全 文 ：收稿日期:2009-06-17
基金项目:辽宁省教育厅项目(No.2009A685);沈阳市科技局项目(No.1091144-9-00)
作者简介:刘丽霞(1983-), 女(汉族), 山东威海人 , 硕士研究生 , E-mailliulx83@163.com;孙立新(1967-), 女(满
族),辽宁抚顺人 , 副教授 ,博士 , 主要从事药物分析学研究 , Tel.024-23986365, E-mailslx04@163.com。
文章编号:1006-2858(2010)05-0369-04
HPLC法同时测定了哥王中芹菜素和山奈酚的含量
刘丽霞1 , 刘　薇 1 , 张春玲2 , 孙立新 1 , 齐　伟1
(1.沈阳药科大学 药学院 , 辽宁 沈阳 110016;2.沈阳红药制药有限公司 ,辽宁 沈阳 110044)
摘要:目的 建立同时测定了哥王中芹菜素和山奈酚含量的方法。方法 采用 HPLC法。 色谱柱为
DiamonsilC18柱 (250mm×4.6mm, 5 μm),流动相为甲醇-体积分数为 0.4%磷酸-四氢呋喃(体积
比 40∶50∶10), 流速为 1.0 mL·min-1 , 检测波长为 365 nm, 柱温为 35 ℃。结果 芹菜素和山奈酚质
量浓度分别在 3.00 ～ 60.0mg·L-1、0.347 ～ 6.94 mg·L-1内与峰面积呈良好的线性关系 , 平均回收
率分别为 100.2%(RSD=0.95%)和 99.4%(RSD=1.0%)。结论 该方法准确 ,重复性好 ,适用于
了哥王药材的质量控制。
关键词:了哥王;高效液相色谱法;芹菜素;山奈酚;含量测定
中图分类号:R917　　　文献标志码:A
　　了哥王(Wikstroemiaindica(L.)C.A.Mey.)
又名南岭荛花 、山豆了等 ,始载于 《岭南采药录 》,
为瑞香科荛花属植物 ,分布于我国广东 、广西 、福
建 、贵州等省区。了哥王性寒味苦 、微辛 ,有毒 ,具
有清热解毒 、化痰散结 、消肿止痛之功效 ,临床用
于呼吸道 、泌尿道 、皮肤等感染的治疗 ,疗效较好 ,
对肝炎 、肝硬化 、肾炎等有一定作用 [ 1] ,近年来药
理研究证实了哥王具有显著抗肿瘤活性 [ 2] 。了
哥王主要成分为香豆素 、木脂素 、黄酮 、皂苷类等。
黄酮类成分中芹菜素 、山奈酚苷元为首次从了哥
王中分离得到 ,皆为抗肿瘤的有效成分。吕武清
等 [ 3]采用 HPLC法测定了哥王片中西瑞香素含
量;梁勇等 [ 4]采用 GC-MS法测定了哥王中挥发油
类成分;张美玲等 [ 5]采用分光光度法测定了哥王
片中总黄酮的含量;熊友香等[ 6]采用电感耦合等
离子发射光谱法测定了哥王药材中微量元素的含
量 。目前尚未见对了哥王药材中芹菜素和山奈酚
含量测定的报道 。作者采用 HPLC法建立同时测
定了 哥 王 中 芹 菜 素 (apigenin)和 山 奈 酚
(kaempferol)(化学结构式见图 1)含量的方法 ,并
对不同产地的了哥王药材中这两种成分进行了含
量测定 ,力求为提高了哥王药材的质量控制水平
提供实验数据。
Fig.1　Structuresofapigenin(A)andkaempferol(B)
1　仪器与材料
LC-6A高效液相色谱仪 、SPD-6A紫外检测器
(日本 Shimadzu公司 ), ANASTAR色谱工作站
(天津奥特塞恩斯仪器有限公司), TG332A分析
天平(湖南长沙湘仪天平仪器厂), KQ-100超声
仪(江苏昆山超声波仪器有限公司), QE100药材
粉碎机(浙江武义屹立工具有限公司)。
芹菜素 、山奈酚对照品(自制 ,纯度质量分数
均大于 99.0%),甲醇 、乙腈(色谱纯 ,山东禹王实
业有限公司禹城化工厂),水 (娃哈哈饮用纯净
水),其余试剂(分析纯 ,市售)。
第 27卷 第 5期
2 0 1 0 年 5 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
JournalofShenyangPharmaceuticalUniversity
Vol.27 　No.5
May.2010 p.369
了哥王药材 9批 ,均为市售品 ,由沈阳药科大
学孙启时教授鉴定为瑞香科荛花属植物了哥王
(Wikstroemiaindica(L.)C.A.Mey.)。
2　方法与结果
2.1　色谱条件的选择及系统适用性试验
色谱柱:DiamonsilC18柱 (250 mm×4.6 mm,
5 μm);流动相:甲醇 -体积分数为 0.4%磷酸水溶
液 -四氢呋喃(体积比 40∶50∶10);流速:1.0 mL·
min-1;检测波长:365 nm;柱温:35 ℃;进样量:20
μL。
在上述色谱条件下分析 ,理论塔板数按芹菜
素 、山奈酚计算均不低于 6 000 ,芹菜素 、山奈酚与
相邻组分峰的分离度均大于 1.5,拖尾因子均在
