全 文 ：第 24 卷 第 2 期 四 川 林 业 科 技 Vo1.24 , No.2
2003 年 6 月 Journal of Sichuan Forestry Science and Technology June , 2003
收稿日期:2002-11-18
作者简介:巩艳红(1979-),女 ,在读硕士 ,专业方向生物技术在林木育种中的应用。
毛豹皮樟叶片总 DNA 的提取
巩艳红 ,刘 军
(四川农业大学林学园艺学院 ,四川雅安 625014)
摘 要:在参考其它植物 DNA 提取方法的基础上 , 结合毛豹皮樟富含还原糖及多酚类物质的特殊性 , 用
CTAB 法和改良 SDS 法对毛豹皮樟的叶片进行了 DNA 提取试验 , 结果表明:改良 SDS 法是一种适合于毛豹
皮樟叶片 DNA 提取的较理想的快速途径。
关键词:毛豹皮樟;DNA 提取
中图分类号:S718.46 文献标识码:B
文章编号:1003-5508(2003)02-0047-04
Experiments on Genomic DNA Isolation from the Leaves
of Litsea coreana Lévl.var.lanuginosa
GONG yan-hong LIU Jun
(College of Forest ry and Horticulture , Sichuan Agricultural Universi ty , Ya an , Sichuan , 624014, China)
Abstract:Comparing w ith the common vegetable plants , it is more difficult to isolate qualified ge-
nomic DNA from the leaves of Litsea coreana Lévl.var.lanuginosa(M igo)Yang et P.H.Huang ,
which is rich in sugar and polyphenolic materials.Consulting the w ays of isolating DNA from the
tissues of other plants ,CTAB method and improved SDS method w ere used to ext ract DNA from
the leaves of Litsea coreana Lévl.var.lanuginosa.As a result , improved SDS method was an ide-
al , rapid and efficient approach.
Key words:DNA isolation , Li tsea coreana Lévl.var.lanuginosa
1 引言
毛豹皮樟[ Li tsea coreana Lévl.var.lanuginosa(Migo)Yang et P .H.Huang] 属于樟科木姜子属植
物 ,为常绿乔木或小乔木 ,是一种天然的野生资源 。利用毛豹皮樟鲜叶制成的老鹰茶 ,是一种纯天然 、无
污染 、风味佳的绿色饮品 。该饮品具有生津止渴 、清热解毒等保健功效 ,近年来倍受消费者青睐 ,生产经
济效益较高[ 1] 。由于毛豹皮樟适应性很广 ,既可单独成园 ,又可与茶 、林 、果混种;山地 、丘陵均可种植 ,
是一种理想的退耕还林树种。毛豹皮樟在我国分布广泛 ,在四川则主要分布于盆周山地。现有的野生
资源品种繁多 ,性状混杂 ,良莠不齐 ,加之很多植株剔枝取叶严重 ,生殖生长不良 ,一般都没有花和果 ,靠
传统的形态特征很难区别 。因此 ,采用 DNA 分子技术进行毛豹皮樟种质资源的鉴定和分类工作具有
十分重要的意义 。
DNA的提取是 DNA 指纹分析技术以及进行分子遗传学研究的首要前提。虽然早已发展了从植物
叶片中提取 DNA的技术 ,也有很多从植物幼嫩叶片中提取 DNA的报道 , “但不同植物及植物自身的不
同部位都有其各自的特点 ,这些特点反应在自身的结构和组成上”[ 3] ,如有的组织木质化程度高 ,有的
细胞壁较厚 ,而有的含酚类物质多 ,有的则易于降解等 ,很难用一种方法来适应不同植物的 DNA的提
取。针对某些特殊的材料 ,DNA 提取方法仍需要进一探索和改进。另外 ,由于某些技术本身的复杂性
和局限性[ 4] ,往往不利于大群体样本的应用 ,而许多分子生物技术的操作以及种质资源的研究中大多
需要提取大群体样本的 NDA[ 5] ,为其后面的研究作必要的准备 。
由于毛豹皮樟含多酚类 、儿茶素 、氨基酸 、还原糖等物质较多 ,从其体内提取 DNA 时容易受这些物
质的干扰 ,导致所提取的 DNA 在质量上不能达到要求甚至提不出 DNA。本文在参考其他植物DNA提
