全 文 ：收稿日期:2008-02-18;　修订日期:2008-08-16
作者简介:彭　亮(1980-),男(汉族),四川西昌人 ,现任江西科技师范学
院药学院讲师 , 博士学位 , 主要从事天然产物药效成分的研究与开发
工作.
紫萍提取物对过氧化氢
诱导内皮细胞氧化损伤的保护作用研究
彭　亮 , 李知敏
(江西科技师范学院 ·药学院 ,江西 南昌　330013)
摘要:目的 研究紫萍提取物是否具有保护内皮细胞免受过氧化氢损伤的作用。方法 采用 MTT比色法筛选紫萍提取物
作用于内皮细胞的安全剂量 ,建立 H2O2对内皮细胞的氧化损伤模型 , 并研究紫萍提取物的保护作用。最后采用检测试
剂盒方法分析紫萍提取物作用后内皮细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-
Px)的活性变化。结果 紫萍提取物的浓度 <100μg/ml,作用时间为 24 h时 ,无明显细胞毒性 。以 1 mmol/L的 H2O2作
用于 ECV-304细胞 1h造氧化损伤模型 , 10, 25, 50 μg/ml的紫萍提取物具有预防氧化损伤作用 , 可使细胞的存活率由
21.98%分别上升至 37.49%, 51.71%和 64.74%, 其机理可能是紫萍提取物能够剂量依赖性的增强 SOD, CAT和 GSH-
Px等酶的活性。但是紫萍提取物无治疗氧化损伤的作用。结论 紫萍提取物可以有效保护内皮细胞免受氧化损伤。
关键词:紫萍;　氧化损伤;　过氧化氢;　超氧化物歧化酶;　过氧化氢酶;　谷胱甘肽过氧化物酶
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)04-0996-03
TheProtectiveEffectofSpirodelapolyrrhiza(L.)SchleidExtractonECV-304 Injury
InducedbyHydrogenPeroxide
PENGLiang, LIZhi-min
(SchoolofPharmacology, JiangxiNormalUniversityofScience＆ Technology, Nanchang, Jiangxi330013,
China)
Abstract:ObjectiveTostudytheprotectiveefectofSpirodelapolyrrhiza(L.)Schleidextract(SE)againstthedamagecaused
byhydrogenperoxide(H2O2)inhumanvascularendothelialcels(ECV-304).MethodsNormalECV-304 cellswererespec-tivelyincubatedwithSE5～ 400μg/mfor24h-96h, orH2O2 0.125～ 10 mmol/Lfor1 ～ 24 h, thesurvivalrateofcelswasde-terminedbytetrazoliumassay(MTT).ToevaluatetheprotectiveefectofSEonECV-304injuryinducedbyH2O2 , ECV-304wasdividedintocontrol, model, andSEtreatmentgroups.InSEtreatmentgroup, ECV-304 wasincubatedwithSE5 ～ 50μg/
mlfor24h, beforeorafterH2O2 1mmol/L(finalconcentration)wasaddedtoECV-304inthemodelgroupandtheSEtreatmentgroupfor1 h.ThesurvivalconditionsofECV-304wereexpressedbytheODvaluesassessedbyMTTassay.Furthermore, the
activitiesofSOD, CATandGSH-PxinECV-304celstreatedwith10 ～ 50μg/mlSEweredeterminedbythecorespondingas-