0.95 ～ 1.05之间 。色谱图见图 2。
1—Apigenin;2—Kaempferol
Fig.2　HPLCchromatogramsofreferencesubstance(A)andsample(B)
2.2　溶液的制备
2.2.1　混合对照储备液
取芹菜素对照品约 6.0 mg, 精密称定 , 置
10 mL量瓶中 ,用适量甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇
匀 ,制成质量浓度为 600.0mg·L-1的芹菜素对照
储备液 Ⅰ 。取山奈酚对照品约 8.4 mg,精密称
定 ,置 100 mL量瓶中 ,用适量甲醇溶解并稀释至
刻度 ,摇匀 ,制成质量浓度为 84.0 mg·L-1的山奈
酚对照储备液 Ⅱ , 4 ℃备用 。精密量取对照储备
液 Ⅰ 5.0mL、Ⅱ 4.0mL,置 50 mL量瓶中 ,用甲醇
稀释至刻度 ,摇匀 ,制成芹菜素 、山奈酚质量浓度
分别为 60.0、6.72mg·L-1的混合对照储备液。
2.2.2　供试溶液
取了哥王干燥药材细粉(过孔径为 0.25 mm
筛)约 2 g,精密称定 ,用 30倍量石油醚回流提取
2 h,脱脂后挥干石油醚;将脱脂后了哥王药材放
入合适的滤纸套筒内 , 置于 150 mL索氏提取器
中 ,加入体积分数为 70%甲醇溶液 60 mL, 于
90 ℃恒温水浴下回流 4 h, 抽滤 , 以体积分数为
70%甲醇洗涤残渣 ,合并滤液 ,减压蒸干;残渣用
15 mL甲醇溶解 ,加入体积分数为 5%盐酸溶液
5 mL,摇匀 ,水浴回流 1 h,放冷 [ 7] ;用 1 mol·L-1
氢氧化钠溶液调至 pH值约为 6,减压蒸干 ,残渣
用体积分数为 70%的甲醇溶解并转移至 25 mL
量瓶中 ,稀释至刻度 ,摇匀 ,用 0.45 μm微孔滤膜
过滤 ,取续滤液即得供试溶液。
2.3　线性关系考察
精密量取混合对照储备液 0.5、 1.0、 2.0、
4.0、8.0、10.0 mL,分别置 10 mL量瓶中 ,用甲醇
定容 ,得系列标准混合对照溶液 。分别精密吸取
系列标准混合对照溶液进样分析 ,记录色谱图。
分别以对照溶液的质量浓度(ρ, mg·L-1)为横坐
标 ,峰面积(A)为纵坐标 ,绘制标准曲线 。芹菜素
回归曲线方程为 A=5.495×103ρ-5.089×103 ,
r=0.999 6;山奈酚回归曲线方程为 A=5.888 ×
10
4ρ-9.626 ×103 , r=0.999 2。结果表明 ,芹菜素 、
山奈酚质量浓度分别在 3.00 ～ 60.0mg·L-1、0.347 ～
6.94mg·L-1内与峰面积呈良好的线性关系。
2.4　精密度试验
取同一混合对照溶液 ,芹菜素 、山奈酚的质量
浓度分别为 12.0、1.39 mg·L-1 ,按 “2.1”条色谱
条件连续进样 6次 ,记录色谱峰面积 。计算芹菜
素 、山奈酚峰面积的 RSD分别为 0.48%、1.8%,
表明仪器精密度良好 。
2.5　重复性试验
取了哥王干燥药材细粉(No.6)约 2 g,精密
称定 ,按 “2.2.2”条制备供试溶液 ,平行制备 6份 ,
按 “2.1”条色谱条件进样分析 ,记录芹菜素 、山奈
酚色谱峰面积 。计算芹菜素 、山奈酚含量的平均
值分别为 149.3、 13.26 μg·g-1 , RSD分别为
370 沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 27卷　
0.90%、1.8%,表明方法的重复性良好 。
2.6　稳定性试验
取供试溶液(No.6),室温放置 ,分别于 0、2、
4、8、12、24h,按 “ 2.1”条色谱条件进样分析 ,记录
色谱峰面积 。计算芹菜素 、山奈酚峰面积的 RSD
分别为 1.8%、2.8%,结果表明供试溶液室温放
置 24h内稳定 。
2.7　回收率试验
称取已知含量的了哥王干燥药材细粉
(No.6)约 1.0 g(芹菜素 、山奈酚含量分别为
141.0、12.63μg·g-1),共 9份 ,精密称定 ,分别加
入低 、中 、高 3个质量浓度的对照溶液(分别相当
于药材原有含量的 50%、100%、150%),每一质
量浓度取 3份 ,按 “ 2.2.2”条制备供试溶液 ,在
“2.1”条色谱条件进行分析 ,记录色谱图 ,计算回
收率 , 结果见表 1。芹菜素的平均回收率为
100.2%, RSD为 0.95%(n=9);山奈酚的平均回
收率为 99.4%, RSD为 1.0%(n=9),表明回收
率试验符合要求 ,方法的准确度良好 。
Table1　Recoveriesofapigeninandkaempferol(n=9)
Component morigin/μg madded/μg mfound/μg Recovery/% Averagerecovery/% RSD/%
