全 文 ：粮油食品科技 第 21 卷 2013 年 第 1 期 粮油食品
瑔瑧
高效液相色谱法测定莜麦
米酒中 γ －氨基丁酸
刘文勃，易好诚，李苏红，徐杰，王俊伟，张雷
( 沈阳师范大学 粮食学院，辽宁 沈阳 110034)
摘 要:建立紫外—高效液相色谱测定莜麦米酒中的 γ －氨基丁酸( γ － Aminobutyric acid，GABA)
含量的分析方法。利用碱性条件下，GABA可与邻苯二甲醛( OPA) 发生衍生化反应，生成具有较强
紫外吸收的衍生物。采用紫外—高效液相色谱仪检测，色谱条件: Eclipse XDB － C18 分析柱 ( 5
μm，4． 6 × 150 mm) ，以 50 mmol /L 的乙酸钠( pH6． 8) —甲醇—四氢呋喃( THF，A 相，82∶ 17∶ 1; B
相，22∶ 77∶ 1，V∕ V) 为流动相进行梯度洗脱，可检测到 GABA 在 0． 04 ～ 0． 5 g /L 范围内与 GABA
峰面积的线性关系良好 R2 = 0． 9985，样品衍生时间 1 min最佳，平均回收率为 99． 5%，精密度相对
标准偏差( RSD) 为 1． 6%，重复性( RSD) 为 0． 66%，最低检出限为 0． 0254 g /L。方法简单快捷、重
复性好、灵敏度高，可用于莜麦、莜麦发酵酒等中 GABA含量测定。
关键词:莜麦米酒; γ －氨基丁酸;紫外检测;高效液相色谱
中图分类号:TS 207． 3 文献标识码:A 文章编号:1007 － 7561(2013)01 － 0067 － 04
Determination of γ － aminobutyric acid in naked oats wine by high
performance liquid chromatography
LIU Wen － bo，YI Hao － cheng，LI Su － hong，XU Jie，WANG Jun － wei，ZHANG Lei
(Food College，Shenyang Normal University，Shenyang Liaoning 110034)
Abstract:The content of γ － aminobutyric acid(GABA)in naked oats wine was determined by UV— high
performance liquid chromatography． In alkalescence，GABA took derivatization reaction with orthophthal-
aldehyde (OPA)to create ramification with strong UV—absorptivity，and determined by a UV detector．
The separation of GABA was achieved on Eclipse XDB － C18 column(5 μm，4． 6 × 150 mm)using 50
mmol /L of sodium acetate (pH 6． 8)－ methanol － THF (A，82∶ 17∶ 1;B，22∶ 77:1，V /V)as the mo-
bile phase at a gradient elution． GABA was linear with GABA peak area (R2 = 0． 9985)in the range of
0． 04 ～ 0． 5 g /L，the optimal reaction time was 1 min;The average recovery rate was 99． 5%;the rela-
tive standard deviation was 1． 6% and the repetitiveness 0． 66%，and the minimum detecting limit
0． 025 4 g /L． The method is simple，rapid with high repetitiveness and sensitivity． It can be widely ap-
plied to determine GABA in naked oats and naked oats wine．