saykits.Results 5, 10, 25, 50 μg/mlSEhadnosignificantcytotoxicityonECV-304at24 h, but100μg/ml, 200 μg/ml, and
400μg/mlSEmarkedlydecreasedthesurvivalrateat24h.TheviabilityofECV-304 wassignificantlyinhibitedby1 mmol/L
H2O2 at1h.Pretreatedwith10, 25, 50 μg/mlSE, thesurvivalrateandtheactivitiesofSOD, CATandGSH-Pxincelswereincreasedinaconcentration-dependentmanner.ButSEhadnoprotectiononECV-304 injuryinducedbyH2O2.ConclusionSEhasdualefectsonthesurvivalrateofECV-304 invitro, whichisrelatedtotheconcentration.Pretreatment
with10 ～ 50 μg/mlSEcanprotectECV-304 againstH2O2 injury.Keywords:Spirodelapolyrrhiza(L.)Schleid;　Hydrogenperoxide;　SOD;　CAT;　GSH-Px
　　血管内皮细胞(vascularendothelialcel, VEC)是介于血液与
血管壁之间的屏障 , 在创伤修复 、血管生成 、止血 、血栓形成 、出血
性疾病 、动脉粥样硬化 、糖尿病等一系列生理和病理过程中起着
重要作用。一旦内皮细胞受到损伤 , 则会导致血管屏障功能的损
害 , 从而引发动脉粥样硬化 、高血压病等多种心血管疾病的发生。
导致 VEC受损的原因很多 , 生物体内各种氧化 -还原反应产生
的羟基自由基(· OH)、超氧阴离子(O-2 · )、过氧化氢(H2O2)等
自由基(Reactiveoxygenspecies, ROS)的累积是其中之一 [ 1～ 3] 。
血管内皮细胞功能性障碍的发生既可能是心脑血管疾病发病的
始动环节 , 又可作为病情的观察指标和治疗学手段改进的突破
口。因此 , 内皮细胞被认为是心 、脑血管疾病基因治疗中最佳的
靶细胞。选择血管内皮细胞作为研究的突破口既是可行的 ,亦符
合未来发展方向 , 同时随着血管内皮细胞培养手段的成熟 , 内皮
细胞为治疗心血管疾病药物的筛选和药理研究提供了新的实验
材料 , 为在细胞水平进行心血管疾病相关药物的药理研究提供了
可能。
紫萍Spirodelapolyrrhiza(L.)Schleid为浮萍科紫萍属植物的
全草 , 辛 、寒 , 入肺经 ,有祛风 、发汗利尿 、消肿 、行水 、清热 、解毒的
功效 , 中医用于治疗荨麻疹 、急性肾炎等 [ 4] 。紫萍中除了含有蛋
白质 、β -胡萝卜素 、脂类化合物等物质外 ,还含有芹菜素(apige-
nin)、木犀草素(luteolin)、芹菜素 -7 -O-葡萄糖苷(apegenin-
7-O-glucoside)和木犀草素 -7 -O-葡萄糖苷(leuteolin-7-
O-glucoside)等黄酮类化合物 [ 5] 。本研究拟以体外培养的人脐
静脉内皮细胞(ECV-304)为研究材料 , 选用 H2O2诱导 ECV-
304氧化损伤的模型 ,从 ECV-304的存活率 ,细胞内超氧化物歧
化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶
(CAT)等酶活性变化等方面入手 , 研究紫萍提取物(SE)对 ECV
-304细胞的保护作用。旨在探讨该提取物是否具有减轻细胞
氧化损伤的作用 ,从而为发现紫萍新的药理药效提供理论依据 ,
同时也为探求开发紫萍资源的新途径奠定了基础。
1　材料
人脐静脉内皮细胞株 ECV-304,购自中国科学院上海细胞
·996·
时珍国医国药 2009年第 20卷第 4期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.4　
生物研究所。
紫萍提取物(SE):由本实验室自制 , 经过乙醇溶液回流提