Apigenin 141.1 75.0 217.0 101.1
141.0 75.0 214.9 98.6
141.0 75.0 216.4 100.6
141.0 150.0 292.0 100.6
141.0 150.0 290.6 99.7 100.2 0.95
141.1 150.0 293.1 101.3
141.1 210.0 352.7 100.8
141.0 210.0 351.9 100.4
141.0 210.0 348.7 98.9
Kaempferol 12.64 7.00 19.64 100.0
12.62 7.00 19.49 98.1
12.63 7.00 19.57 99.2
12.63 12.50 25.12 99.9
12.63 12.50 25.13 100.0 99.4 1.0
12.64 12.50 25.32 101.5
12.64 19.50 31.86 98.6
12.63 19.50 31.97 99.2
12.62 19.50 31.83 98.5
2.8　供试品含量测定
取 9个产地的了哥王干燥药材细粉各 2.0g,
精密称定 ,按 “ 2.2.2”条制备供试溶液 ,按 “2.1”
条色谱条件进样分析 ,计算芹菜素 、山奈酚的含
量 ,结果见表 2。
Table2　Contents(c)ofapigeninandkaempferolindifferentregions(n=3)
No. Region Aapigeninc/(μg·g-1) RSD/%
Kaempferol
c/(μg·g-1) RSD/%
1 Guizhou 67.98 1.1 10.91 1.5
2 GuangxiWuzhou 295.4 0.72 — —
3 Jiangxi 393.3 0.75 9.615 1.8
4 Guangzhou 78.75 1.0 14.01 0.92
5 GuangxiGuilin 178.0 0.33 10.65 0.87
6 Guangxi 141.1 0.80 12.63 0.75
7 Guangdong1 202.4 0.41 63.74 0.70
8 Guangdong2 324.9 0.29 22.91 1.2
9 BoughtinShenyang 178.4 0.61 18.49 2.0
371第 5期 刘丽霞等:HPLC法同时测定了哥王中芹菜素和山奈酚的含量
3　讨论与结论
a.芹菜素在 269、337 nm处 ,山奈酚在 266、
365 nm处有最大紫外吸收。比较 270、337、360
和 365 nm波长对样品含量测定的影响 ,芹菜素 、
山奈酚对 365 nm波长较灵敏 ,且杂质干扰较少 ,
故确定检测波长为 365 nm。
b.试用甲醇-磷酸 、乙腈-磷酸洗脱系统 ,二者
对色谱峰的分离无明显差异 ,故选择经济的甲醇
系统 ,加入磷酸抑制了峰形的拖尾现象 ,但改变流
动相配比芹菜素 、山奈酚二组分仍不能完全分离 ,
在流动相中加入四氢呋喃 ,改善了分离效果 ,并具
有良好的分离度 。又比较磷酸 、冰醋酸等改性剂 ,
结果磷酸改善峰形的效果更好 。再调整流动相比
例 ,选用甲醇 -体积分数 0.4%磷酸 -四氢呋喃(体
积比 40∶50∶10)时 ,样品中待测成分分离效果较
好 。
c.比较回流提取法 、超声提取法和索氏提取
法 ,结果超声提取法提取不完全 ,待测组分含量
少 。回流提取法与索氏提取法二者含量接近 ,但
回流提取的样品杂质干扰较严重 ,故采用索氏提
取法。考察甲醇 、无水乙醇作提取溶剂 ,甲醇的提
取率高 ,又考察体积分数为 50%、 70%、 90%甲
醇 ,选择提取率高的体积分数为 70%甲醇。
d.若不经水解 ,各产地药材中测得的山奈酚
含量低 ,这与文献中报道的了哥王中山奈酚大多
以苷的形式存在相一致[ 8] ,故采用水解方法提取
山奈酚 。考察不同比例的甲醇-体积分数 5%盐
酸(体积比 2∶1、3∶1、4∶1)水解条件 ,当甲醇 -体积
分数 5%盐酸(体积比 3∶1)时 ,水解完全 ,因此采
用甲醇 -体积分数 5%盐酸(体积比 3∶1)水解 。
e.实验结果 ,了哥王中芹菜素含量明显高于
山奈酚 。不同产地了哥王中两种黄酮苷元含量有
明显差异 ,其中广东产地的了哥王中芹菜素和山
奈酚含量均较高 ,贵州 、广西产地的了哥王中二者
含量偏低 ,而广西梧州 、江西产地的了哥王中芹菜
素含量较高 ,山奈酚含量较低 ,可能与药材的产
地 、采收时间和采收部位有关。
f.室温在 30℃左右时 ,若设置柱温箱温度在
30℃以下 ,则柱温不稳定 ,温度不能保持在设置
的温度下 ,因此选择 35 ℃,既可以保持柱温箱温
度稳定 ,又可以保证待测成分的分离效果良好 。
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Determinationof2-ethylhexanoicacidresidueinβ-
