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山橿药材中主要有效成分含量的研究



全 文 :第 27卷 第 2期 河南大学学报(医学版) Vol.27 No.2
2008年 5月 JournalofHenanUniversity(MedicalScience) May2008
山橿药材中主要有效成分含量的研究
申桂芬 1* ,石磊 2 ,潘永峰 2 ,熊维政2
(1.北京羚锐伟业科技有限公司 ,北京 100073; 2.河南羚锐制药股份有限公司 , 河南 信阳 465550)
摘 要:目的:利用 RP-HPLC梯度洗脱的方法对山橿药材中主要有效成分进行了研究 , 为科学评价与有效控制
山橿药材质量提供了方法。方法:依利特 HypersilODS柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 以甲醇 -水(60% ~ 100%)非
线形梯度洗脱 , 体积流 1.0ml/min,柱温 30℃, 在 296nm波长下进行检测。测定 10批次山橿药材中银松素 、乔松
素和球松素的含量。结果:采用非线性梯度洗脱的方法可以同时控制 3种主要有效成分的含量 ,方法学考察表明
该方法具有较好的精密度 、重复性和稳定性。结论:采用的梯度洗脱方法测定有效成分的含量可以作为山橿质量
评价的重要依据。
关键词:山橿;高效液相色谱法;梯度洗脱
中图分类号:R927.2   文献标识码:A 文章编号:1672-7606(2008)02-0039-04
 收稿日期:2008-03-27
 作者简介:申桂芬(1981-), 女 ,河南省安阳市人 , 医学硕士 ,从事药品研究与开发工作。
StudyonthecontentsofmainefectivecomponentsinLinderareflexa
Hemsl
SHENGui-fen1* , SHILei1 , PANYong-feng1 , XIONGWei-zheng1
(1.BeijingLingruiHi-Tech.Co., Ltd., Beijing100073, China; 2.HenanLingruiPharmaceuticalCo., Ltd., Xinyang,
Henan465550, China)
Abstract:Objective: TostudythecontentsofmainefectivecomponentsinLinderareflexaHemslbyRP-HPLC
gradientelution, andtosupplyanewmethodforscientificestimateandefectivecontrol.Methods: Separationwas
performedonanEliteC
18
column(250 mm×4.6 mm, 5 μm), withmobilephaseconsistingofMeOH-H
2
O(60% ~
100%), withgradientelutionattheflowrateof1.0mL/min.Thedetectivewavelengthwas296nm, thecolumntemperature
was30 ℃.TenbatchesofL.reflexaHemslfromvariousproducingareaswerecomparativelyanalyzedtodeterminethe
contentsofmainefectivecomponents.Results: Thecontentsofthreemaineffectivecomponentsweresimultaneously
controledwithnonlineargradientselution.Theaccuracy, repeatabilityandstabilityofthismethodweresatisfied.
Conclusion: ThemethodcanbeusedforthequalitycontrolandspeciesidentifyingofL.reflexaHemsl.
Keywords:LinderareflexaHemsl;HPLC;Gradientelution
  山橿系樟科 Lauaceae山胡椒属植物山橿 Lindera
reflexaHemsl的干燥根 ,本品收载于 《河南省中药材
标准》[ 1] 。该药在清代 《植物名实图考》中曾有论述 ,
为灌木或小乔木 ,生于山坡边 、林缘或灌木丛中 。山
橿药材性温 、味辛 ,具有行气止痛 、健脾消积 、活血消
肿等作用[ 2] 。目前 ,山橿中黄酮类成分的测定方法
主要有薄层色谱法和高效液相色谱法等。其中 ,采用
薄层色谱法进行含量测定存在较多的困难 ,现在多采
用高效液相色谱法 [ 3] 。高效液相色谱法测定紫外吸
