全 文 ：转 Bt 基因棉花主要抗虫黄酮类化合物时空
动态的 HPLC分析 3
张永军　郭予元　吴孔明 3 3 　王武刚
(中国农业科学院植物保护研究所 ,北京 100094)
【摘要】　棉花植株中的黄酮类化合物是重要的抗病虫害物质. 运用高效液相色谱技术 ,对转 Bt 基因棉花
主要抗虫黄酮类化合物的种类、含量和时空动态进行了初步探讨. 结果表明 ,棉花组织中主要抗虫黄酮类
化合物 (包括异槲皮苷、芸香苷和槲皮素等)能够用 HPLC 方法检测并进行定量 ;异槲皮苷、芸香苷和槲皮
素的含量均以花瓣中最高 ,花萼、苞叶和棉铃中较少 ;棉花生长中后期顶端嫩叶中抗虫黄酮类化合物的含
量明显高于苗期. 不同组织不同生长期的主要抗虫黄酮类化合物含量有一定的差异 ,所起的抗虫作用也有
所不同.
关键词 　转 Bt 基因棉花 　黄酮类化合物 　HPLC 　时空动态
文章编号 　1001 - 9332 (2003) 02 - 0246 - 03 　中图分类号 　S435. 622 　文献标识码 　A
HPLC analysis of main flavonoid chemicals and their spatio2temporal dynamics in Bt transgenic cotton.
ZHAN G Yongjun , GUO Yuyuan , WU Kongming , WAN G Wugang( Institute of Plant Protection , Chinese A2
cademy of A gricultural Sciences , Beijing 100094 , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2003 ,14 (2) :246～248.
Flavonoids are important chemicals of resistance to pests in cotton plant . The main flavonoid chemicals and their
spatio2temporal dynamics of content in Bt transgenic cotton were tested by HPLC. The results showed that the
flavonoid chemicals of resistance to pests mainly including rutin , isoquercitrin and quercetin could be detected and
quantitatively analyzed by HPLC. The contents of rutin , isoquercitrin and quercetin were the highest in petal ,
but lower in calyx , bract and cotton boll. Moreover , the total content of flavonoid chemicals in top leaf was
much higher at developmental stage than at seedling stage. The content of each flavonoid chemicals of resistance
to pests was different during different developmental stage and in different organs. It was indicated that different
flavonoid chemicals played different roles in resistance to pests.
Key words 　Bt transgenic cotton , Flavonoid chemicals , HPLC , Spatio2temporal dynamics.
3 国家自然科学基金 (39770498)和国家重点基础研究发展规划资助
项目 ( G2000016208) .3 3 通讯联系人.
2001 - 02 - 16 收稿 ,2001 - 04 - 16 接受.
1 　引 　　言
黄酮类化合物大量存在于高等植物中 ,许多黄
酮类是植保素. 所有的植食性昆虫至少在幼虫阶段
都不可避免地与这些物质发生联系. 从棉花植株中
分离出的很多黄酮类化合物对昆虫具有毒性或阻食
作用 ,比较著名的如棉花组织中的芸香苷、槲皮素和
异槲皮苷等. 芸香苷等黄酮类物质能够抑制棉铃虫
和美洲烟芽夜蛾生长及化蛹[1 ,3 ,6 ] ,而且对棉花叶螨
也有一定的抗虫性[5 ] . 为了协调利用 Bt 杀虫蛋白和
棉花抗虫黄酮类化合物 ,充分发挥转 Bt 基因棉花黄
酮类化合物的抗虫潜力 ,本文利用高效液相色谱
(HPLC)技术 ,对转 Bt 基因棉花主要抗虫黄酮类化
合物种类、含量以及时空动态进行了初步研究 ,以期
对培育棉花抗虫品种、设计转 Bt 基因棉田害虫综合
治理方案提供一定的理论依据.
2 　材料与方法
211 　材料及处理方法
新棉 33B (DP5415 的转 Bt 基因棉花) 由美国孟山都远
东有限公司提供 ; GK2 (泗棉 3 号的转 Bt 基因棉花) 由中国
农业科学院生物技术研究所提供 ;中棉所 30 (中棉所 16 的
转 Bt 基因棉花)由中国农业科学院棉花研究所提供. 供试棉
花在中国农业科学院植物保护研究所试验田种植 ,试验小区
随机区组排列 ,生长期不使用任何农药 ,不打顶 ,不摘边心 ,
其它为常规管理.