取 、旋转浓缩 、壳聚糖絮凝除杂 、大孔吸附树脂纯化 、真空干燥等
步骤后得到该提取物 ,经过分析后发现其中主要含有黄酮类化合
物 , 其含量大于 80%。 SE溶解于 DMSO中 ,配成母液 , -20℃冰
箱保存。实验前用培养液稀释到所需要的浓度(DMSO的终浓度
<0.1%), 0.22 μm的微孔过滤器过滤。
RPMI-1640培养基 、胎牛血清购自 GIBCO公司;SOD, GSH
-Px, CAT测定试剂盒均购自南京建成生物研究所;MTT购自
Sigma公司。
2　方法
2.1　ECV-304的培养 ECV-304培养于含 10%的胎牛血清的
RPMI-1640培养液中 ,置于 37℃的细胞培养箱中(5% CO2),待
细胞铺满培养瓶 80% ～ 90%左右时 , 用 0.25%胰酶 +0.02%ED-
TA的消化液进行传代培养。
2.2　四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法 MTT溶解于 PBS中 , 配成 5
mg/ml的溶液 , 0.22μm的微孔滤膜过滤后避光保存 ,于一周内用
完。在加入MTT前 ,吸弃培养板中各孔的培养液 , PBS洗 1～ 2次 ,
然后加入新鲜培养液和 10%的 MTT, 于细胞培养箱中培养 4 h后 ,
吸弃培养液, 加入 200 μl的 DMSO,在振荡器上振荡 10 min,待充
分溶解后 ,于 Model550多孔酶标仪 570 nm处检测吸光值。
2.3　SE对 ECV-304细胞的影响 (4 ～ 5)×104个 /ml密度的
ECV-304细胞接种于 96孔培养板中 , 每孔 100 μl。培养 24 h
后 , 吸弃培养液 , 加入含药培养液 , SE的终浓度分别为 5, 10, 25,
50, 100, 200, 400 μg/ml, 另设对照组 , 常规培养。分别培养 24,
48, 72, 96h后 , 用 MTT比色法检测各孔吸光值。
2.4　H2O2对内皮细胞损伤实验 (4 ～ 5)×104个 /ml密度的ECV-304细胞接种于 24孔培养板中 ,每孔 1 000 μl。培养 24 h
后 , 吸弃培养液 , 加入新鲜培养液和 H2O2 , 其终浓度分别为
0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 mmol/L。处理 1, 2, 4 h和 24 h后 , 用 MTT
比色法检测各孔吸光值。
2.5　SE对 H2O2损伤内皮细胞的保护作用 (4 ～ 5)×104个 /ml
密度的 ECV-304细胞接种于 24孔培养板中 , 每孔 1 000 μl。培
养 24h后 , 吸弃培养液 ,后续实验分为两个方向进行。
2.5.1　SE的预防作用 实验分为对照组 、损伤组和预防组。对
照组细胞按常规方法培养 ,损伤组细胞用不含药培养液培养 ,其
余的处理方法与对照组细胞相同。处理组细胞分别用终浓度为
5, 10, 25, 50μg/ml的 SE预处理 24h后 , 吸弃培养液 , PBS冲洗 1
～ 2次 , 加入 H2O2 终浓度为 1 mmol/L的培养液 , 处理 1 h后 ,MTT检测吸光值。
2.5.2　SE的治疗作用 实验分为对照组 、损伤组和治疗组。 对
照组细胞按常规方法培养。损伤组和治疗组的细胞分别用 H2O2
终浓度为 1 mmol/L的培养液 ,预先处理 1 h,吸弃培养液 , PBS冲
洗 1 ～ 2次。 损伤组用不含药培养液培养 , 治疗组分别加入含药
培养液 , SE终浓度为 5, 10, 25, 50 μg/ml, 处理 24h, 用 MTT法检
测各孔吸光值。
2.6　SOD, GSH-Px, CAT测定 实验设对照组 、损伤组和处理
组。将等量 ECV-304细胞接种于 50 ml细胞培养瓶中 , 培养 48
h后 , 吸弃培养液 ,对照组和损伤组加入新鲜的不含药培养液 , 常
规培养 。处理组加入含药培养液 , STF终浓度分别为 10, 25, 50
μg/ml。继续培养 24 h后 ,损伤组用 1mmol/L的 H2O2处理 1 h。
吸弃各实验组的培养液 , PBS冲洗 1 ～ 2次 , 消化液消化 , 用等量
的 PBS收集细胞。超声破碎仪破碎后 , 按照各个试剂盒的操作
