全 文 ：第 27卷 第 7期
2 0 1 0 年 7 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
JournalofShenyangPharmaceuticalUniversity
Vol.27 　No.7
Jul.2010 p.516
收稿日期:2009-11-20
基金项目:辽宁省教育厅项目(No.2009A685);沈阳市科技局项目(No.1091144-9-00)
作者简介:刘丽霞(1983-), 女(汉族), 山东威海人 , 硕士研究生 , E-mailliulx83@163.com;孙立新(1967-), 女(满
族),辽宁新宾人 , 副教授 ,主要从事药物分析学研究 , Tel.024-23986365, E-mailslx04@163.com。
文章编号:1006-2858(2010)07-0563-04
HPLC法测定中药了哥王中伞形花内酯的含量
刘丽霞 1 , 赵　挺2 , 孙立新 1
(1.沈阳药科大学 药学院 , 辽宁 沈阳 110016;2.辽宁省药物研究院 ,辽宁 沈阳 110015)
摘要:目的 建立测定了哥王中伞形花内酯(umbelliferone)含量的 HPLC法。方法 色谱柱:伊利特-
C18柱(200mm×4.6mm, 5 μm), 流动相:甲醇-水-四氢呋喃-冰乙酸(体积比为 20.0∶75.0∶5.0∶
0.6),检测波长:324nm, 柱温:40 ℃,流速:1.0mL·min-1。结果 伞形花内酯质量浓度在 0.6 ～ 24.0
mg·L-1内线性关系良好(r=0.999 8)。伞形花内酯的平均回收率为 98.5%, RSD为 1.9%。结论
该方法适用于了哥王药材的质量控制。
关键词:了哥王;高效液相色谱法;伞形花内酯;含量测定
中图分类号:R917　　　文献标志码:A
　　了哥王是瑞香科荛花属植物了哥王 [ Wikstro-
emiaindica(L.)C.A.Mey]的根茎 ,其味苦性寒 、
微辛 、有毒 ,具有清热解毒 、化痰散结 、消肿止痛等
作用 ,临床应用于呼吸道 、泌尿道 、皮肤等感染 ,疗
效较好 ,对肝炎 、肝硬化 、肾炎等有一定作用 [ 1] ,
近年来药理研究证实了哥王具显著抗肿瘤活
性 [ 2] 。了哥王药材化学成分复杂 ,文献报道主要
有香豆素类 、黄酮类 、木脂素类 、皂苷类等 ,伞形花
内酯是香豆素类化合物 ,具有抗肿瘤[ 3-4] 、抗炎镇
痛 [ 5] 、抗惊厥 [ 6]等作用 。目前有关了哥王药材中
伞形花内酯的含量测定未见报道 ,本文作者采用
RP-HPLC法测定其在了哥王中的含量 ,对完善了
哥王药材质量控制标准提供依据。
1　仪器与材料
依利特 HPLC仪(大连依利特分析仪器有限
公司), N3000色谱工作站(浙江大学智能信息研
究所), TG332A分析天平 (湘仪天平仪器厂),
KQ-100型超声仪 (昆山市超声波仪器有限公
司), QE100药材粉碎机(浙江省武义县屹立工具
有限公司 )伞形花内酯 (本实验室自制 , 经
1H-NMR、13C-NMR谱和 MS确证结构 ,化学结构式
见图 1, HPLC法测得质量分数大于 99.0%),甲
醇(色谱纯 , 山东禹王实业有限公司禹城化工
厂),乙腈(色谱纯 ,山东禹王实业有限公司禹城
化工厂 ), 水 (纯净水 , 杭州娃哈哈集团有限公
司),其余试剂(分析纯 ,市售)。
了哥王药材 9批 ,均为市售品 ,由沈阳药科大
学孙启时教授鉴定为瑞香科荛花属植物了哥王
(Wikstroemiaindica(L.)C.A.Mey.)。
Fig.1　Structureofumbeliferone
2　方法与结果
2.1　对照溶液的制备
取伞形花内酯约 3 mg,精密称定 ,置 50 mL
量瓶中 ,用体积分数为 80%的甲醇溶液溶解并稀
释至刻度 ,摇匀 ,得 60.0 mg·L-1的伞形花内酯储
备液 。精密量取伞形花内酯对照品储备液
0.5mL至 10mL量瓶中定容 ,即得 3.00 mg·L-1
的伞形花内酯对照溶液。
2.2　供试溶液的制备
取了哥王干燥药材细粉(过 250 μm筛)约
2 g,精密称定 ,置于圆底烧瓶中 ,加氯仿 60 mL,
于 70℃水浴中回流提取 3次 ,每次 3 h。趁热过
滤 ,合并滤液 ,水浴蒸干 ,所得浸膏用体积分数为
80%甲醇溶解并定容于 10 mL量瓶中 ,摇匀 ,经
0.45μm微孔滤膜滤过 ,取续滤液为供试溶液 。
2.3　色谱条件
色谱柱:依利特 -C18柱 (200 mm×4.6 mm,
DOI :10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2010.07.008
5 μm),流动相:甲醇 -水 -四氢呋喃 -冰乙酸(体积
比为 20.0∶75.0∶5.0∶0.6),检测波长:324 nm,柱
温:40 ℃,流速:1.0 mL·min-1 ,进样量:20μL。
2.4　色谱系统适用性试验
在上述色谱条件下 ,理论板数按伞形花内酯
计 ,均不低于 8 000。伞形花内酯与相邻组分峰的
分离度均大于 1.5,拖尾因子均在 0.95 ～ 1.05之
间 。色谱图见图 2。
1—Umbeliferone
Fig.2　Chromatogramsoftheumbeliferone(A)and
sample(B)
2.5　线性关系考察
精密量取伞形花内酯储备液 0.1、0.2、0.5、
