全 文 ：连续培养技术在微生态学研究中的应用*
曹郁生 (江西中德联合研究院, 南昌 330047)
摘要 对连续培养技术在微生态学研究中的应用及进展作了综述. 连续培养技术可用来建立体外模型
以模拟正常菌群的生态系统, 如人或动物的肠道菌群、口腔菌群等;用来研究正常菌群与病原菌之间的相
互作用, 菌群的生理生化特性及代谢产物.并可用于微生态制剂的研制和生产.
关键词 连续培养 正常菌群 微生态学
文章编号 1001- 9332( 2002) 01- 0629- 03 中图分类号 Q938. 1 文献标识码 A
Application of continuousflow culture in microecological research. CAO Yusheng ( Jiangx iOAI Gemeinsames
Institute, Nanchang 330047)Chin. J . A ppl . Ecol. , 2002, 13( 5) : 629~ 631.
The application of continuousflow culture in microbial ecology and its advances were reviewed. Continuousflow
culture can be used to build in vitr o models simulating ecosystems composed of normal bacteria such as human or
animals intestinal and buccal bacteria, to examine the interactions between normal bacter ia and pat hogens, to in
vestigate the physiological and biochemical traits of bacter ia and their metabolic products, and to develop microe
colog ical preparations.
Key words Continuousflow culture, Normal bacteria, M icroecology.
* 国家自然科学基金资助项目( 39760059) .
1999- 09- 22收稿, 1999- 11- 26接受.
1 引 言
20 世纪 50 年代初, Monod 等介绍了连续培养方法的基
本原理,使之在理论和实践上有了较大的应用和发展.后来,
T empest [ 19]对微生物的连续培养, 恒化培养从理论、工艺和
应用方面进行了较全面的综述介绍,随之又有许多研究和专
著问世, 使得这一技术得到进一步的发展和应用. 连续培养
技术主要用于微生物的生理生化研究,细胞和代谢产物的生
产,近年来已将这一技术用于动植物细胞的培养.
人和动物的正常菌群在宿主的生命活动中起着非常重
要的作用. 了解菌群与宿主、菌群中各种微生物间的相互作
用,以及调控这些活动的生态机制, 是人们长期以来致力研
究的一个重要领域.人类肠道菌群种类浩繁, 约有 400 多种,
互相作用极为复杂,直接在体内研究观察这一复杂的群体,
在目前尚有许多困难, 因而应用体外模型或实验动物, 是目
前采用的主要手段. 20世纪 80 年代, 无菌动物、悉生动物以
及连续培养技术开始先后被用于正常菌群的研究,下面就连
续培养技术 ( continuousflow culture, CF ) 在微生态学研究
中的应用情况做一介绍.
2 连续培养技术在微生态学研究中的应用
21 用于模拟人和动物体内正常菌群生态系统.
Veilleux和 Row land [ 20]用大鼠肠道菌群接种两级连续
培养系统, 在体外模拟大鼠肠道菌群. 通过比较体内和连续
培养系统中的菌群组成结构,认为应用这一方法在体外能满
意地模拟大鼠肠道生态系统, 形成和体内相似的后肠菌群.
这个体外培养系统还可反映出不同种的大鼠在菌群结构上
的差异.
Fr eter等[ 5]认为连续培养系统可作为体外生态模型, 成
功的模拟小鼠大肠菌群.在这个系统中, 再显了小鼠大肠中
多种细菌及其相互作用,这可从以下几方面得到了证实: 1)
用 37 种特异荧光抗血清染色涂片计数证明, 从常规小鼠肠
道菌群中分离的 37 种严格厌氧菌, 同样存在于用小鼠肠道
菌群接种的连续培养系统中, 并以相同的方式保持数量平
衡; 2)用小鼠肠道菌群接种的连续培养物可以抑制 E . coli
的生长,其抑制水平与从常规小鼠肠道直接分离的菌群一
样; 3)给无菌小鼠饲喂连续培养物,可以调整小鼠在无菌环
境中产生的反常变化, 如盲肠增大, E . coli 的数量增加等. 连
续培养物还可在玻璃反应器的壁上形成厚层菌膜 ,正如细菌
在大肠粘膜上生长一样,当这一层细菌消失, 培养物不复表
现其互相作用的特点.
