全 文 ：收稿日期:2012-06-08
基金项目:贵州省科技计划项目(2010-LKZ7029);贵州省教育厅自然科学类重点科研项目(2008027)作者简介:麻秀萍(1971-),女 ,副教授 ,从事中药分析教学和科研
工作。通讯作者:贾宪生 ,副主任药师。
柱前衍生化 HPLC法测定薏苡非种仁
部位中丙氨酸的含量
麻秀萍 ,邵进明 ,梁　祝 ,张　凤 ,张明昶 ,徐文芬 ,贾宪生
(贵阳中医学院 , 贵阳　550002)
摘要:目的:建立柱前衍生化反相高效液相色谱法测定薏苡非种仁部位中氨基酸含量的方法。方法:采用
Shim-pack CLC-ODS(4.6 mm)色谱柱 ,流动相 A 为 0.1 mol/ L 乙酸钠溶液(pH=6.5)-乙腈(93∶7), 流动
相 B为乙腈-水(4∶1), 梯度洗脱 , 柱温为 40℃, 检测波长为 254 nm。结果:丙氨酸进样量在 0.01296 ～
0.2851 μg 范围内 , 线性关系良好 , r=0.9998(n=7),平均加样回收率为 98.01%, RSD 为 2.2%。结论:方法
准确 、可靠 , 具有良好的重复性和稳定性 , 可用于薏苡非种仁部位中氨基酸的含量测定。
关键词:薏苡非种仁;氨基酸;柱前衍生;高效液相色谱法
中图分类号:O657.7+2　文献标识码:A　文章编号:1005-5320(2012)05-0054-03
Before the column derived by reveed-phase HPLC Coix non kernel parts of alanine Content
MA Xiu-ping , SHAO Jin-ming , LIANGZhu , et al
(Guiyang College of Traditional Chinese Medicine , Guiyang 550002 , China)
Abstract:Objective:to establish a high performance liquid chromatog raphic method for the determination of the amino acid Coix non
kernel par ts the content of method.Methods:the chromatographic column:Shim-pack CLC-ODS(4.6 mm);Mobile phase A:0.1
mol/L acetic acid sodium solution (pH = 6.5):acetonitrile (93∶7), mobile phase B:acetonitrile:water (4∶1);The column
temperature:40℃;Detected w aveleng th:254 nm;Results:alanine in 0.01296 0.2851 μg range , good linear relationship , r=0.
99985(n=7), the average recovery rate is 98.01%and RSD =2.2%.Conclusion:high perfo rmance liquid chromatog raphic column
derivativemethod can be used as Coix before the amino acid content non kernel part one of determination method , this method is
accurate , reliable , good repeatability and stability , and can be widely used in Chinese herbal medicine of the amino acid content
determination.
Key Words:Coix non kernel;amino acid;before column derivative;high performance liquid chromatog raphy
　　薏苡非种仁部位为禾本科植物薏苡 Coix
lachryma -jobi L.var.ma -yuen(Romanet)Stapf
的干燥根及内 、外种皮 , 根可作药用[ 1] 。薏苡根含
有薏苡素 (Coixol)、棕榈酸 、硬脂 酸 、豆甾 醇
(Stigmasterol)、β -和 γ-谷甾醇 (β -, γ-
sitosterol)、氯化钾 、氨基酸及淀粉等成分[ 2] 。薏苡
非种仁部位是薏苡仁加工生产的废弃物 ,是值得综
合开发利用的资源 ,具有很好的发展前景 ,其中氨基
酸不仅是补充营养的重要来源 , 更在发挥药效时起
着不可或缺的作用 ,分析薏苡非种仁部位中氨基酸
的含量具有现实意义 。目前薏苡的质量控制方法尚
不完善 ,课题组已建立了薏苡素含量测定方法[ 3] ,
为了更全面地控制薏苡的质量 ,本实验采用柱前衍
生化HPLC 法测定薏苡非种仁部位的丙氨酸含量 ,
为更好地开发利用薏苡根和种皮提供依据和基础。
1　仪器与材料
1.1　仪　器
日本岛津 LC -20AT 高效液相色谱仪(二元
泵 ,SPD-20A 紫外可见检测器 ,手动进样器 ,柱温
箱),电子天平 ,超声波清洗机 CX-300型 。
1.2　药材与试剂
药材:采自贵州薏苡生产区 ,黔西南州的晴隆县
和兴仁县 ,经贵阳中医学院何顺志教授鉴定为禾本
科植物薏苡 Coix lachryma-jobi L.var.ma-yuen
(Romanet)Stapf的根和内 、外种皮 ,根洗净 ,晾干 ,粉
碎 ,过 40目筛 ,备用。
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兴仁薏苡根 2010.12 (1 号样)、兴仁内种皮
2010.12(2号样)、晴隆薏苡根 2010.12(3号样)、晴
隆薏苡根 2009.3(4 号样)、晴隆薏苡仁种皮 2009.