1.0、2.0、4.0mL,分置 10mL量瓶中 ,用体积分数
为 80%的甲醇溶液稀释至刻度 ,制成伞形花内酯
质 量 浓 度 为 0.6、 1.2、 3.0、 6.0、 12.0、
24.0mg·L-1的系列标准溶液。分别精密吸取上
述溶液各 20μL,注入 HPLC仪 ,记录色谱图。以
溶液的质量浓度(ρ/(mg·L-1)为横坐标 ,峰面积
(A)为纵坐标 ,绘制标准曲线 ,伞形花内酯 A=
3.375 ×104 ρ+2.121 ×103 , 相关系数 r=
0.999 8。结果表明伞形花内酯质量浓度在 0.6 ～
24.0mg·L-1内与峰面积的线性关系良好 。
2.6　精密度试验
精 密 吸 取 伞 形 花 内 酯 对 照 溶 液
(3.00 mg·L-1)20 μL,按 “2.3”条色谱条件连续
进样 6次 ,记录色谱峰面积 ,计算伞形花内酯峰面
积的 RSD为 1.9%,表明仪器精密度良好。
2.7　重复性试验
称取干燥了哥王药材细粉(No.7)约 2 g,精
密称定 ,按 “ 2.2”条供试溶液制备方法 ,平行制备
6份供试溶液 ,精密吸取 20 μL,按 “2.3”条色谱
条件进样分析 ,记录伞形花内酯色谱峰面积。计
算伞形花内酯含量的平均值为 14.7 ×10-3%,
RSD为 2.0%。结果表明方法的重复性良好。
2.8　稳定性试验
取供试品溶液(No.7),室温放置 ,分别于 0、
2、4、8、10、12、24h进样 20 μL,记录色谱峰面积。
计算伞形花内酯峰面积的 RSD为 2.2%。结果表
明供试品溶液在室温下 24 h内保持稳定。
2.9　回收试验
取已知含量的干燥了哥王药材细粉(No.7)
约 1.0g(伞形花内酯含量为 14.7 ×10-3%),精
密称定 9份 ,分别加入低 、中 、高 3个质量浓度的
对照溶液 (分别相当于药材原有含量的 50%、
100%、150%),每个质量浓度 3份 ,按 “ 2.2”条供
试溶液制备方法制备供试溶液 ,测定含量 ,计算其
平均回收率 , 伞形花内酯的平均回收率为
98.5%, RSD为 1.9%(n=9),结果见表 1。
Table1　Recoveriesofthemethod
Markercompound morigin/μg madded/μg mfound/μg Recovery/% x/% RSD/%
14.73 7.0 21.57 98.2
14.70 7.0 21.65 99.1
14.74 7.0 21.37 95.6
14.70 15.0 29.65 99.5
Umbelliferone 14.69 15.0 29.92 101.3 98.5 1.9
14.71 15.0 29.41 98.0
14.70 22.0 36.87 100.7
14.72 22.0 36.18 97.6
14.73 22.0 35.92 96.5
2.10　样品测定
称取 9个产地的干燥了哥王药材细粉 2.0g,
精密称定 ,按 “2.2”条供试溶液制备方法制备供
试溶液 ,按 “ 2.3”条色谱条件进样分析 ,计算伞形
564 沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 27卷　
花内酯的含量 ,结果见表 2。
Table2　ContentsofumbelliferoneinWikstroemiaindica
(L.)C.A.Mey.(n=3)
No. Source w(umbelliferone)/%(×10-3) RSD/%
1 Guizhou 5.42 4.5
2 GuangxiWuzhou 6.71 3.2
3 Jiangxi 5.46 3.5
4 Guangzhou 17.5 1.9
5 GuangxiGuilin 14.7 2.4
6 Guangxi 12.4 2.7
7 Guangdong1 14.7 2.1
8 Guangdong2 22.0 1.0
9 BoughtinShenyang 15.8 1.5
3　讨论
a.分别试用 3个流动相系统:甲醇-水-冰醋
酸 、甲醇-质量分数为 0.2%磷酸 、甲醇-醋酸铵缓
冲液(pH=3.2),结果冰醋酸改善峰形的效果良
好 。为使主峰保留时间适宜且与各干扰峰的分离
度符合要求 ,又在流动相中加入四氢呋喃 ,改善了
分离效果 ,并具有良好的分离度。最终选择甲醇 -
水 -四氢呋喃 -冰醋酸(体积比为 20.0∶75.0∶5.0∶
0.6)的流动相系统 。
b.取方法的选择:采用加热回流提取法考
察了甲醇 、乙酸乙酯 、氯仿的提取效率 ,结果表明 ,
氯仿 、甲醇的提取率均较高 ,考虑到甲醇提取的供
试溶液中伞形花内酯色谱峰干扰严重 ,故选择氯
仿作为提取溶剂。以氯仿作为提取溶剂 ,考察了
超声提取法 、索氏回流提取法和加热回流提取法 ,
结果加热回流法伞形花内酯的提取更完全 。采用
正交试验设计 ,选择溶剂倍量 、提取时间和提取次
数作为考察因素 ,每个因素各进行 3个水平考察 ,
采用 L9(34)正交表进行实验设计的优选 ,通过直
观分析和方差分析 ,最后确定伞形花内酯的提取
方法为 30倍量氯仿加热回流提取 3次 ,每次 3 h。
c.本文作者测定了 9批不同产地的了哥王
中伞形花内酯的含量 ,由表 2可知 ,伞形花内酯为
不同产地了哥王的共有成分 ,但其含量差异较大。
其中 ,广东产地的含量最大为 22.0 ×10-3%,而
贵州产地的含量最小为 5.42×10-3%。