lactamantibioticsbycapilaryGC
YINGGuo-hong, LIJun, DENGYing, LIUMin
(ShenzhenInstituteforDrugControl, Shenzhen518029, China)
Abstract:ObjectiveToestablishaGCmethodfordeterminationof2-ethylhexanoicacidinβ-lactamantibi-
otics.MethodsPEGwasusedforthestationaryphaseofthecapilarycolumn, thehydrogenflameionization
detector(FID)andinjectortemperaturewere250 ℃ and200 ℃;temperature-programmedofcolumnand
3-cyclohexylpropionateasinternalstandardwereusedforGC.ResultsThecalibrationcurvesof2-ethylhex-
anoicacidshowedgoodlinearityintherangeof0.301-3.01 g·L-1(r=0.999 7).Itwasaaccuratemeth-
od;thequantitativelimitwas16.9 ng, therecoveryoftheninekindsofantibioticsweremorethan94%.
ConclusionsThismethodissimple, accurateandcanbeusedfordeterminationof2-ethylhexanoicacidinβ-
lactamantibiotics.
Keywords:β-lactamantibiotics;2-ethylhexanoicacid;GC
(上接第 372页)
Simultaneous determination of apigenin and
kaempferolintheWikstroemiaindica(L.)C.A.
Mey.byHPLC
LIULi-xia1 , LIUWei1 , ZHANGChun-ling2 , SUNLi-xin1 , QIWei1
(1.SchoolofPharmacy, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016 , China;2.Shenyang
HongyaoPharmaceuticalCo., Ltd., Shenyang110044 , China)
Abstract:ObjectiveToestablishanHPLC methodforsimultaneousdeterminationofapigeninand
kaempferolinWikstroemiaindica(L.)C.A.Mey..MethodsThechromatographicmethodwascariedout
onaDiamonsilC18 column(250 mm×4.6 mm, 5 μm)withthemobilephaseconsistingofamixtureof
methanol-0.4% phosphoricacid-tetrahydrofuran(V∶V∶V=40∶50∶10).TheUVdetectionwavelengthwas
setat365nm.Theflowratewas1.0 mL·min-1 andthecolumntemperaturewassetat35℃.ResultsThe
linearrangeswere3.00-60.0 mg·L-1(r=0.999 6)forapigeninand0.347-6.94 mg·L-1(r=0.999 2)
forkaempferol.Theaveragerecoveriesforapigeninandkaempferolwere100.2% and99.4% withRSD
0.95% and1.0%, respectively.ConclusionsThemethodisaccurate, sensitivewithgoodreproducibilityand
canbeusedforthedeterminationofthecontentsofapigeninandkaempferolinWikstroemiaindica(L.)C.
A.Mey..
Keywords:Wikstroemiaindica(L.)C.A.Mey.;HPLC;apigenin;kaempferol;contentdetermination
384 沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 27卷