全 文 ：福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷 第 2 期
Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition) 2013 年 3 月
收稿日期:2012 － 03 － 26 修回日期:2012 － 10 － 20
基金项目:福建省自然科学基金(2009J01053) ;福建省科技厅资助高校项目(2006F50009)．
作者简介:郑世群(1971 －) ，男，副教授，博士．研究方向:野生动植物保护与利用． Email:fjzsq@ 126． com．通讯作者刘金福(1966 －) ，男，教
授．研究方向:生态学和野生动植物保护与利用． Email:fjljf@ 126． com．
孑遗植物水松基因组 DNA提取及
ISSR反应体系建立
郑世群1，刘金福1，吴则焰2，洪 伟1，徐道炜1，何中声1
(1．福建农林大学林学院;2．福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002)
摘要:以不同种源水松叶片为材料，应用改良 CTAB法提取水松基因组 DNA，并对 ISSR-PCR反应体系进行优化．结果表明:
利用改良 CTAB法提取的水松基因组 DNA产量高、质量好，符合 ISSR分析要求．通过正交试验设计，探讨不同浓度 DNA模
板、引物、dNPT、Taq DNA聚合酶对水松 ISSR-PCR反应体系的影响．
关键词:水松;DNA提取;ISSR-PCR;体系优化
中图分类号:S791．29;Q943．2 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2013)02-0158-04
Extraction of genomic DNA and optimization of ISSR reaction system
with orthogonal design in Glyptostrobus pensilis
ZHENG Shi-qun1，LIU Jin-fu1，WU Ze-yan2，HONG Wei1，XU Dao-wei1，HE Zhong-sheng1
(1． College of Forestry，Fujian Agriculture and Forestry University;2． College of Life Sciences，
Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China)
Abstract:The improved CTAB method was used for the extraction of genomic DNA in different populations of Glyptostrobus pensilis，
and a satisfactory ISSR reaction system was also established by orthogonal design． The result showed that the improved CTAB method
was suitable for the extraction of DNA，and the DNA extracted by this method had higher yield，better quality，and could be used
for ISSR-PCR reaction． A number of factors，which affected the results of ISSR － PCR reaction，such as quantity of template DNA，
primer，concentration of dNPT and Taq DNA polymerase were studied．
Key words:Glyptostrobus pensilis;extraction of DNA;ISSR analysis;system optimization
水松(Glyptostrobus pensilis)属杉科水松属，是我国特有珍稀孑遗树种(国家一级保护植物)．生长于沼
泽地，耐水湿，是造船和造桥的良材;树根轻松、浮力大，可以用来做救生工具和木塞;枝叶和果实可入
药［1］．水松在古生代曾广布于北半球，由于地史因素和人为活动影响，数量日益减少，已处于濒危状态，目
前仅零星分布于我国南方．在研究杉科植物系统发育、古植物学和第四纪冰川气候等方面，水松具有重要
科学价值，被世界保护监测中心列为稀有种，被《中国植物红皮书》列为濒危树种［2］．目前水松分布范围不
断缩小且呈片段化，居群数量剧烈下降，大部分分布地仅剩几株孤立木，天然更新难以进行，幼苗幼树几乎
没有，且病虫危害严重，加之人为干扰破坏，水松生存与繁殖面临严峻挑战．如何保护水松林稀有珍贵基因
与种质资源、扩大水松林自然资源已成当务之急．
水松因其濒危状况受到众多学者高度关注．韩丽娟等［1 － 2］对水松生物学特性和保护、次生韧皮部解剖
及其系统位置进行分析，斯缨等［3］研究水松叶总黄酮含量，李发根等［4］探讨了水松地理分布和濒危原因，
郑世群等［5］针对濒危原因提出保护对策，吴则焰等［6 － 11］对水松种群生态学进行研究，但其分子生态学研
究较少．简单重复序列间区(inter-simple sequence repeats，ISSR)分子标记技术具有快速、多态性高、稳定