Bearne等[ 2]用人粪便接种两级连续培养系统作为结肠
细菌的体外模型, 用以研究肠道细菌在物质代谢中的作用.
连续培养物保持了接种物的细菌学和生物化学特性:严格厌
氧菌为主要类型, 水解酶的活性与粪便样品中一样, 而还原
酶则表现了较高的活性. 连续培养物中的短链脂肪酸种类几
乎与粪便样品中一样, 其含量大小的顺序也保持一致.
许多研究者利用连续培养技术成功的对瘤胃微生物进
行了研究, 进一步揭示了其中主要微生物之间的相互作用及
其生理和代谢特点[ 13, 17, 2 1] . Weimer 等[ 21]用连续培养方法
研究了几种瘤胃微生物在体外对纤维素的降解作用及其生
理生化特性.
2 2 用于研究正常菌群与病原菌间的相互作用
人和动物的正常菌群具有抑制排除病原菌的功能.但在
应 用 生 态 学 报 2002 年 5 月 第 13 卷 第 5 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, May 2002, 13( 5)!629~ 631
研究二者的相互作用时, 由于采取的体外培养方法不同, 结
果往往大相径庭,难能正确反映体内的情况[ 7] . 如拟杆 1 菌
在体外培养时,对弗氏志贺氏菌( S hegella f lexner i)有强烈的
抑制作用,但在小鼠大肠中却无作用[ 11] .
Wilson等[ 22]在悉生小鼠和连续培养系统中研究了仓鼠
盲肠菌群与艰难梭菌 ( Clos tr idium dif f icile )以及致病大肠
杆菌间的相互作用.连续培养系统和无菌小鼠先以艰难梭菌
和致病大肠杆菌接种培养,然后再用仓鼠盲肠菌群接种. 结
果证明, 无论在体内或体外连续培养系统中, 仓鼠盲肠菌群
可以明显的抑制这两种病原菌(表 1~ 2) .
表 1 仓鼠盲肠菌群连续培养物、相联悉生鼠及仓鼠盲肠菌群相联
悉生鼠的作用比较
Table 1 Comparison of CF cul tures colonized by cecal flora of hamster,
gnotobiotic mice associated with CF culture contents, and gnotobiotic
mice associated with hamster flora
实验组别
Experiment groups
盲肠大小
(体重的%)
Cecal size(%
total body )
平均或每个盲肠
Mean( log10 CFU∀cecum or ml- 1)
大肠杆菌
E . col i
艰难梭菌
C. dif f i cil e
艰难梭菌和大肠杆菌双联悉生鼠 52 # 2 101 # 01 < 76# 01
M ice associa ted w ith C . dif f ici le and E . col i
仓鼠盲肠菌群连续培养物A 未检出 10
CF culture A
仓鼠盲肠菌群连续培养物相联悉生鼠 26# 02 62 # 03 < 25
CF cultureassociated mice
仓鼠盲肠菌群相联悉生鼠 27# 02 58 # 03 < 25
Homogenateassociated mice
仓鼠盲肠菌群连续培养物B 未检查 22
CF culture B
仓鼠盲肠菌群连续培养物相联悉生鼠 21 # 016 48 # 02 < 25
CF cultureassociated mice
仓鼠盲肠菌群相联悉生鼠 52# 03 18 # 01 < 25
Homogenateassociated mice
表 2 含不同菌群的厌氧连续培养物中大肠杆菌和艰难梭菌的数量
Table 2 Population size of E. coli and C. diff ici le in anaerobic CF cul