12(5号样)、晴隆外种皮 2009.12(6号样)、晴隆碧
痕乡外种皮 2010.12(7 号样)、云南薏苡内种皮
2010.12(8 号样)、云南薏苡外种皮 2010.12(9 号
样)。
试剂:丙氨酸对照品(编号:624-200104 ,供含
量测定用)由中国药品生物制品检定所提供;乙腈
(色谱纯),纯净水 、异硫氰酸苯酯 、三乙胺 、36%乙
酸 、乙酸钠 、正己烷等为分析纯 。
2　方法与结果
2.1　色谱条件及系统适用性试验
色谱柱:Shim -pack CLC -ODS(4.6 ×150
mm),柱温:40℃,流速:1.0 m l/min ,检测波长:254
nm ,流动相 A为 0.1 mol/ L 乙酸钠溶液(pH=6.5)
-乙腈(93∶7),流动相 B为乙腈-水(4∶1),梯度洗
脱程序见表 1。
表 1　流动相系统配比的梯度洗脱程序表
时间(min) 流动相 A(%) 流动相 B(%)
0 ～ 13
13 ～ 18
18 ～ 18.01
18.01 ～ 23
23 ～ 29
29 ～ 35
35 ～ 50
50 ～ 55
55 ～ 62
100※95
95※91
91※80
80※72.5
72.5※60.5
60.5※55.5
55.5※0
0
0※100
0※5
5※9
9※20
20※27.5
27.5※39.5
39.5※44.5
44.5※100
100
100※0
　　在此色谱条件下 ,丙氨酸峰与相邻色谱峰分离
度达 1.5 ,且不受衍生试剂和干燥剂的影响 ,理论塔
板数按丙氨酸峰计应不低于 5000(图略)。
2.2　供试品溶液的制备
取薏苡非种仁部位粉末 2 g ,精密称定 ,置具塞
锥形瓶中 ,精密加入 15%乙醇 25 ml ,静置 12.5 h ,
称重 ,超声 30 min后 ,放冷 ,再称重 ,用 15%乙醇补
足减失的重量 ,摇匀 ,过滤 ,即得。
2.3　对照品溶液的制备
精密称取丙氨酸对照品 6.48 mg ,置 250 ml量
瓶中 ,用 15%乙醇溶解 ,并定容至刻度 ,摇匀 ,制成
每 1 m l含丙氨酸 0.02592 mg 的对照品溶液。
2.4　衍生试剂的配制
取417 μl三乙胺 ,加 2.583 L 乙腈混合成 1.0
mol/L 的三乙胺乙腈溶液 ,作为干燥液。取 36 μl异
硫氰酸苯酯 ,加 2.164 ml乙腈混合 0.1 mol/L 的异
硫氰酸苯酯乙腈溶液 ,作为衍生化试剂 ,需每天更
换 。
2.5　衍生化试剂空白溶液的制备
精密量取 0.1 mol/L 异硫氰酸苯酯乙腈溶液
100μl 、1.0 mol/L 三乙胺乙腈溶液 100μl ,置具塞小
瓶中 ,摇匀 ,放置 1 h ,加入 400 μl正己烷 ,摇匀 ,放
置 10 min , 吸取下层溶液 ,即得。
2.6　测定方法
精密量取供试品溶液或对照品溶液 200 μl ,置
具塞小瓶中 ,精密加入 0.1 mol/L 异硫氰酸苯酯乙
腈溶液 100 μl 、1.0 mol/L 三乙胺乙腈溶液 100μl ,摇
匀 , 放置 1 h ,加入 400 μl 正己烷 , 摇匀 ,放置 10
min ,吸取下层溶液 ,过 0.45 μm 滤膜 ,即得待测溶
液 。精密取 5 μl待测溶液 ,注入高效液相色谱仪 ,
照 2.1项下色谱条件测定。
2.7　方法学考察
2.7.1　专属性实验