性和重复性好等优点［12］，已广泛用于植物遗传连锁图谱的构建、基因定位、种质资源鉴定、植物分类、进化
和遗传多样性分析等方面［13］．作为基于 PCR 的一种分子标记，其扩增结果易受 Mg2 +、dNTP、DNA 模板、
Taq DNA聚合酶、引物等因素影响，DNA模板质量及稳定的 PCR反应体系是获得可靠分子标记结果的前
DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2013.02.019
提［14］．根据 Li et al［15］的 ISSR反应体系重复试验，结果并不理想．考虑到反应体系会直接影响研究结果，
本实验室拟研究获得高质量水松基因组 DNA的方法，探讨建立适合于水松的 ISSR-PCR反应体系，为水松
分子标记和遗传多样性研究提供参考．
1 材料与方法
1．1 供试材料
实验材料于 2008 年 12 月至 2009 年 3 月采自于水松主要分布区福建屏南、三明、南平、福州、江西弋
阳、广东斗门等地，共 9 个居群，合计 100 株．每个居群根据其分布情况随机选取代表性样株，每样株间隔
距离至少 5 m以上，将采集的每株幼嫩叶片装入自封袋中，用硅胶干燥保存，在实验室用液氮处理后，－ 40
℃冷冻保存．
1．2 主要仪器和试剂
主要仪器:高速离心机(Beckman Avanti30 Centrifuge) ，紫外分光光度计(WFZ800-D3B) ，Thermo PCR
(GebeAmpTM PCR Stystm 9700) ，紫外凝胶成像系统(Gel Doc 2000TM)．
主要试剂:dNTP、Buffer(10 × PCR Buffer)、Marker D501A、Ex Taq DNA聚合酶购自宝生生物工程有限
公司;随机引物和 ISSR引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司;Tris、HCl、EDTA、CTAB、NaCl、β-巯
基乙醇、硼酸、PVPP、乙醇、氯仿、异戊醇等均为国产分析纯试剂．
1．3 实验方法
1．3．1 水松基因组 DNA 提取 ①取 0． 5 g 水松嫩叶放入液氮中研磨成粉，在研磨过程中，加入适量
PVPP，转入 1．5 mL离心管中，加入 800 μL 65 ℃的 2 × CTAB提取液(100 mmol·L －1 Tris-HCl pH 8．0，1．4
mol·L －1 NaCl，20 mmol·L －1 EDTA，2% CTAB) ，另加入 16 μL 5% β-巯基乙醇，充分混匀，放在 65 ℃水浴
保温 30 － 60 min(每隔 15 min摇匀 1 次) ;②加入 600 μL 氯仿—异戊醇(24∶ 1) ，颠倒混匀，在 12000 r·
min －1离心 5 min，将水相转入另一离心管;③重复第 2 步，即用氯仿 －异戊醇(24∶ 1)再抽提一次;④在水相
中加入 1 /5 体积 5 mol·L －1 NaCl，再加入 2 /3 体积冰冷的异丙醇，轻轻混匀后，置于 － 20 ℃ 30 min，然后
10000 r·min －1离心 5 min收集沉淀;⑤将沉淀用 75%乙醇洗 2 次，在室温下自然风干 4 － 10 min;⑥将此
沉淀溶于合适体积(50 － 100 μL)0．1 × TE 缓冲液(1．0 mmol·L －1 Tris-HCl pH 8．0，0．1 mmol·L －1 EDTA
pH 8．0) ，－ 20 ℃保存或 4 ℃待用．
1．3．2 水松基因组 DNA的检测 将提取的 DNA样品适当稀释，在紫外分光光度计上测定 D260 nm和 D280 nm
处的吸收值，计算 DNA样品浓度．采用 1%琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像系统下拍照，检测 DNA 完整
性和 RNA消化情况．
表 1 ISSR-PCR体系的正交试验设计
Table 1 Orthogonal design for ISSR-PCR
编号
dNTP
mmol·L －1
模板
ng
Taq DNA聚
合酶 /U
引物
μmol·L －1
dd H2O
μL
Buffer
μL
1 0．12 30 1．0 0．08 6．9 2．0
2 0．12 40 1．5 0．10 5．5 2．0
3 0．12 50 2．0 0．12 4．2 2．0
4 0．15 30 1．5 0．12 6．0 2．0
5 0．15 40 2．0 0．08 5．3 2．0
6 0．15 50 1．0 0．10 4．3 2．0
7 0．18 30 2．0 0．10 5．8 2．0
8 0．18 40 1．0 0．12 4．8 2．0
9 0．18 50 1．5 0．08 4．1 2．0
1．3．3 ISSR-PCR反应体系的正交优化 选
用正交设计方案优化反应体系(表 1)． 表中
编号即正交试验设计的 9 个处理，以采自福
州森林公园的水松 DNA 为模板，引物为 811
号(GAGAGAGAGAGAGAGAC) ，反应总体积
为 20 μL，反应体系中含有 2．0 μL 10 × buffer
缓冲液和相应体积的 ddH2O
［16 － 19］．
PCR反应所用程序为:94 ℃预变性 5
min，94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延
伸 1．5 min，循环 35 次，最后在 72 ℃延伸 10
min，4 ℃保存．
2 结果与分析