tures containing various flora
含不同菌群的连续培养物
CF cultures with various flora
培养物数
No. of
culture
平均Mean
( log10 CFU∀mL- 1)
大肠杆菌
E. col i
艰难梭菌
C. dif f icile
艰难梭菌 4 83 # 0 3
C. dif f icile
艰难梭菌和大肠杆菌 9 95 # 008 74 # 009
C. dif f icile and E. coli
艰难梭菌、大肠杆菌与仓鼠盲肠菌群 9 50 # 1 2 27 # 0 6
C. dif f icile and E. coli
Bassson 等[ 1]在连续恒化培养中, 证明了口腔微生物菌
群可以抑制白假丝酵母 ( Candida albicans ) 的生长. 连续培
养系统用舌部刮取物接种,经鉴定, 稳定状态时得到的连续
培养物主要由血链球菌( Str ep tococcus sanguis )、表兄链球菌(
S . sobrinus ) ,缓症链球菌 ( S . mitis )、干酪乳杆菌 ( L acto
bacillus casei)、砂真杆菌( Eubacterium sabur reum )、殊异韦龙
氏球菌 ( Veillonella dispar ) 和具核梭形菌 ( Fusobacter ium
nuclealum)等组成. 在连续培养达到稳定时接种白假丝酵
母,观察到白假丝酵母受到抑制并逐渐消失. Bernhardt [ 3]研
究了白假丝酵母在粪便菌群连续培养物中生长的情况, 白假
丝酵母在连续培养系统中明显受到菌群的抑制,无论用其高
浓菌悬液接种, 或其连续培养物持续流加,都不能生长.连续
培养在好氧条件下进行时, 可以观察到白假丝酵母生长, 数
天后仍被菌群抑制. 但当连续培养物被抗生素强烈抑制破坏
时, 可导致白假丝酵母旺盛生长.
Hillman 等[ 8]用连续培养系统对猪回肠的菌群进行了研
究, 认为 pH( 60~ 8 5)和溶解氧 ( 50 和 100mo l∀L - 1)的变
化,对需氧菌和厌氧菌总数量的影响较小. 在溶解氧为
50mol∀L - 1时, 乳杆菌和类大肠杆菌的比例和报导的体内
的比例相同. 回肠菌群连续培养物对产生内毒素引起仔猪腹
泻的大肠杆菌( E . coli O149!K88) ,有稳定而明显的抑制作
用. 这种大肠杆菌在单独培养时可达 4 ∃ 108cfu∀ml- 1, 当加
入回肠菌群共同培养时, 每天以 0 5log10 的速率下降 ,第 3
天降至 106cfu∀ml- 1 .
2 3 用于研究菌群的生理生化特性及代谢产物
正常菌群在体内进行复杂的代谢活动, 并产生多种代谢
产物如有机酸、蛋白质、酶等. 菌群在体外连续培养时, 同样
也会产生多种代谢产物.一些研究证实, 相同菌群在体外连
续培养时的代谢产物和体内的代谢产物基本相似 ,有些产物
如挥发性脂肪酸, 在种类、含量大小几乎一致[ 2, 4] .
笔者在美国曾对鸡盲肠菌群在厌氧连续培养系统中产
生的的挥发性脂肪酸( VFA )进行了分析, 发现当连续培养达
到稳定状态时, VFA 的种类, 如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁
酸、戊酸、异戊酸等及其含量相当稳定. Hume 等[ 9]研究了在
含14C 标记氨基酸的培养基中, 鸡盲肠菌群连续培养物
( CF3TM)的生长代谢,发现除了精氨酸外, 其他14C 标记的氨
基酸都代谢转化为乳酸、甲酸、乙酸、丙酸和丁酸,据此推论
当 CF3TM在小鸡体内定植后, 可以消耗生长限制性氨基酸,
从而降低沙门氏菌的感染.