Key words:naked oats wine;γ － aminobutyric acid;ultraviolet detection;high performance liquid chro-
matography
收稿日期:2012 － 06 － 25
作者简介:刘文勃，1988 年出生，男，大学本科．
通讯作者:李苏红，1968 年出生，女，博士，副教授．
γ －氨基丁酸(γ － Aminobutyric acid，简称 GA-
BA)是一种非蛋白质氨基酸，为哺乳动物中枢神经
系统内重要的氨基酸类神经递质［1］，分布非常广
泛，在动物、植物、微生物中均有 GABA 存在。大量
研究结果表明，GABA具有重要的生理功能，能增进
脑活性和长期记忆、安神抗抑郁、美容润肤、改善脂
质代谢、降血压、活化肝功能和改善更年期综合征等
重要生理功能［2 － 3］。
莜麦是谷类食品中最好的全价营养食品之一，
也是一种兼备食疗功能的作物。其蛋白质、脂肪、维
DOI:10.16210/j.cnki.1007-7561.2013.01.007
粮油食品 粮油食品科技 第 21 卷 2013 年 第 1 期
瑔瑨
生素及钙、铁、磷等矿物质的含量在同类粮食作物中
最高。莜麦米酒具有香醇甘美，营养价值高，经济实
惠等特点，老幼妇孺皆宜食用，有益身体健康。经过
发酵工艺加工的莜麦米酒其糠层纤维被软化和细微
化，改善了莜麦产品口感，同时也大大提高了功能成
分(如 GABA)的含量。因此，找到一种高效、简便、
可靠的方法来测定莜麦米酒中 GABA 的含量，可为
开发和评价富含 GABA 的功能性莜麦米酒及同类
产品提供参考。
由于 GABA对电化学和紫外、可见光及荧光的
不灵敏性，导致采用直接方法对其测定比较困难。
关于 GABA 的测定有薄层扫描法、氨基酸分析仪
法［4］、色质联用法、蒸发光散射检测技术、纸电泳比
色、高效离子交换色谱—积分脉冲安培检测法、毛细
管气相色谱法［5］、酶法［6］、毛细管电泳法［7］、高效液
相色谱法［8 － 9］等。其中大部分方法检测精度虽然
高，但其设备比较昂贵、操作复杂、检出限低，且使
用维护繁琐，不适用于大量的分析测定。高效液
相色谱法广泛应用于氨基酸浓度测定，具有分析
迅速、灵敏度高、操作简单、便于保养维护等优点。
本研究的目的是建立一种邻苯二甲醛(OPA)柱前
衍生紫外—高效液相色谱检测莜麦米酒中 GABA
的方法。
1 材料与方法
1． 1 材料与仪器
材料:莜麦、“安琪”甜酒曲:市售。
试剂:γ －氨基丁酸(γ － Aminobutyric acid) :纯
度(%)≥99． 0，上海求德生物化工有限公司;β －巯
基乙醇:纯度(%)≥99． 0，Amresco 公司;邻苯二甲
醛(OPA) :化学纯，国药集团化学试剂有限公司;四
氢呋喃(THF) :色谱纯，天津博迪化工股份有限公
司;甲醇 :色谱纯;硼酸 :分析纯;无水乙酸钠:纯度
(%)≥99． 0;所用水均为超纯水。
仪器:KQ2500DB 型数控超声波清洗器:昆山
市超声波仪器有限公司;WFZUV －2000 紫外可见分
光光度计:尤尼柯仪器有限公司;Agilent Technologies
1200 series(包括 Eclipse XDB – C18 柱、G1311A 四
元泵、G1316A 柱温箱、G1314A 可变波长检测器) ，
Agilent公司;D － 37520 型台式离心机，德国 Heraeu
Biofuge Stratos 公司;津隆针筒式有机滤膜过滤器
(0． 22 μm、0． 45 μm)。
1． 2 色谱条件
色谱柱为 Eclipse XDB － C18 5 μm，4． 6 × 150
mm柱;流动相为 50 mmol /L的乙酸钠(pH6． 8)—甲
醇—四氢呋喃(THF) (A相，82∶ 17∶ 1;B 相，22∶ 77∶
1，V∕ V)［10］，各成分均用 0． 45 μm滤膜过滤并经超
声波脱气处理;柱温，27 ℃;流量，1． 0 mL /min;进样
量，10 μL;紫外检测波长 326 nm。本实验采用的梯
度程序见表 1。
表 1 GABA梯度洗脱程序
步骤 时间 /min
乙酸钠(pH6． 8)∶甲醇∶ THF
A(82∶ 17∶ 1，V∕ V，) ，B(22∶ 77∶ 1，V∕ V)
1 0 95 5
2 6 88 12
3 9 66 34
4 22 30 70