各个品种 (系)的棉花在生长的 7 个时期 (三叶期、七叶
期、蕾期、花期、花铃期、铃期、吐絮期) 分别取顶端初展开的
嫩叶 (顶叶) 、小蕾 (直径约 0. 5 ～0. 7 cm) 、花瓣、花柱、花萼、
苞叶、小铃 (直径约 1. 2 cm) ,用液 N2 快速冷冻并在冷冻干
燥机上 ( - 80 ℃)冻干 ,研成粉后过 0. 177 mm 孔径筛 , - 20
℃冰箱保存备用. 分别称取样品冻干粉 50 mg ,置于具塞离
心管中 ,然后在离心管中加入 5 ml 70 %的甲醇水并封口 ,将
离心管摇匀 ,放在 20 ℃水浴锅中轻微振动 24 h ,提取液以
2800 ×g 离心 15 min ,取上清液抽滤 (过 0. 45μm 滤膜)在液
相色谱仪上进样.
212 　色谱分析条件
仪器 :惠普 HP21100 高效液相色谱仪 ( HPLC) ;色谱柱 :
应 用 生 态 学 报 　2003 年 2 月 　第 14 卷 　第 2 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Feb. 2003 ,14 (2)∶246～248
ZORBAX SB2C18 ,规格为 4. 6 mm ×250 mm ;流动相 :A2重蒸
甲醇 ,B2磷酸二氢钾缓冲液 (p H 4. 5) ,梯度洗脱 ;检测波长 :
260 nm ;流速 :1. 2 mm·min - 1 ;柱温 :30 ℃;标准样品 :儿茶
素 ( Fluk) 、芸香苷 ( Sigma) 、槲皮素 ( Sigma) 、异槲皮苷 ( Sig2
ma) . 进样量 20μl.
3 　结果与分析
311 　抗虫黄酮类化合物的 HPLC 分离效果
　　由图 1 可以发现 ,棉花组织中的黄酮类化合物
得到比较好的分离 ,分离峰窄而高 ,各峰间保留时间
差异较明显. 在本试验条件下 3 类已知有抗虫活性
的黄酮类化合物 ———异槲皮苷、芸香苷和槲皮素的
保留时间分别是 32. 50、35. 00 和 40. 20 min.
图 1 　棉花组织中黄酮类化合物液相色谱 ( HPLC)分离图谱
Fig. 1 HPLC spectrogram of flavonoids chemicals in Bt transgenic cot2
ton.
1.儿茶素 Catechin ,2. 异槲皮苷 Isoquercitrin ,4. 芸香苷 Rutin ,10. 槲
皮素 Quercetin ,其余未知 Others were not identified. 流动相 Mobile
phase :A2重蒸甲醇 A2MeOH ,B2磷酸二氢钾缓冲液 (p H4. 5) B2KH22
PO4 buffer solution (p H4. 5) ;洗脱梯度 Gradient elution : 0 %A , 100 %
B(开始) →10 %A ,90 %B (10min 内) →70 %A ,30 %B (30min 内) →
100 %A ,0 %B(15 min 内) from 0 %～10 % A in 10min , from 10 %～
70 % A in 30min ,from 70 %～100 % A in 15min ,solution B changed re2
spectively.
312 　黄酮类物质的组织分布和时空动态
31211 黄酮类物质的组织分布 　被研究的 3 个抗虫
棉品种组织中能够用 HPLC 检测到异槲皮苷、芸香
苷和槲皮素和其它几种未知黄酮类化合物 ,儿茶素
含量较低 ,只在一些组织中可检测出. 33B 棉株顶端
嫩叶中芸香苷占主导地位 , 平均占总黄酮量的
35. 29 % ,异槲皮苷次之 ,占 21. 75 % ,槲皮素最少仅
占 0. 35 % ,其它黄酮类占 42. 61 % ;中棉所 30 棉株
顶端嫩叶中异槲皮苷占主导地位 ,平均占总黄酮量
的 29. 11 % ,芸香苷占 24. 13 % ,槲皮素占 0. 303 % ,
其它黄酮类占 46. 46 % ; GK2 棉株顶端嫩叶中芸香
苷占主导地位 ,平均占总黄酮量的 37. 38 % ,异槲皮
苷次之占 27. 00 % ,槲皮素占 0. 58 % ,其它黄酮类占
35. 05 %. 由图 2 可见 ,在花铃期被研究的 3 个抗虫
棉品种组织器官中 ,异槲皮苷、芸香苷和槲皮素的含
量均以花瓣中最高 ,顶端嫩叶、蕾次之 ,花柱、花萼、
苞叶和铃较少 ,尤其是槲皮素在花萼、苞叶和铃中几
乎检测不到. 抗虫黄酮类的这种组织分布形式 ,可能
是造成棉花生长后期棉铃虫幼虫喜欢在田间取食
铃、花柱和蕾的原因之一.
31212 黄酮类物质在顶端嫩叶中的时空动态 　由图
2可见 . 转Bt基因棉花品系不同时期顶端嫩叶中芸
图 2 　抗虫棉不同生长时期顶叶及花铃期各组织中黄铜类化合物的
分布
Fig. 2 Distribution of flavonoid chemicals in top leaves at different devel2
opmental stage and in different organs at flower2boll stage of cotton .