成人体表油脂腺发达的部位, 如面部、背部、胸部也聚居
着一些菌群, 其中有些细菌如疮包丙酸杆菌 ( Prop ioni
bacter ium acnes )等可引起皮肤座疮. G reenman 等[ 6]利用连
续培养方法, 在不同稀释度下, 对 P. acnes、P . av idum 和
P. granulosum 的胞外酶、生物量进行了研究. 还有人在连
续培养系统中对一些病原菌, 如淋病奈氏球菌 ( Neisser ia
gonorrhoeae)、嗜肺军团菌( L egionella pneumophila)的生理、
形态、毒力等特性进行了研究[ 10~ 12] .
2 4 用于微生态制剂的研制
连续培养技术可以用来筛选需要的菌群. 在连续动态的
培养环境中, 由于营养条件、微生物相互作用等因素,有些细
菌被抑制洗脱, 有些则保留下来, 经过一定阶段达到相对平
衡,即稳定状态 ( steady state) . 当连续培养物达到稳定状态
时,可得到组成相当稳定的菌群. N isbet 等[ 14]利用这一方
法,用鸡盲肠内容物接种连续培养系统, 得到了可以有效地
控制雏鸡沙门氏菌感染的竞争抑制培养物.
连续培养技术可以有效地保持菌群的活力和特性. N is
bet等[ 15]分别用连续培养5、30、100 和365d, 和连续培养5d,
然后在- 70%C 保存 180d 的鸡盲肠菌群培养物给雏鸡接种,
发现这些培养物都可显著增加雏鸡盲肠内丙酸含量,对沙门
630 应 用 生 态 学 报 13卷
氏菌具有同样稳定的竞争排除作用[ 15] . 还有人报道了将连
续培养技术用于连续生产一些含活菌的乳制品,如酸奶、鲜
奶酪的研究[ 16, 18] .
3 结 语
和批量培养相比,连续培养方法具有自己的优点, 这种
动态的方法也许更接近生命活动过程.因而将这一方法应用
于微生态学研究,能够得到有意义的发现.
参考文献
1 Basson NJ, Van Wyk CW. 1996. T he establishment of a community
of oral bacteria that cont rols the grow th of Cand ida albicans in a
chemostat . Or al M icrobiol and I mm unol , 11( 3) : 199~ 202
2 Bearne CA, Mallett AK, Row land IR. 1990. In: Parish WE, Hard
GC eds. Proceeding of the Second Internat ional Conferen ce in v it ro
T oxicology. 522~ 525
3 Bernhardt H, Wollmer A, Zimmormann K et al . 1995. Growth of
Candida albicans in normal an d altered fecal f lora in the model of
cont inuous flow culture. Mycoses , 38( suppl. 1) : 22~ 27
4 Corrier DE, Hinton AJR, Ziprin RL, et al . 1990. Ef fect of dietary
lactose on cecal pH, bacteriostatic volat ile fat ty acids, and
Salmonella typ himurium colonizat ion of broiler ch icks. A v ian
Dis , 34: 617~ 625
5 Freter R, Stauffer E, Cleven D, et al . 1983. Cont inuous flow cul
tures as in v i tr o models of the ecology of large intestinal flora. In
f ecti on and I mm uni ty, 39( 2) : 666~ 675
6 Greenman J, H olland KT . 1985. Effect s of dilut ion rate on biomass
and ext racellular enzyme product ion by three species of cutaneous
Propionibacter ia grow n in cont inuous culture. J G en Microbiol ,
131: 1619~ 1624
7 Hentges DJ, Freter R. 1962. In vi v o and in v it ro antagonism of
intest inal bacteria against Shigella f lex neri & Correlat ion be
tw een various test . J I nf ect Di s, 110: 30~ 37
8 Hillman K, Murdoch TA, S pencer RJ, et al . 1994. Inhibition of
enterotoxigenic Escheri chia col i by the microflora of the porcine, in
an in v it ro sem icont inuous culture system. J Appl Bacteriol , 76:
294~ 300
9 Hume ME, Nisbet DJ , Deloach JR. 1997. In vi t ro 14Camino acid
fermentat ion by C F3TM , a characterized cont inuous flow compet i
t ive ex clusion culture of caecal bacteria. J A ppl M icrobiol , 83 ( 2) :
236~ 242
10 Keevil CW, Major NC, Davies DB, et al . 1986. Physiology and
virulence determinants of Nei sseria gonor rhoeae grow th in glu