说明进行操作。
2.7　数据处理 以 DPS统计软件对实验结果进行分析 , 数据均
以 x±s表示。
3　结果
3.1　SE对 ECV-304细胞的影响 设对照组与实验组。对照组
仅用培养液培养 , 试验组加入不用浓度的 SE(5, 10, 25, 50, 100,
200, 400 μg/m), 分别作用于 ECV-304细胞 24, 48, 72, 96 h后 ,
用 MTT比色法测得的吸光值见表 1。
由表 1可知 , 当 SE的浓度 <100 μg/ml时 ,在作用 24 h时 ,
对 ECV-304基本无毒性 , 而随着作用时间的增加 , 毒性也随之
增加。但到了第 96小时 , 小剂量(≤50 μg/ml)的 SE又不再显示
毒性。因此在以后的实验中 , SE的浓度选择 5, 10, 25, 50 μg/ml,
作用时间为 24 h。
3.2　H2O2细胞损伤实验 设对照组与实验组。对照组仅用培养
液培养 ,实验组用不同浓度的 H2O2(0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10mmol/L)分别作用于 ECV-3041, 2, 4, 24 h后 , 用 MTT比色法测
得的吸光值见表 2。由表 2可知 , 不同浓度的 H2O2对 ECV-304
均有不同程度的抑制作用 , 1mmol/L的 H2O2作用 1h后 , 细胞存
活率仅为对照组的 51.82%。而且当 H2O2浓度≥1 mmol/L后 ,
作用时间基本对实验结果无影响 , 所以为了节约试验时间 , 在以
后的试验中 , H2O2的浓度取 1 mmol/L, 作用时间为 1h。
表 1　不同浓度的 SE对 ECV-304细胞的影响( x±s)
组别 吸光值
24h 48h 72h 96h
对照 0.492±0.067 0.662±0.069 0.919±0.067 1.271±0.121
SE5μg· ml-1 0.469±0.036 0.637±0.077 0.750±0.057＊ 1.183±0.076
SE10μg· ml-1 0.472±0.041 0.624±0.056 0.648±0.116＊＊ 1.113±0.094
SE25μg· ml-1 0.432±0.094 0.451±0.065＊＊ 0.555±0.193＊＊ 0.914±0.075
SE50μg· ml-1 0.409±0.167 0.278±0.081＊＊ 0.528±0.211＊＊ 0.710±0.075
SE100μg· ml-1 0.207±0.145＊＊ 0.183±0.097＊＊ 0.098±0.004＊＊ 0.120±0.100＊＊
SE200μg· ml-1 0.128±0.027＊＊ 0.104±0.013＊＊ 0.094±0.097＊＊ 0.090±0.023＊＊
SE400μg· ml-1 0.099±0.008＊＊ 0.128±0.014＊＊ 0.079±0.013＊＊ 0.076±0.011＊＊
　　与对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;n=6
表 2　不同浓度的 H2O2对 ECV-304细胞的影响( x±s)
组别 吸光值
1h 2h 4h 24h
　　对照 0.425±0.048 0.477±0.043 0.538±0.081＊＊ 1.293±0.064＊＊　　H2O2 0.125mmol· L-1 0.405±0.056 0.437±0.032 0.453±0.029＊＊ 0.713±0.026＊＊　　H2O2 0.25mmol· L-1 0.325±0.060＊＊ 0.407±0.038＊ 0.413±0.020＊＊ 0.602±0.071＊＊　　H2O2 0.5mmol· L-1 0.313±0.064＊＊ 0.306±0.030＊＊ 0.334±0.052＊＊ 0.486±0.019＊＊　　H2O2 1mmol· L-1 0.220±0.047＊＊ 0.214±0.072＊＊ 0.213±0.038＊＊ 0.220±0.026＊＊　　H2O2 2mmol· L-1 0.210±0.035＊＊ 0.129±0.011＊＊ 0.075±0.011＊＊ 0.076±0.010＊＊　　H2O2 5mmol· L-1 0.133±0.011＊＊ 0.076±0.006＊＊ 0.052±0.011＊＊ 0.064±0.003＊＊　　H2O2 10mmol· L-1 0.095±0.005＊＊ 0.077±0.019＊＊ 0.052±0.011＊＊ 0.057±0.003＊＊