1． 3 样品制备
莜麦米酒按莜麦∶水 = 1∶ 2 的比例，用 20 ℃～ 25
℃水浸 24 h ～ 48 h;用煮饭锅加水蒸煮 1 h 左右;出
锅后采用淋饭降温，冷却至饭温为 30 ℃～ 35 ℃;加
0． 4%左右的酒曲，搅拌均匀，装入烧杯中，压实，在
30 ℃下发酵 96 h;将发酵后的酒液，用离心机以 15
000 r /min 离心 10 min，从离心管中吸取上清液备
用。
1． 4 标准溶液的配制与曲线的绘制
用超纯水配制 2． 0 g /L的 GABA标准储备液保
存在 4 ℃冰箱内，用超纯水稀释储备液，得到系列浓
度标准溶液，按照 1． 5 的方法进行柱前衍生，并用紫
外高效液相色谱测定，以峰面积对浓度绘制标准曲
线。
1． 5 样品与标准溶液柱前衍生反应
称取 10 mg OPA，加 0． 5 mL 甲醇溶解后，加入
2 mL 0． 4 mol /L 硼酸缓冲液(pH 9． 40)和 30 μL
β －巯基乙醇，此衍生剂溶液在 12 h 内使用效果最
佳。取样品或标准溶液 100 μL 加入上述溶液 100
μL，混匀，反应 1 min后进样。
粮油食品科技 第 21 卷 2013 年 第 1 期 粮油食品
瑔瑩
2 结果与分析
2． 1 波长的选择
GABA没有紫外或荧光吸收，很难直接检测。
但 GABA经衍生反应后会形成具有荧光或紫外吸
收的物质，因此采用 HPLC 法与柱前衍生技术结合
可以精确测定微量的 GABA 浓度。OPA 是目前使
用最广泛的衍生物质。在碱性条件下，OPA 与
GABA反应生成具有较强紫外吸收的衍生化产
物［11］。衍生试剂本身没有紫外吸收，不干扰分离
和测定，不须除去过量试剂以及色谱图基线比较
平稳等特点，采用 OPA衍生物测定 GABA，反应迅
速和灵敏度高。GABA 与 OPA 衍生反应方程
式［12］(见图 1)。
图 1 GABA与 OPA衍生反应方程式
取一定浓度的 GABA 标准样品，在 200 ～ 400
nm之间进行紫外波长扫描，结果显示最大吸收峰在
326 nm处(见图 2) ，因此选择 326 nm做检测波长。
图 2 GABA标准品紫外检测图谱
2． 2 色谱条件的优化
测定 GABA 的流动相体系为乙酸钠 (pH
6． 8)—甲醇—四氢呋喃(A相，82∶ 17∶ 1;B 相，22∶ 77
∶ 1，V∕ V) ，使用梯度洗脱程序测定 GABA，通过改
变流动相分配比与洗脱时间对 GABA 进行分离。
图 3 为 GABA标准溶液在优化色谱条件中分离效果
最佳的色谱图，其在柱上的保留时间为 13． 106 min。
图 4 为莜麦米酒在此优化色谱条件之下的色谱图，
可见，GABA与样品中其他物质达到了基线分离，不
受其他峰的干扰。其中 GABA 在柱上的保留时间
与标准品一致，为 13． 041 min。同时，空白实验结果
表明:衍生剂、流动相及未经衍生的米酒在 326 nm
处，保留时间为 13 min 前后均无吸收峰，说明没有
来自于其他物质的干扰。
2． 3 衍生时间的确定
取 0． 2 g /L GABA标准溶液 7 份，分别按照0． 5、
1． 0、1． 5、2． 0、2． 5、3． 0、3． 5 min 进行柱前衍生并进
行 HPLC 测定，测得 7 次峰面积为:454． 6、482． 1、
475． 7、435． 7、412． 4、395． 4、378． 8，结果见图 5。表
明在衍生 1 min时峰面积最大，即衍生时间为 1 min
时效果最佳。
图 5 GABA的衍生稳定性
粮油食品 粮油食品科技 第 21 卷 2013 年 第 1 期
瑖瑠
2． 4 线性实验结果
按照 1． 4法绘制曲线(见图 6) ，在 0． 04 ～ 0． 5 g /
L范围内与 GABA峰面积的线性关系良好，得到的线
性回归方程为 y = 2589x － 12． 527，R2 = 0． 9985。
图 6 GABA的标准曲线
2． 5 精密度试验
取 0． 2 g /L GABA标准溶液 6 份，测得 6 次峰面
积分别为:505． 9、493． 3、494． 3、507． 5、491． 8、508． 2，
计算得 RSD为 1． 6%，精密度较好。
2． 6 重复性试验
取同一种莜麦米酒样品溶液 5 份，测得 5 次峰
面积分别为:690． 6、696． 7、697． 4、689． 6、686． 9，计