收较好的黄酮类成分时 ,具有灵敏度好 ,杂质干扰少
和检测限低等优点。因银松素 、乔松素和球松素含量
和极性差异较大 ,采用等度洗脱的方法不能同时测定
它们的含量 。本试验首次采用梯度洗脱的方法同时
测定山橿中极性差异较大的银松素 、乔松素和球松素
的含量 ,较文献报道的等度方法更有效分离待测组分
与杂质 ,具有简便 、快速 、准确 、有效等优点。
1 实验材料
1.1 仪器
日本 Shimadzu高效液相色谱仪(SIL-20A自动
DOI :10.15991/j.cnki.41-1361/r.2008.02.009
40  河南大学学报(医学版), 2008年 , 第 27卷第 2期
进样器 , LC-20AT泵 , SPD-20A紫外检测器 , CTO
-10ASVPCE柱温箱);ShimadzuLCSolution色谱工
作站;MetlerAG135电子天平(瑞士 Metler公司)。
1.2 试剂
色谱甲醇(江苏国达公司);分析甲醇(开封化学
试剂总厂),纯化去离子水(自制),并经 0.45 μm水
系滤膜滤过 。
1.3 试药和药材
银松素和乔松素对照品由河南中医学院生药实
验室陈随清教授惠赠;球松素对照品由河南省信阳市
药检所中药室潘永峰主任惠赠 。对照品 HPLC面积
归一化法检查 ,纯度均大于 99.0%;Dikma微孔滤膜
(0.45μm)。山橿药材来源于河南新县田铺山坡 、新
县江淮岭生态园山坡 、新县金兰山 、新县背冲山 、信阳
浉河港 、信阳鸡公山 、新县香山 、信阳商城等地方 ,药
材经信阳市药检所中药室潘永峰主任鉴定为正品 。
将药材依照实验要求粉碎 、储藏备用 。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用依利特 HypersilODS柱(250mm×4.6 mm,
5 μm),以甲醇 -水(60% ~ 100%)非线形梯度洗脱;
检测波长:296 nm;进样体积:10 μl;流速:1.0 ml/
min;柱温:30 ℃。进样前以流动相梯度初始条件平
衡 10min~ 15 min,流动相使用前经减压抽滤脱气。
2.2 样品溶液的制备
取山橿药材粉末约 1.0 g(过 20目筛 , 60 ℃干燥
至恒重),精密称定 ,置于 100 ml的具塞三角瓶中 ,精
密加入甲醇 50 ml,称定重量 ,超声 1 h,放冷后 ,取下
三角瓶密塞 ,再称定重量 ,用溶剂补足减失的重量 ,摇
匀 ,用干燥滤器滤过 ,精密量取续滤液 25 ml,转移至
50 ml容量瓶中 ,用甲醇 /水(70/30)定容至刻度 ,摇
匀 ,溶液用 0.45 μm滤膜滤过 ,弃去初滤液 ,取续滤
液 ,即得 ,置于 4℃冰箱保存 。
2.3 对照品溶液的制备
2.3.1 银松素对照品溶液的制备
精密量取银松素对照品 12.6 mg,置 10 ml量瓶
中 ,加色谱甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,即得 ,置于
4 ℃冰箱保存。
2.3.2 乔松素对照品溶液的制备
精密量取乔松素对照品 8.9 mg,置 10 ml量瓶
中 ,加色谱甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,即得 ,置于
4 ℃冰箱保存。
2.3.3 球松素对照品溶液的制备
精密量取球松素对照品 10.3 mg,置 10 ml量瓶
中 ,加色谱甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,即得 ,置于
4℃冰箱保存 。
2.3.4 混合对照品溶液的制备
精密量取已配置好的银松素 、乔松素 、球松素对
照品溶液 7.5ml, 2.5 ml, 7.5 ml,置于同一 50 ml量
瓶中 ,加色谱甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,即得其相应浓度
分别为 189.0 μg/ml, 44.5 μg/ml, 154.5 μg/ml,置于
4℃冰箱保存。精密量取混合对照品溶液 1.6 ml,
4ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml,分别置 10 ml量瓶中 ,加色谱
甲醇至刻度 ,摇匀 ,即得混合溶液中银松素 、乔松素 、
球松素不同浓度的混合对照品溶液 ,分别得浓度为
30.24 μg/ml, 7.12 μg/ml, 24.72 μg/ml混合对照品
溶液 1;浓度为 75.60μg/ml, 17.80μg/ml, 61.80μg/
ml混合对照品溶液 2;113.40 μg/ml, 26.70 μg/ml,
92.70 μg/ml混合对照品溶液 3;浓度为 151.20 μg/
ml, 35.60 μg/ml, 123.60 μg/ml混合对照品溶液 4;
