keller － Kiniani反应分别呈污绿色和深紫 －蓝色，均为阳性，提示含有孕
甾烷衍生物 2-去氧糖苷［8］。
1. 3 通光散总苷体外对肿瘤细胞增殖及紫杉醇抗肿瘤作用的影响
K562、HeLa和 HepG2 细胞维持在含 10% 小牛血清(FBS) (Gibco，BＲL，NY，USA)的 ＲPMI 1640
培养基(Gibco)中;KB-3-1 细胞在添加了 10% FBS的 DMEM培养基(Gibco)中于 37 ℃、饱和湿度、含
5% CO2 条件下培养。为检查紫杉醇(Sigma，USA)单独或联用通光散总苷对细胞活力的影响，在 96 孔
板上每孔加含 1 × 104 个细胞的 100 μL细胞悬液，培养 24 h，再与不同浓度的紫杉醇或联用 10 μg /mL
通光散总苷的不同浓度紫杉醇共孵育 48 h，以 CCK-8 试剂盒(Dojindo Laboratorise，Japan)测定细胞活
力。以能够抑制 50%细胞活力的紫杉醇浓度为半数抑制浓度(IC50)评估体外抗肿瘤活性
［9］。CCK-8 法
操作过程:每孔细胞培养液加 10 μL 的 CCK-8，37 ℃培养 2 h，于 450 nm 用酶标仪读取 OD 值并作空
白校正。比较联用通光散总苷的紫杉醇组与不含通光散总苷的紫杉醇组的细胞活力。
1. 4 通光散总苷中特征指标成分的 HPLC定性分析条件
以一组通光散苷元 B的酯类衍生物作为特征指标成分群，建立总苷的 HPLC 定性分析方法。所选
0021
第 10 期 吴斯东等:通光散总苷的肿瘤细胞化疗增敏活性与质量控制方法研究
指标成分群由笔者从通光散中分离纯化，通过测定 NMＲ，MS 等波谱学数据并与文献分析对照，鉴定
化学结构。选用的单体成分为 11α-O-Tigloyl-12β-O-acetyl-tenacigenin B(1)［10］，11α，12β-di-O-Tigloyl-te-
nacigenin B (2)［11］，11α-O-2-Methylbutanoyl-12β-O-tigloyl-tenacigenin B (3)［10］，11α-O-(2-Methylbu-
tanoyl)-12β-O-benzoyl-tenacigenin B(4)［10］，Tenacissimoside A(5)［12］和 Marsdenoside C(6)［13］。
色谱条件:Phenomenex Luna C18色谱柱(4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，柱温 30 ℃，检测波长 230
nm，流动相:甲醇(A)－ 0. 1%乙酸水(B) ，流速 1 mL /min。梯度洗脱:0 ～ 32 min，42% ～ 37% B;
32 ～ 37 min，37%～35% B;37 ～ 45 min，35% B;45 ～ 60 min，35%～32% B;60 ～ 80 min，32%～ 30%
B;80 ～ 110 min，30%～15% B。
对照品溶液:取对照品化合物 1 ～ 6 适量，分别加甲醇配制成浓度为 0. 48，0. 42，0. 49，0. 28，
0. 37，0. 32 mg /mL的混合标准品溶液。总苷样品供试液:取通光散总苷适量，精密称定，加甲醇配制
成浓度为 14. 21 mg /mL的样品溶液。
1. 5 通光散总苷中特征指标成分的 HPLC定量测定条件
色谱条件:Phenomenex Luna C18色谱柱(4. 6 mm ×250 mm，5 μm) ，柱温 30 ℃，检测波长 230 nm，
流动相为甲醇 － 0. 1%乙酸水(63 ∶ 37) ，流速 1 mL /min。
对照品储备液:取通光散对照化合物 1 适量，精密称定，加甲醇配制成 1. 075 mg /mL 的储备液。
供试品溶液:取通光散总苷粉末适量，精密称定，加甲醇制成浓度为 1. 420 mg /mL的供试液。
表 1 紫杉醇在人肿瘤细胞系的 IC50值
Table 1 IC50 data of paclitaxe in human cancer cell lines
ρ /(ng·mL －1)
Group
Cancer cell line
K562 HeLa HepG2 KB-3-1
Taxol(Control) 4. 8 ± 0. 4 17. 1 ± 4. 1 67. 2 ± 12. 3 8. 1 ± 1. 3
Taxol + 10 μg /mL ETG 3. 8 ± 0. 2* 9. 2 ± 2. 0* 20. 2 ± 5. 1＊＊ 5. 4 ± 1. 7
data were expressed as Mean ± SD of three independent experiments;* P ＜ 0. 05
and ＊＊P ＜ 0. 01 compared to control by One-Way ANOVA
2 结果与讨论
2. 1 通光散总苷体外对肿瘤细胞增殖及紫杉醇抗肿瘤作用的影响
测试了通光散总苷单独或与紫杉醇联合，对人白血病 K562、宫颈癌 HeLa、肝癌 HepG2、口腔上
皮癌 KB-3-1 细胞增殖的影响。结果发现，通光散总苷对 4 种细胞株的细胞毒活性均很弱(IC50 ＞ 100
μg /mL) ，说明没有明显的体外抗肿瘤作用。在 10 μg /mL 的总苷浓度下，4 种肿瘤细胞的细胞活力仍
达到 98%以上，故选择 10 μg /mL 作为工
作浓度考察其对紫杉醇细胞毒性的影响，
结果见表 1。结果可见，联用通光散总苷
的紫杉醇的 IC50值在 KB-3-1 细胞中得到明
显下降，在其余 3 种细胞中得到了显著降
低。说明通光散总苷在无细胞毒性浓度下
可增敏紫杉醇对人白血病 K562、宫颈癌
HeLa、肝癌 HepG2、口腔上皮癌 KB-3-1
细胞的体外抗肿瘤活性。
2. 2 通光散总苷特征指标成分群的 HPLC定性分析
在“1. 4”色谱条件下，特征指标及其他成分的色谱峰分离良好，如图 1 所示。指标化合物 1 ～ 6