分别精密吸取衍生化试剂空白溶液 、对照品溶
液 、薏苡非种仁部分供试品溶液 ,进样 5 μl ,记录色
谱图 ,结果丙氨酸峰与相邻色谱峰分离良好 ,且不受
衍生试剂和干燥剂的影响 ,表明本方法专属性良好。
2.7.2　精密度实验
取 1 号样(兴仁薏苡根 2010.12),按 2.2项下
方法制备供试液 ,精密吸取 5 μl 注入液相色谱仪 ,
连续进样 6 次 ,测定峰面积 ,计算 RSD为 0.89%。
结果表明仪器的精密度良好 ,符合分析要求。
2.7.3　重复性实验
取同一批药材(1号样),按 2.2项下方法制备 6
份供试液 ,分别精密吸取 5 μl注入液相色谱仪 ,测
得供试品中丙氨酸含量的平均值为 0.2436 mg/g ,
RSD为 0.77%,表明本方法重复性好 。
2.7.4　稳定性实验
取同一批药材(1 号样),按 2.2 项下方法制备
供试液 , 精密吸取 5 μl 分别于 0 、2.5 、5 、7.5 、10 、
12.5 h注入液相色谱仪中测定 ,测定峰面积值 ,RSD
为 0.89%。结果表明供试液至少在 12.5 h内测定
保持稳定。
2.7.5　线性关系考察
分别精密量取丙氨酸对照品溶液(0.02592
mg/ml)0.5 、1 、 3 、5 、7 、 9 、11μl注入液相色谱仪 ,
按 2.1项下色谱条件进行测定 ,以丙氨酸对照品的
进样量(X)为纵坐标 ,峰面积(Y)为横坐标绘制标准
曲线 , 计算其回归方程为:Y =11678473.3x +
2098.8 , r=0.99985(n=7)。结果丙氨酸进样量在
0.01296 ～ 0.2851 μg 之间与峰面积呈良好线性关
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系。
2.7.6　加样回收试验
取药材粉末(1 号样 ,丙氨酸含量的平均值为
0.2436 mg/g)6 份 , 各 1 g , 精密称定 , 分别加入
0.0612 mg/ml丙氨酸对照品 4.4 ml ,按 2.2项下方
法制备供试品溶液 ,并按 2.1项下色谱条件测定 ,计
算得平均回收率为 98.01%, RSD%为 2.2%,表明
本方法准确性较好 ,结果见表 2。
表 2　加样回收实验 (n=6)
称样量
(g)
样品中丙氨
酸含量(mg)
加对照品丙
氨酸量(mg)
测得值
(mg)
回收率
(%)
平均回
收率(%)
RSD
(%)
1.0009
1.0010
1.0011
1.0010
1.0012
1.0012
0.2438
0.2438
0.2439
0.2438
0.2440
0.2440
0.2693
0.2693
0.2693
0.2693
0.2693
0.2693
0.5071
0.5080
0.4992
0.5043
0.5161
0.5124
97.77
98.11
94.80
96.73
101.0
99.67
98.01 2.2%
　
3　样品含量测定
取不同产地 、不同采集时间的薏苡非种仁部位 ,
按 2.2项下方法制备供试液 ,进行含量测定 ,结果见
表 3。
表 3　样品测定结果(n=3)
样品号 产地 部位 采集时间 含量(mg/g)RSD(%)
1 兴仁 薏苡根 2010.12 0.24 1.6
2 兴仁 内种皮 2010.12 0.028 20.