浓度为 189.00μg/ml, 44.50μg/ml, 154.50μg/ml混
合对照品溶液 5,置于 4 ℃冰箱保存。
2.4 方法学考察[ 4]
2.4.1 系统适应性考察
同 “2.1HPLC色谱条件 ”项下 ,以混合对照品 2
进样 ,根据色谱参数计算系统适应性。银松素 、乔松
素和球松素的理论塔板数分别为 46466, 38163和
56848;分离度分别为 22.01, 9.87和 18.95;拖尾因子
分别为 1.02, 0.98, 1.05。
2.4.2 仪器梯度滞后时间的测定
用一零死体积连接器代替色谱柱 ,以甲醇为溶剂
A,含 0.1%丙酮的甲醇为溶剂 B, 检测波长为 296
nm,运行 0 ~ 100%B的线性梯度 ,梯度时间 20 min,
流速 1.0 ml/min,记录梯度图形 ,测定梯度曲线中间
点的时间 ,减去 10 min,测得该 ShimadzuLC-20A高
效液相色谱仪谱仪梯度滞后时间为 0.5min。
2.4.3 线性关系考察
分别将不同浓度的混合对照品溶液 1、2、3、4、5
依次连续进样 ,以对照品溶液的浓度为横坐标(X),
峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线 ,计算回归方程。
其线性方程分别为:
Y=75933.1X+48577.6(r=0.9999)30.24 ~
189.0 μg/ml。
Y=32361.5X-9459.9 (r=0.9999)7.12 ~
44.5 μg/ml。
Y=30499.6X-6435.0(r=0.9989)24.72 ~
154.5 μg/ml。
试验结果表明 ,银松素 、乔松素和球松素在各自
的线形范围内的线形关系良好 。
申桂芬 ,等:山橿药材中主要有效成分含量的研究 41 
2.4.4 精密度试验
同 “2.1 HPLC色谱条件”项下 ,连续进样 5次 ,
计算各对照品的峰面积和保留时间的相对标准偏差
(RSD),进行精密度考察。银松素的保留时间和峰面
积的 RSD%分别为 0.16%, 0.83%;乔松素的保留时
间和峰面积的 RSD%分别为 0.14%, 0.90%;球松素
的保留时间和峰面积的 RSD分别为 0.05%, 0.63%。
结果表明 ,银松素 、乔松素和球松素各自的保留时间
和峰面积的 RSD值符合要求 ,仪器的精密度良好。
2.4.5 稳定性试验
取 “田铺 ”的山橿药材(过 20目)约 1.0 g,精密
称定 ,按照 “ 2.2”项下的方法制备样品溶液。分别在
0 h, 3h, 6h, 12h, 18h, 24h, 36h, 48h测定 3种有效
成分的保留时间和峰面积 ,银松素的保留时间和峰面
积的 RSD分别为 0.18%, 0.68%;乔松素的保留时间
和峰面积的 RSD分别为 0.15%, 1.25%;球松素的保
留时间和峰面积的 RSD分别为 0.10%, 0.53%,结果
表明 ,样品溶液至少在 48h内是稳定的 。
2.4.6 重复性试验
取 “田铺 ”的山橿药材粉末 6份各约 2.0g,精密
称定 ,测定 3种有效成分的含量和保留时间 ,银松素
的保留时间和峰面积的 RSD分别为 0.16%, 1.55%;
乔松素的保留时间和峰面积的 RSD分别为 0.14%,
0.95%;球松素的保留时间和峰面积的 RSD分别为
0.12%, 0.69%,结果表明 ,各自的保留时间和峰面积
的 RSD值符合要求 ,说明该方法重复性良好。
2.4.7 加样回收率试验
取银松素 、乔松素和球松素含量分别为 7.9068
mg/g, 0.9882mg/g和 8.7028 mg/g的山橿药材粉末
(过 20目)5份(田铺样品)各约 0.5 g,精密称定 ,分
别置于 100ml的具塞三角瓶中 ,分别精密加入 1.26
mg/ml银松素对照品溶液 4.0 ml, 0.89 mg/ml乔松
素对照品溶液 1.0 ml和 1.03 mg/ml球松素对照品
溶液 5.0 ml,再分别精密加入甲醇 40 ml,称定重量 ,
超声 1 h,放冷后 ,取下三角瓶 ,密塞 ,再称定重量 ,用
溶剂补足减失的重量 ,摇匀 ,用干燥滤器滤过 ,精密量
取续滤液 25 ml,转移至 50 ml容量瓶中 ,用甲醇 /水
(70/30)定容至刻度 ,摇匀 ,溶液用 0.45 μm滤膜滤
过 ,弃去初滤液 ,取续滤液 ,即得 ,置于 4℃冰箱保存 。
测定 3种有效成分的含量 ,计算其 RSD,进行加样回
收率考察(表 1 ~表 3)。
  由以上试验结果表明 ,样品溶液的加样回收率
RSD符合加样回收率的要求 。
2.5 样品测定
取 10批山橿药材的粉末(过 20目)各约 1 g,精
密称定 ,用空白溶液和样品溶液比较 ,从图中可以看
出空白溶液对样品中各个成分没有影响 ,测定银松
素 、乔松素和球松素的含量 ,每批测定 3份 ,计算其含