算得 RSD为 0． 66%，表明该方法重复性良好。
2． 7 回收率试验
取 3份莜麦米酒样品溶液，加入一定量的 GABA
标准溶液，按与莜麦米酒同样的样品处理方法测定
GABA含量，回收率见表 2。平均回收率为 99． 5%，
结果表明样品处理过程中 GABA损失很少。
表 2 HPLC法测定 GABA的回收率
样品号
原始质
量浓度
/(g /L)
添加质
量浓度
/(g /L)
最后质
量浓度
/(g /L)
回收率
/%
平均
回收率
/%
1 0． 1837 0． 2 0． 3818 99． 5
2 0． 2143 0． 2 0． 4124 99． 5
3 0． 2009 0． 2 0． 3989 99． 5
99． 5
2． 8 最低检出限试验
取 GABA标准溶液，加超纯水稀释，然后进行
HPLC 测定，直到被测标准溶液浓度所对应的信噪
比为 3，按公式 D1 = 3NW/A 计算最低检出限(D1为
最低检出限，N为噪音峰高，W 为进样浓度，A 为标
准品峰高)［12］，双试验求其平均数，最低检出限见表
3，结果表明 GABA的最低检出限为 0． 0254 g /L。
表 3 GABA最低检出限
样品号 N /mA W/g /L A /mAU D1 /(g /L)
最低检出限
平均值 /(g /L)
1 2． 4 0． 025 7． 7 0． 0234
2 3． 0 0． 025 8． 2 0． 0274
0． 0254
3 结论
OPA柱前衍生，紫外高效液相色谱法检测 GA-
BA是近年发展起来的一种新方法。与测定 GABA
的其他方法相比，此方法具有灵敏度高、分析过程简
捷可靠、试剂成本较低等特点。通过精密度、稳定
性、重复性、回收率、最低检出限和样品的测定，充分
证明了实验的可行性，可用于莜麦及莜麦米酒中
GABA含量的测定。
参考文献:
［1］万选才，杨天祝，徐承焘．现代神经生物学［M］．北京医科大学中
国协和医科大学联合出版社，1999． 158 － 162．
［2］许建军． Lactococcus Lactic生物合成 γ －氨基丁酸及谷氨酸脱
梭酶的性质研究［D］．无锡:江南大学，2004．
［3］郑红发，黄亚辉，刘霞林． γ －氨基丁酸的药理作用［J］．茶叶通
讯，2004，(4) :14 － 17．
［4］任红波． 氨基酸分析仪快速测定糙米中的 γ －氨基丁酸［J］．杂
粮作物 ，2003，23 (4) :246 － 247．
［5］徐小平，郭 平，宋玉如，等． γ －氨基丁酸的毛细管气相色谱测定
法［J］．华西药学杂志，1990 ，5 (2) :107 － 109．
［6］胡红焱，杨树德． 细菌荧光法酶生物发光分析法测定血清中
γ － 氨基丁酸［J］． 临床检验杂志，1998，16(2) :67 － 69．
［7］朱珠． 递质氨基酸的毛细管电泳 －安培检测［J］． 分析测试学
报，1999，18 (4) :36 － 38．
［8］ Bruckner H，Westhauser T． Chromatographic determination of L －
and D － amino acids in plants［J］． Amino Acids，2003，24(1) :
43 － 55．
［9］Matloubi H，Aflaki F，Hadjiezadegan M． Effect of γ － irradiation on
amino acids content of baby food proteins．［J］． Journal of Food Com-
position and Analysis，2004，17(2) :133 － 139．
［10］赵宏飞，宋伟，张柏林，等． 食品中三种 γ–氨基丁酸检验方法
比较［J］．中国乳品工业，2008，36(11) :51 － 52．
［11］葛青萍，蔡柏岩，宋明明，等． 高效液相色谱法测定乳酸菌中的
γ–氨基丁酸［J］．食品科学，2008，29(6) :324 － 326．
［12］张晖，吴胜芳，姚惠源． OPA柱前自动衍生–紫外检测米胚芽中
的 γ –氨基丁酸的 HPLC 法研究［J］． 食品与发酵工业，2003，
29(10) :50 － 52．
［13］陈海娇，王萍，陈越，等． 高效液相色谱法测定母乳中唾液酸含
量［J］． 食品科学，2011，32(16) :308 － 311．●完