　　与对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;n=4
·997·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.4 时珍国医国药 2009年第 20卷第 4期
3.3　SE对 ECV-304细胞氧化损伤保护作用
3.3.1　SE的预防作用 实验分为对照组 、损伤组和预防组。对
照组只加入培养液 , 预防组用不同浓度的 SE(5, 10, 25, 50 μg/
ml)处理 ECV-304细胞 24 h后 ,损伤组和预防组同时吸弃培养
液 , 加入含 1mmol/LH2O2的培养液 ,孵育 1 h后 , 用 MTT法检测
吸光值。实验结果见表 3。从表 3可以看出 , SE在 5 μg/ml的浓
度时 , 对 H2O2造成的氧化损伤并无保护作用 , 而当 SE的浓度≥
10μg/ml, 则表现出明显的保护作用 ,而当 SE的浓度≥10 μg/ml,
则表现出明显的保护作用。与对照组相比 , 细胞存活率由未加
SE保护的 H2O2 处理组 (损伤组)的 21.98%分别上升至
37.49%, 51.71%和 64.74%。
表 3　SE对 H2O2氧化损伤的预防作用( x±s)
组别 吸光值
对照 0.503±0.071
损伤 0.111±0.038
预防组 5μg· ml-1 0.109±0.011
预防组 10μg· ml-1 0.189±0.011＊
预防组 25μg· ml-1 0.260±0.024＊＊
预防组 50μg· ml-1 0.326±0.016＊＊
　　与对照组较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
3.3.2　SE的治疗作用 实验分为对照组 、损伤组和治疗组。对
照组只加入培养液 , 损伤组和治疗组先用含 1 mmol/LH2O2的培
养液培养 1 h,然后吸弃培养液 , 损伤组加入培养液 , 治疗组加入
含 SE(终浓度分别为 5, 10, 25, 50 μg/ml)的新鲜培养液 ,培养 24
h后 , 用 MTT比色法 ,检测吸光值 ,实验结果见表 4。由表 4可以
看出 , 损伤组与治疗组间无显著性差异 ,说明 SE对 H2O2造成的
氧化损伤无治疗作用 。
表 4　SE对 H2O2氧化损伤治疗作用( x±s)
组别 吸光值
对照 0.450±0.042
损伤 0.075±0.003
治疗组 5μg· ml-1 0.039±0.001
治疗组 10μg· ml-1 0.041±0.003＊
治疗组 25μg· ml-1 0.067±0.005＊＊
治疗组 50μg· ml-1 0.073±0.004＊＊
　　与损伤组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
3.4　SE对 ECV-304细胞内 SOD, CAT和 GSH-Px活力的影响
H2O2损伤组和 SE处理组细胞内 SOD, CAT和 GSH-Px的活性
变化见图 1。
图 1　SE对 ECV-304细胞内 SOD, CAT和 GSH-Px酶活力的影响
从图 1可以看出 , H2O2损伤后 , 细胞内 SOD, CAT和 GSH-
Px活力均有所下降 , 比对照组细胞分别降低了 22.48%,
20.96%和 12.67%。而不同浓度的SE作用于ECV-304细胞24h后 ,
均能提高细胞内 3种酶的活力。与对照组相比 , 50μg/ml处理组
细胞内的 SOD, CAT和 GSH-Px活力分别升高了 85.12%,
158.94%和 94.5%。
4　讨论
H2O2是一种强氧化剂 , 可作为内皮细胞脂质过氧化反应的
引发物 ,但是目前关于 H2O2氧化损伤内皮细胞的剂量报道差别
较大 [ 6 ～ 8] 。在本实验中发现 , 1 mmol/L浓度的 H2O2可以明显抑