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Determinationofthecontentofumbeliferonein
Wikstroemiaindica(L.)C.A.MeybyHPLC
LIULi-xia1 , ZHAOTing2 , SUNLi-xin1
(1.SchoolofPharmacy, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016, China;2.LiaoningAcade-
myofPharmaceuticalIndustry, ShenYang110015, China)
Abstract:ObjectiveTodeterminethecontentofumbeliferoneinWikstroemiaindica(L.)C.A.Mey.
MethodsAnassaymethodwasdevelopedforthedeterminationofthecontentoftheumbeliferoneinthe
Wikstroemiaindica(L.)C.A.Mey.ItwasseparatedonanEliteC18ODS(200mm×4.6 mm, 5μm)column
withthemobilephaseconsistingofamixtureofmethanol-water-THF-aceticacid(V∶V∶V∶V=20.0∶75.0∶
565第 7期 刘丽霞等:HPLC法测定中药了哥王中伞形花内酯的含量
5.0∶0.6), andUVdetectionwavelengthwassetat324nm, attheflowrateof1.0mL·min-1 , andthecol-
umntemperaturewassetat40 ℃.ResultsThelinearrangeswas0.6-24.0μg·mL-1(r=0.999 8)forum-
beliferone.Theaveragerecoverywas98.5% withRSDof1.9% .ConclusionsThemethodisaccurate,
sensitivewithgoodreproducibilityandcouldbeusedforthedeterminationofthecontentofumbeliferonein
Wikstroemiaindica(L.)C.A.Mey..
Keywords:Wikstroemiaindica(L.)C.A.Mey.;HPLC;umbeliferone;contentdetermination
(上接第 550页)
过它的结构 ,可是理化数据很少 ,尤其没有光谱数
据 。根据以上化学反应和波谱数据可确定该化合
物 为 4-甲 氧 基-3-羟 基 苯 酚 (4-methoxyl-3-
hydroxyphenol),为一新的天然产物。
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Chemicalconstituentsfrom theFolium Artemisiae
Argyi(Ⅱ)
JIShuang1 , LUGui-rong2 , MENGDa-li1 , LINing1 , LIXian1
(1.SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016,
China;2.TiexiWomanandInfantHospitalofShenyang, Shenyang110023, China)
Abstract:ObjectiveToisolatetheconstituentsofFoliumArtemisiaeArgyiandidentifytheirstructures.
MethodsThecompoundswereisolatedbychromatographyonsilicagelcolumn, SephadexLH-20, prepara-
tiveTLCandrecryztalization, andidentifiedonthebasisofphysico-chemicalconstantsandspectralanaly-
sis.ResultsTencompoundswereidentifiedasisotanciloide(1), umbeliferone(2), daphnetin(3), eriodicty-
ol(4), rhamnetin(5), hispidulin(6), L-2-O-methyl-chiro-inositol(7), stigmasterol(8), daucosterol(9)and
4-methoxyl-3-hydroxyphenol(10).ConclusionsCompound10 isanewlydiscoverednaturalproduct, and
compounds1-5 and7 arefirstlyisolatedfromFoliumArtemisiaeArgyi.
Keywords:FoliumArtemisiaeArgyi;chemicalconstituent;structureidentification
566 沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 27卷