2．1 DNA提取结果
经过提取与优化的水松基因组 DNA呈米白色絮状和无色透明沉淀，电泳结果呈均一条带，说明提取
·951·第 2 期 郑世群等:孑遗植物水松基因组 DNA提取及 ISSR反应体系建立
的 DNA较纯，基本去除了蛋白质、多糖和酚类等杂质(图 1)．水松基因组 DNA的 D260 nm与 D280 nm的比值在
1．75 － 1．85 范围内，说明 DNA纯度较高，符合要求．
2．2 ISSR反应体系确定
图 2 为正交试验扩增结果，由于 Taq DNA 聚合酶、引物、dNTP 和 DNA 浓度不同，处理效果存在较大
差异．
图 1 DNA电泳检测图
Fig． 1 The result of genomic DNA gel electrophoresis
泳道 1 － 9 的扩增条件与表 1 编号相对应．
图 2 ISSR-PCR正交试验扩增结果
Fig． 2 The orthogonal design results of ISSR-PCR
dNTP浓度过高会导致聚合酶的错误掺入，浓度过低又会影响合成效率，甚至会过早消耗而使产物单
链化，影响扩增结果．在 PCR反应中，dNTP浓度对扩增效果影响较明显，当 dNTP浓度为 0．18 mmol·L －1
时，扩增条带较少，特异性也不强;当 dNTP浓度为 0．12 mmol·L －1时，扩增条带明显增多，且谱带很亮．故
选择 dNTP浓度为 0．12 mmol·L －1 ．
DNA模板含量是制约扩增产物得率及特异性的一个重要因子，模板含量过低，分子碰撞几率低，偶然
性大，扩增产物无或不稳定;模板含量过高，又会相应增加非特异性产物的扩增．水松 ISSR-PCR反应体系
对 DNA模板含量许可范围较大，30 － 50 ng·μL －1均可扩增出条带．因此，30 ng 的模板 DNA 即可满足扩
增需要．
在 PCR反应中，Taq DNA聚合酶使用量也是影响实验的重要因素．高浓度 Taq DNA聚合酶不仅成本
高，且易产生非特异性扩增产物;Taq DNA聚合酶浓度过低会导致产物合成效率下降．由表 1 和图 2 可知，
在 20 μL反应体系中，使用 2．0 U Taq DNA聚合酶扩增的条带最清晰，且数量最多，则选择的 Taq DNA聚
合酶的终浓度为 2．0 U·μL －1 ．
在 PCR反应中，引物浓度过低会导致扩增量不足，条带很少;浓度过高，会产生新的位点．即选择引物
浓度为 0．12 umol·L －1 ．
表 2 ISSR-PCR反应成分用量
Table 2 Composition of reaction on ISSR-PCR
组分 母液浓度 用量 /μL 终浓度
Taq DNA聚合酶 5 U·μL －1 0．4 2．0 U·μL －1
Buffer 10 × 2．0 1 ×
MgCl2 25 mmol·L －1 2．0 2．0 mmol·L －1
dNTP 1．0 mmol·L －1 1．2 0．12 mmol·L －1
Primer 2．0 mmol·L －1 1．2 0．12 umol·L －1
模板 DNA 10 ng·μL －1 3．0 30 ng·μL －1
ddH2O 10．2
在参考前人研究基础上［18］将 Mg2 +浓度定位
于 2．0 mmol·L －1，Buffer用量定位于 2．0 μL．所以
在 20 μL的 ISSR体系中，各反应成分用量见表 2．
由实验结果可得，水松 ISSR 扩增最佳反应
系:1 × Buffer 缓冲液，2．0 U Taq DNA 聚合酶，0．
12 mmol·L －1 dNTP，0． 12 umol·L －1引物，DNA
模板 30 ng·μL －1，dd H2O补足至体积为 20 μL．
反应循环参数:94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30
s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1．5 min，循环 35 次，
72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存．
2．3 ISSR-PCR的扩增结果
筛选出的 10 条 ISSR引物对不同种源水松共扩增出 95 条谱带(表 3) ，其中多态性条带 39 条，多态性
条带百分率为 39．98% ．平均每条引物扩增出 9．5 条谱带和 3．9 条多态性条带．引物 873 扩增出的条带最
多(13 条) ，其多态性条带为 54．0%;引物 840 扩增出的条带最少(7 条) ，多态性为 28．57% ．
·061· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷
表 3 筛选出的引物及其扩增结果
Table 3 The sequence of 10 primers and amplified results
引物号 碱基序列 扩增谱带总数 /条 多态性谱带数 /条 多态带百分率 /%
811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 10 4 40．00
873 GACAGACAGACAGACA 13 7 54．00
815 CTCTCTCTCTCTCTCTG 10 5 50．00
857 ACACACACACACACACYG 8 2 25．00
841 GAGAGAGAG AGAGAGAYC 9 2 22．22