制 ECV-304细胞的增殖。而且 , 作用时间对实验结果的影响不
显著。
在预实验中发现 , 100 μg/ml的 SE与 1 mmol/L的 H2O2 混
合放置 24 h后 , SE的黄酮含量下降了 14.69%, 说明 SE与 H2O2
会发生反应 , 因此 H2O2与 SE不能同时加入。在研究 SE的抗氧
化活性试验中 , 主要研究了 SE的预防作用与治疗作用。实验结
果证明 , SE的浓度 >5 μg/ml时 , 可以有效地预防 H2O2氧化损
伤 ,提高 ECV-304细胞的存活率。 但是对 H2O2 氧化损伤后的
细胞 ,则无治疗作用。
机体防御体系的抗氧化能力的高低与健康存在着密切的联
系 ,当人体抗氧化能力降低时 ,易引起炎症 、肿瘤 、糖尿病和免疫
系统等疾病。该防御体系有酶促及非酶促反应两部分 , 它们的作
用主要是分解自由基和活性氧 , 分解过氧化物 ,除去起催化作用
的金属离子。酶促反应部分主要是 SOD, CAT和 GSH-Px等与
氧化 -还原反应相关的酶 , SOD能够使机体内产生的超氧阴离子
自由基发生歧化 ,生成过氧化氢酶 ,过氧化氢再被 CAT和 GSH-
Px分解 , 这些酶活力的高低间接反应了细胞或机体清除氧自由
基的能力。试验结果表明 , H2O2 损伤组的细胞内 SOD, CAT和GSH-Px与对照组相比 ,都有所下降 , 说明 H2O2处理细胞后 , 降
低了细胞的抗氧化能力 , 导致细胞内自由基的增多 , 从而抑制
ECV-304细胞的增殖。 10, 25 μg/ml和 50 μg/ml的 SE处理
ECV-304细胞 24 h后 , 可以明显的增强细胞内的 SOD, CAT和
GSH-Px的活力。这些结果提示 , SE可能是通过增强细胞清除
自由基的能力来保护 ECV-304细胞免受 H2O2 诱发的氧化
损伤。
参考文献:
[ 1 ] 　V.R.Muzykantov.Targetingofsuperoxidedismutaseandcatalaseto
vascularendothelium[ J] .JournalofControledRelease, 2001, 71
(1):1.
[ 2 ] 　C.Hermann, A.M.Zeiher, S.Dimmeler.ShearstressinhibitsH2O2
inducedapoptosisofhumanendothelialcellsbymodulationofthegluta-
thioneredoxcycleandnitricoxidesynthase[ J] .ArteriosclerThromb
VascBiol, 1997, 17(12):3588.
[ 3 ] 　S.Dimmeler, C.Hermann, J.Galle, A.M.Zeiher.Upregulationof
superoxidedismutaseandnitricoxidesynthasemediatestheapoptosis
suppressiveefectsofshearstressonendothelialcels[ J].Arterioscler
ThrombVascBiol, 1999, 19(3):656.
[ 4 ] 　黄泰康 ,丁志遵 ,赵守顺.现代本草纲目(下卷)[ M] .北京:中国医
药科技出版社 , 2001:2327.
[ 5 ] 　凌　云 ,何板作 ,鲍燕燕 ,等.浮萍的化学成分研究 [ J].中草药 ,
1999, 30(2):88.
[ 6 ] 　胡　涛 ,李兰荪 ,曹艳杰 ,等.银杏叶提取物对培养的人脐静脉内皮
细胞脂质过氧化的保护作用 [ J].临床心血管病杂志 , 2001, 17
(12):570.
[ 7 ] 　庹勤慧 ,廖端芳 ,朱炳阳 ,等.金粉蕨素拮抗血管内皮细胞氧化应激
损伤及机制 [ J] .中国临床药理学与治疗学 , 2003, 8(4):381.
[ 8 ] 　绪广林 ,钱之玉.西红花苷对血管内皮细胞的保护作用研究 [ J] .中
草药 , 2002, 33(5):439.
·998·
时珍国医国药 2009年第 20卷第 4期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.4