1) 3 叶期 32true leaves stage , 2) 7 叶期 72true leaves stage , 3) 蕾期
Square stage ,4)花期 Flower stage ,5) 花铃期 Flower2boll stage ,6) 铃
期 Boll stage ,7)吐絮期 Boll opening stage. a ,b ,c) 各时期顶端嫩叶
Top leaves of every stage. Ⅰ. 顶叶 Top leaves , Ⅱ. 蕾 Square , Ⅲ. 花瓣
Petal , Ⅳ. 花柱 Style , Ⅴ. 花萼 Calyx , Ⅵ. 苞叶 Bract , Ⅶ. 棉铃 Boll. d ,
e ,f)花铃期各组织 Tissues at flower2boll stage.
7422 期 　　　　　　　　　张永军等 :转 Bt 基因棉花主要抗虫黄酮类化合物时空动态的 HPLC 分析 　　　　　　　　　　
香苷表达量呈现一定的时空变化 :33B 在蕾期有一
高峰 ,花期有所下降 ,花铃期又出现一高峰 ,铃期、吐
絮期逐渐下降 ;中棉所 30 和 GK2 均是 7 叶期有一
降低 ,蕾期最高 ,以后逐渐降低. 异槲皮苷的时空变
化趋势是 :33B 7 叶期有一高峰 ,花期有所下降 ,花
铃期逐渐上升 ,并在花铃、吐絮期达到又一高峰 ;中
棉所 30 和 GK2 在花期有一高峰后逐渐降低. 本试
验条件下 3 个转 Bt 基因棉花品种在蕾期以前检测
不到槲皮素的含量 ,蕾期后才有所合成.
4 　讨 　　论
　　棉花抗虫黄酮类化合物是棉花防御机制的重要
部分. 不同的黄酮类化合物所发挥的作用是不同的.
棉株中的芸香苷、槲皮素和异槲皮苷是典型的具有
抗虫作用的黄酮类化合物 ,而儿茶素等另一些黄酮
类物质对棉铃虫等鳞翅目害虫几乎没有抗虫作用.
在棉花花瓣中的黄酮类物质极高 ,远远超过了其它
组织中的含量 ,它的生物学意义可能不只是限于对
植食性害虫的防御 ,而主要是作为色素起到了与环
境的联系作用. 另外 ,不同时期和不同组织中抗虫黄
酮类化合物含量有一定的差异. 所以 ,在研究棉花黄
酮类化合物的抗虫性时 ,不宜笼统地将总黄酮类物
质含量作为一个衡量指标 ,而应明确具有抗虫活性
黄酮类物质的种类和含量以及在棉花植株中的时空
分布.
　　初步研究表明 ,转 Bt 基因棉花中后期的抗虫黄
酮类物质的含量较苗期高 ,但分布不均衡. 在花柱和
棉铃中抗虫黄酮类化合物分布较少 ,这种组织分布
形式 ,可能是造成棉花生长后期棉铃虫幼虫喜欢在
田间取食花柱和棉花幼铃的原因之一. 因此 ,在选育
抗虫棉花品种时 ,一方面应当培育整个生长期抗虫
黄酮类物质含量均较高的品系 ;另一方面也应注意
选育那些棉花花柱和棉铃中含较多抗虫黄酮类物质
的植株 ,以增强这些组织器官的抗虫性能 ,从而最大
程度地降低虫害所造成的经济损失. 最近有研究报
道 ,间苯二酚等植物多酚与 Bt 毒蛋白合用 ,不仅降
低了棉铃虫幼虫的取食及体重增加 ,还提高了 Bt 毒
蛋白的毒力[4 ] . Garry 等[2 ]报道 ,棉花花青苷等黄酮
类物质能够增加 Bt 毒蛋白的功效. 因此 ,培育富含
抗虫黄酮类物质的转 Bt 基因抗虫棉或者通过一定
的措施诱导转 Bt 基因抗虫棉株中抗虫黄酮类物质
的含量 ,对于持续保持转 Bt 基因棉花的抗虫优势和
延缓棉铃虫产生抗性有一定的实践意义.
参考文献
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cotton constitutents. Entomol Ex p A ppl ,24 (3) :294～300
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tween condensed tannin and Bt crystal protein in cotton. Acta
Gossypii S in (棉花学报) ,12 (6) :294～297 (in Chinese)
作者简介 　张永军 ,男 ,1970 年生 ,博士 ,副研究员 ,主要从
事昆虫与寄主植物的关系和转基因棉花生态安全性等方面
的研究 ,发表论文 10 余篇. E2mail :zgjwlx @163. com
842 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　14 卷