量及 RSD(表 4 ~表 6,图 1 ~图 2)。
表 1 银松素的加样回收率试验结果
加入量(mg)测定量(mg)回收率(%) 平均值(%) RSD(%)
9.01 100.03
8.99 99.89
5.04 9.00 99.98 99.51 0.63
8.95 98.87
8.94 98.79
表 2 乔松素的加样回收率试验结果
加入量(mg)测定量(mg)回收率(%) 平均值(%) RSD(%)
1.40 101.12
1.40 101.12
0.89 1.39 100.00 100.65 0.64
1.38 99.95
1.40 101.12
表 3 球松素的加样回收率试验结果
加入量(mg)测定量(mg)回收率(%) 平均值(%) RSD(%)
9.50 99.93
9.49 99.81
5.15 9.56 101.14 99.90 0.77
9.46 99.07
9.48 99.55
表 4 不同批次山橿药材中银松素 、乔松素和球松素的含量
批号 产地 含量平均值(mg/g)银松素 乔松素 球松素
S1 信阳 4.1580 1.3148 3.8402
S2 新县 5.1625 0.9652 3.0639
S3 新县 6.1671 0.6155 5.4644
S4 江淮岭 8.4651 1.5528 4.0926
S5 江淮岭 6.6225 0.9913 4.9431
S6 江淮岭 8.1992 1.5104 7.2099
S7 江淮岭 7.3223 1.3976 6.8915
S8 田铺 7.7895 1.3197 9.6179
S9 田铺 8.0542 0.9934 8.7163
S10 田铺 8.6950 0.9693 10.1377
图 1 对照品和山橿样品的对照 HPLC色谱图
42  河南大学学报(医学版), 2008年 , 第 27卷第 2期
图 2 空白溶液和山橿样品的对照 HPLC色谱图
  不同批次药材中同一化学成分的含量高低不等 ,
尝试根据 10批次的山橿药材中银松素 、乔松素和球
松素的含量测定结果确定其平均值下降 30%为参考
值范围 , 三者的平均含量分别为 6.9635 mg/g±
1.6749 mg/g、1.1630 mg/g±0.2999 mg/g和 6.4978
mg/g±2.3764 mg/g,故三者含量下限分别为:
银松素: X×(1 -30%)=6.9635 ×(1 -30%)=
4.8745 mg/g
乔松素: X×(1 -30%)=1.1630 ×(1 -30%)=
0.8141 mg/g
球松素: X×(1 -30%)=6.3978 ×(1 -30%)=
4.5484 mg/g
  所以 , 初步规定山橿药材含银松素不得少于
4.8745 mg/g、乔松素不得少于 0.8141 mg/g和球松
素不得少于 4.5484 mg/g。其结果由平均值下降
30%计算而得 ,因采用的山橿样品量较少 ,结果还有
待进一步大样本的验证。
3 讨论
3.1 银松素为联苯乙烯类化合物 ,球松素 、生松素 、
乔松素和樱花素都属于二氢黄酮类化合物 ,化学结构
的差别为酚羟基和甲氧基 ,由于这些极性基团的存
在 ,使银松素的极性较强 ,无法采用等度洗脱的方法
同时进行两个(几个)成分的含量测定。文献报道的
方法也只能通过不同的等度洗脱方法分别测定银松
素和球松素 。本实验采用梯度洗脱的方法可以同时
测定它们的含量 ,可以较好的分离待测成分与其它组
分 ,避免杂质的干扰 ,省时节约 ,提高结果的准确性 ,
也有利于山橿药材的指纹图谱研究 。
3.2 关于山橿药材梯度洗脱方法方面的研究 ,到目
前尚无相关报道 ,梯度洗脱的流动相系统的选择比较
麻烦 。在反相高效液相中以甲醇(乙腈)-水系统比
较适合梯度洗脱 ,根据试验结果最后选用甲醇 -水以
非线性梯度洗脱的方式来测定山橿药材中不同极性
成分的含量 。
3.3 根据山橿药材中化学成分结构不同的特点 ,对
不同时段采用不同的线性梯度 , 0 min~ 15 min和 15
min~ 50min梯度速度不同 ,在 50 min~ 55min采用
了等度洗脱 。局部优化色谱峰之间的分离度 ,以不同
的梯度洗脱 ,不仅可以使含量测定的色谱峰完全分
离 ,达到定量分析的目的 ,同时也可以使所有色谱峰
均达到最佳的分离状态 ,且分布比较均匀 ,使色谱图
更加适于后期指纹图谱的研究 。
参考文献:
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出版社 , 1994:10.
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卫生出版社 , 2005:105-116.
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[责任编辑 段金卯 ]