的峰面积之和占 25 个可检出成分峰面积总和的 43. 39%。实验结果表明，可用 HPLC 色谱辨识多种通
光散专属性指标成分的存在与否，以此作为药物活性部位———通光散总苷的定性分析依据。
图 1 通光散对照品(A)和总苷(B)的 HPLC图
Fig. 1 HPLC chromatograms of reference compound(A)and the extract of total glycoside(B)
A． 1 －6 denoted reference compounds 1－6，respectively(峰1 ～6表示通光散对照化合物1～6);B． 1 －25 denoted
components 1 －25 of the extract of total glycoside，respectively，in which 1 －6 were reference compounds
1－6(1 ～25为总苷成分1 ～25，其中1～6为对照品1～6)
1021
分析测试学报 第 33 卷
2. 3 通光散总苷特征指标成分的 HPLC定量分析
在“1. 5”色谱条件下，通光散对照化合物 1 的色谱峰分离良好(见图 2)。
图 2 通光散对照品和总苷的 HPLC图
Fig. 2 HPLC chromatograms of reference compound and the extract of total glycoside
A． reference compound;B． the extract of total glycoside;1． reference compound 1
2. 3. 1 线性关系 分别取对照品 1 储备液 0. 4，0. 6，0. 8，1，2，3 mL置于 10 mL容量瓶中，加甲醇
至刻度(浓度依次为 0. 043 0，0. 064 5，0. 086 0，0. 107 5，0. 215 0，0. 322 5 mg /mL)。依次精密吸取
20 μL，按色谱条件进样，测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标，对照品浓度为横坐标绘制标
准曲线。结果显示，化合物 1 在 0. 86 ～ 6. 45 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，其线性方
程为:Y = 278. 14X + 1. 067 9，r2 = 0. 999 9。
2. 3. 2 精密度、重复性与稳定性实验 精密吸取对照品溶液 20 μL，按上述色谱条件分别连续进样 6
次，测得峰面积积分的均值为 30. 260 3，ＲSD为 0. 55%，说明该方法精密度良好。
取通光散总苷粉末 6 份，每份约 14 mg，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别进行
测定，测得总苷中化合物 1 的平均含量为 0. 742 3%，ＲSD为 0. 16%。表明方法的重复性良好。
取供试品溶液于 0，2，4，6，8，12 h进样，测得峰面积积分的均值为 30. 377 4，ＲSD为 0. 21%，
表明样品溶液在 12 h内稳定。
2. 3. 3 回收率实验 取已测含量的通光散总苷粉末 9 份，精密称定，分为 3 组，分别精密加入已知含
量 1. 3，1. 0，0. 8 倍的对照品，依法制备供试品溶液，分别进行测定，计算回收率(结果见表 2)。测
得平均加标回收率为 100. 4%，ＲSD为 1. 2%。
表 2 通光散总苷中化合物 1 的回收率试验(n = 9)
Table 2 Ｒecoveries of compound 1 in the extract of total glycoside(n = 9)
No．
Sample amount
m /mg
Content
m /mg
Added
m /mg
Measured
m /mg
Ｒecovery
Ｒ /%
Mean recovery
珔Ｒ /%
ＲSD
sr /%
1 140. 7 1. 04 1. 33 2. 38 100. 4 100. 4 1. 2
2 141. 0 1. 05 1. 36 2. 39 99. 1
3 140. 8 1. 04 1. 33 2. 38 100. 5
4 142. 0 1. 05 1. 03 2. 08 99. 6
5 142. 0 1. 05 1. 06 2. 12 100. 9
6 143. 2 1. 06 1. 09 2. 17 101. 8
7 143. 1 1. 06 0. 88 1. 93 98. 4
8 144. 0 1. 07 0. 90 1. 98 101. 7
9 141. 3 1. 05 0. 85 1. 91 101. 2
2. 3. 4 实际样品的测定 取通光散总苷 3 份，按供试品溶液制备方法制备供试品，精密吸取对照品和
供试品各 20 μL，按色谱条件进样，外标一点法计算化合物 1 的含量。测得总苷样品中化合物 1 的平均
含量为 0. 74%。
3 结 论
本文首次确定了中药材通光散的总苷部位对紫杉醇有明显的体外抗肿瘤增效作用，为该部位作为
肿瘤化疗增效剂药物的进一步研发提供了初步药效学数据。同时，在确定通光散总苷体外化疗增效活
性的基础上，建立了其化学组成的 HPLC 定性分析方法，以包括 11α-O-Tigloyl-12β-O-acetyl-tenacigenin
B在内的 6 种通光散苷元乙酯类衍生物专属性指标成分的保留时间为依据，通过优化的梯度洗脱条件
辨识了包括 6 种指标成分在内的 20 多种化学成分;同时完成了通光散总苷中 1 种专属性指标成分含量
2021
第 10 期 吴斯东等:通光散总苷的肿瘤细胞化疗增敏活性与质量控制方法研究
测定的方法学研究。所建立的定性定量分析方法可用于通光散化疗增效活性部位通光散总苷的质量
控制。
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