cose, oxygenor cystinelimited cont inuous culture. J G en Microbi
ol , 132: 3289~ 3302
11 Maier BR, Onderdonk AB, Russell MS, et al . 1972. Shigella , in
digenous flora interactions in mice. A m J Clin Nut , 25: 1433 ~
1440
12 Mauchline WS, Araujo R, Wait R, et al . 1992. Physiology and
morphology of L egionel la pneumophi lla in cont inuous culture at
low oxygen concent rat ion. J Gen Microbiol , 138: 2371~ 2380
13 Melville SB, M ichael TA, Macy JM . 1988. Pathway and sites for
energy conservat ion in the metabolism of glucose by Selenomonos
r uminantium. J Bacteriol , 170: 5298~ 5304
14 Nisbet DJ, Corrier DE, Deloach JR. 1993. Ef fect of mixed cecal
microflora maintained in continuous culture and of dietary lactose on
Salmonel la typhimu rium colonizat ion in broiler chicks. A vian
Diseases , 37: 528~ 536
15 Nisbet DJ, Corrier DE, Rick SC, et al . 1996. Maintenance of the
biological eff icacy in chicks of a caecal compet it ive exclusion culture
against salmonella by cont inuousf low fermentat ion. J Food Pr otect ,
59( 12) : 1279~ 1283
16 Ouellette V, Chevalier P, Lacroix C. 1994. Continuous fermenta
tion of supplem ented milk w ith immobil ized Bif idobac terium in
f ant is. Biotechnol T ech ni , 8( 1) : 45~ 50
17 Silley P, Armst rong DG. 1984. Changes in metabolism and cell size
of the anaerobic bacterium Selenomonas ruminan tium 0078A at
the onset of grow th in cont inuous culture. J Appl Bacteriol , 56:
487~ 492
18 SodiniGallot I, Gorrieu G, Boquien CY, et al . 1993. Process per
formance of cont inuous inoculat ion and acidification of milk w ith
immobilized lact ic acid bacteria. J Dairy Sci , 78( 7) : 1407~ 1420
19 T empest PW. 1970. Methods in Microbiology Vol 2. Lon don and
New York:Academic Press. 259~ 327
20 Veilleux BG, Row land I. 1981. Simulat ion of the rat intest inal e
cosystem using a tw ostage cont inuous culture system. J G en Mi
crobiol , 123: 103~ 115
21 Weimer PJ, Yan Shi, Odt CL. 1991. A segment gas/ liquid delivery
system for cont inuous culture of microorganisms on insoluble sub
strates and its use for growth of Ruminococcu s f lav ef acie ns on cel
lulose. App l M icrobiol Biotechn , 36: 178~ 183
22 Wilson KH , Freter R. 1986. Interact ion of Clost ridium dif f ici le
and Escheri chia coli w ith microfloras in cont inuousf low cultures
and gnotobiotic mice. Inf ection and I mm uni ty, 54( 2) : 354~ 358
23 Yan S, Weim er PJ. 1992. Response surface analysis of the ef fect s of
dilut ion rate and pH on Ruminococcus f lav ef aciens FD1 in cellu
losef ed cont inuous culture. App l Env ir on Microbiol , 50: 2583~
2591
作者简介 曹郁生, 男, 1946 年生, 硕士, 研究员. 1992 ~
1995 年在美国威斯康星大学生化系、细菌系学习工作,名誉
研究员. 主要从事微生方面的研究.在国内外发表论文 40 多
篇. Email: yysscao@ public. nc. jx. cn
6315 期 曹郁生:连续培养技术在微生态学研究中的应用