3 晴隆碧痕乡 薏苡根 2010.12 0.24 1.4
4 晴隆碧痕乡 薏苡根 2009.3 0.25 1.1
5 晴隆沙子镇 薏苡外种皮 2009.12 0.015 1.3
6 晴隆紫马镇 外种皮 2009.12 — —
7 晴隆碧痕乡 外种皮 2010.12 — —
8 云南 薏苡内种皮 2010.12 0.077 1.87
9 云南 薏苡外种皮 2010.12 0.020 0.9
4　结果与讨论
4.1　提取方法的考察
氨基酸易溶于水和稀醇 ,加热易变性 ,故本实验
分别以水 、45%乙醇 、30%乙醇 、15%乙醇 、10%乙
醇 、5%乙醇作为提取溶剂 ,比较了静置过夜再超声
提取 30 min 、静置过夜再超声提取 1 h 、静置过夜提
取 、超声提取 30 min 、超声提取 2 h的提取方式。结
果以 15%乙醇为提取溶剂 , 静置过夜再超声提取
30 min ,氨基酸色谱峰分离好 ,提取率最高 ,故作为
本实验的提取条件。
4.2　色谱条件的考察
分别对 lichrospher C18(4.6×250 mm , 5 μm)
色谱柱 、Shim -pack CLC —ODS(4.6 mm ×150
mm ,5 μm)色谱柱和流动相 B 进行了考察 ,比较了
乙腈-水(4∶1)、甲醇-乙腈-水(1∶3∶1)系统 ,结果
采用 Shim -pack CLC —ODS(4.6 mm ×150 mm ,5
μm)色谱柱 ,流动相 B为乙腈-水(4∶1)条件下所检
测的色谱峰峰形较好 ,丙氨酸色谱峰的分离度大于
1.5 ,故作为本实验选定条件 。
4.3　衍生化条件的考察
实验曾用王薇等[ 3]衍生方法:精密量取氨基酸
对照品和样品溶液 10μl ,分别置于 5 ml离心管中 ,
真空干燥;加入 10 μl再干燥液乙醇∶水∶三乙胺(2∶
2∶1),再加入异硫氰酸苯酯∶甲醇∶三乙胺∶水(1∶7∶1
∶1)组成的衍生剂溶液 20 μl , 超声处理后放置 20
min ,真空干燥。干燥后的样品加 100 μl样品稀释
液 ,超声溶解 , 0.45 μm 滤膜过滤。因实验条件限
制 ,所得衍生反应产物呈结晶状 ,用稀释液稀释后微
溶解 ,呈现混悬状 。用孙莲等[ 4]衍生方法:取 200 μl
对照品或供试品溶液 ,加入 0.1 mol/L/异硫氰酸苯
酯乙腈溶液 100μl 、1.0 mol/L 三乙胺乙腈溶液 100
μl ,摇匀 ,放置 1 h ,加入 400 μl正己烷 ,摇匀 ,放置
10 min ,吸取下层溶液过0.45 μm 滤膜 ,所得衍生反
应产物在稀释液中完全溶解 。照 2.1项下色谱条件
测定 ,结果色谱峰分离良好 ,因此采用该衍生方法。
实验对兴仁 、晴隆 、云南等地的薏苡非种仁部位
样品进行了测定 ,结果薏苡根中丙氨酸含量明显高
于内 、外种皮中丙氨酸含量 ,而 6号样和 7号样均为
外种皮 ,未检出丙氨酸 ,初步发现丙氨酸在薏苡根中
含量最高 ,在外种皮中含量最低 。
本实验采用柱前衍生化 HPLC 法测定薏苡非
种仁部位的丙氨酸含量 ,旨在为更好地开发研究利
用薏苡根和种皮提供依据和基础 ,也为更全面地控
制薏苡的质量提供了方法。
参考文献:
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