840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 7 2 28．57
880 GGAGAGGAG AGGAGA 8 4 50．00
872 GATAGATAGATAGATA 10 4 40．00
856 ACACACACACACACACYA 10 4 40．00
813 CTCTCTCTCTCTCTCTT 10 5 50．00
3 讨论
DNA模板质量直接影响 DNA分子标记的分析结果．水松植物富含多酚和多糖，但不同发育时期存在
较大差异，且居群间差异较大． 因此，总结出一种普遍适用的基因组 DNA 提取方法较困难． 运用改良
CTAB法提取成年植株新鲜嫩叶的 DNA，其 DNA纯度高、质量好，可以直接用于 DNA分子标记．
有关 ISSR-PCR反应体系优化的报道较多，但大部分研究采用简单梯度试验方法对每个因素的最佳
水平进行摸索，需进行多次梯度试验，试验过程繁琐，且不能兼顾到各因素间的交互作用，对试验结果判断
缺少量化，缺乏一定标准．本实验采用的正交试验设计具有均衡分散、综合可比、效用明确的特点，确立了
适合水松 ISSR-PCR反应体系，试验结果的稳定性高、重复性好．
参考文献
［1］韩丽娟，胡玉熹，林金星，等．中国特有植物水松的生物学特性及其保护［J］．长春师范学院学报，1996，3(2) :29 － 35．
［2］韩丽娟，胡玉熹，林金星．水松的次生韧皮部解剖及其系统位置的讨论［J］．植物分类学报，1997，35(6) :527 － 532．
［3］斯缨，王日韦，龚复俊，等．水松叶的总黄酮含量研究［J］．武汉植物学研究，2003，21(6) :547 － 549．
［4］李发根，夏念和．水松地理分布及其濒危原因［J］．热带亚热带植物学报，2004，12(1) :13 － 20．
［5］郑世群，刘金福，吴则焰，等．我国特有孑遗植物水松濒危原因及其保护对策［J］．亚热带农业研究，2011，7(4) :1 － 4．
［6］吴则焰，刘金福，洪伟，等．孑遗植物屏南水松种群空间分布格局［J］．亚热带农业研究，2008，4(1) :36 － 40．
［7］吴则焰，刘金福，洪伟，等．屏南水松天然林主要种群直径分布规律研究［J］．林业勘察设计，2008(1) :4 － 8．
［8］郑世群，刘金福，吴则焰，等．屏南水松天然林主要种群的种间竞争［J］．福建林学院学报，2008，28(3) :216 － 219．
［9］刘金福，洪伟，吴则焰，等． 孑遗植物水松(Glyptostrobus pensilis)种群生命表和谱分析［J］． 武汉植物学研究，2008，26
(3) :259 － 263．
［10］吴则焰，刘金福，洪伟，等．孑遗植物水松(Glyptostrobus pensilis)数量性状间的相关聚类分析［J］．北华大学学报:自然科
学版，2009，10(4) :358 － 361．
［11］吴则焰，刘金福，洪伟，等．孑遗植物水松(Glyptostrobus pensilis)种群优势度增长规律研究［J］．武汉植物学研究，2009，
27(4) :387 － 390．
［12］ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D． Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymer-
ase chain reaction amplification［J］． Genomics，1994，20(2) :176 － 183．
［13］TALHINHAS T，NEVES-MARTINS J，LEITO J． AFLP，ISSR and RAPD markers reveal high levels of genetic diversity a-
mong Lupinus ssp．［J］． Plant Breeding，2003，122(6) :507 － 510．
［14］唐燕琼，吴紫云，郭建春，等．柱花草 DNA提取及 ISSR反应体系的正交优化［J］．热带作物学报，2008，29(3) :352 －357．
［15］Li F G，Xia N H． Population structure and genetic diversity of an endangered species，Glyptostrobus pensilis (Cupressaceae)
［J］． Botanical Bulletin of Academia Sinica，2005，46(2) :155 － 162．
［16］沈永宝，施季森，赵洪亮．利用 ISSR DNA标记鉴定主要银杏栽培品种［J］．林业科学，2005，41(1) :202 － 204．
［17］杨传平，魏利，姜静，等．应用 ISSR-PCR对西伯利亚红松 19 个种源的遗传多样性分析［J］．东北林业大学学报，2005，
33(1) :1 － 3．
［18］彭云滔，唐绍清，李伯林，等．野生罗汉果遗传多样性的 ISSR分析［J］．生物多样性，2005，13(1) :36 － 42．
［19］KOJMA T，NAGAOKA T，NODA K． Genetic linkage map of ISSR and RAPD markers in Einkom wheat in relation to that of
RFLP markers［J］． Theor Appl Genet，1998，96(1) :37 － 45．
(责任编辑:吴显达)
·161·第 2 期 郑世群等:孑遗植物水松基因组 DNA提取及 ISSR反应体系建立