取方法的基础上 ,结合毛豹皮樟自身的特殊性 ,对不同的方法进行了尝试 ,获得了理想的毛豹皮樟叶片
DNA提取方法。
2 材料与方法
2.1 材料
材料取自四川省雅安市雨城区中里镇(海拔 800 m),共 13个叶片样品 ,包括老叶片 、幼叶片 。取材
后 ,用无菌保鲜膜包装 ,在液氮中速冻 10秒 ,立即贮于-80℃超低温冰箱中保存备用 。
2.2 方法
2.2.1 提取 DNA
2.2.1.1 CTAB法 100 ml提取液配方:CTAB 2 g , 1 MtrisCl(pH8.0)7.5 m l , 0.5MEDTA(pH8.0)
3 ml ,NaCl6.2 g ,巯基乙醇 2 ml ,定容至 100 ml。
①取液氮冷冻的毛豹皮樟叶片组织 ,在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。
②将粉末放入 50 ml离心管中 ,然后加入 15 ml提取缓冲液。
③用力振动 ,至管底无沉淀叶粉为止 ,迅速将离心管置于 65℃水浴中 1小时 ,水浴过程中温和地混
匀几次。
④取出离心管 ,每管加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)溶液 ,混匀后 ,离心 , 8 000 rpm 。
⑤取上清液 ,加入等体积无水乙醇 ,轻轻混匀 ,然后放入-20℃冰箱 1小时 。
⑥取出后在 4℃条件下离心 10分钟。
⑦用钩针钩出 DNA ,再用 70%乙醇冲洗 2 ～ 3次 ,每次 20分钟 ～ 30分钟 ,气干。
⑧加入适量 1×TE溶解 DNA(在-20℃冰箱中)。
⑨用 70%的乙醇洗 3次 ,然后置于空气中干燥 。
⑩加入 100 μlTE 溶解沉淀 。
2.2.1.2 改良 SDS提取法 100 m l提取液配方:1MTrisCl(pH8.0)10 ml , 0.5MEDTA 10 ml , 5M naCl
2 ml ,20%SDS 10 ml ,定容至 100 ml。
①②③同 CTAB法 。
④取出离心管 ,每管加入 1/4体积的 KAc ,再加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)溶液 ,混匀后 ,离心 ,
8 000 rpm ,15分钟。
⑤取出离心管冰浴 20分钟;将上清液移入另一离心管中 ,重复离心一次。
⑥取上清液于另一离心管中 ,加入 0.6倍体积的异丙醇 ,轻轻混匀 ,4℃冰箱中静置一段时间。
⑦⑧⑨⑩同 CTAB法。
2.2.2 DNA浓度与质量检测
用核酸检测仪检测样品 DNA的浓度及 OD260/OD280比值 。
48 四 川 林 业 科 技 24 卷
图 1 CTAB 法凝胶成像分析系统检测结果(加 RNA 酶)
(注:所取 13个材料中除了 7 号 、9号 、10 号为老叶片以外皆为
幼嫩叶片)
3 结果与分析
3.1 凝胶成像分析系统检测分析
检测结果见图 1 ,图 2。从图 1可以看出 ,采用
CTAB法提取叶片样品的 DNA 量少 , 并且背景很
浅 ,带纹模糊不清 ,拖尾现象非常严重 ,有明显的降
解迹象 ,表明采用该提取方法所得 DNA 杂质较多 。
图2 表明采用改良 SDS法提取所得样品的 DNA 带
纹清晰 ,无拖尾现象 , 样品损伤小。同时结果还表
明:改良 SDS 法不仅适于毛豹皮樟幼嫩叶片 DNA 的
图 2 改良 SDS 法凝胶成像分析系统检测结果(加 RNA
酶)
(注:所取 13个材料中除了 4号 、5号 、6号 、8号为幼嫩叶片以外
皆为老叶片)
提取 ,而且对其老叶片 DNA 的提取效果也非常好;
相比之下 ,CTAB法不仅不能提出毛豹皮樟老叶片的
DNA ,而且所提取的幼嫩叶片 DNA 量少 、杂质也很
多。
3.2 DNA 浓度检测结果与O.D值
从表 1和表 2所得数据可知 ,利用改良 SDS 法
提取毛豹皮樟叶片的 DNA所得量较多 ,浓度较高;
且O.D值都介于 1.800 ～ 1.900之间 ,表明 DNA 纯
度高 、受损害程度低;而用 CTAB法所提取出的毛豹
皮樟叶片 DNA 浓度普遍较低 , 且 O.D 值远小于
1.5 ,表明 DNA 纯度低 、受损害程度高 , 无法满足
DNA分子技术的要求 。
表 1 CTAB所提 DNA 的浓度与 O.D值
(注:DNA 模板均稀释 100 倍)
样品编号 A260 A280 A260/A 280(O.D 值)
DNA浓度
(μg/ml)
1 0.016 0.014 1.14 80.0
2 0.018 0.095 0.19 90.0
3 0.073 0.240 0.30 365.0
4 0.045 0.036 1.25 225.0
5 0.030 0.022 1.36 150.0
6 0.014 0.011 1.27 70.0
7 2.301 2.699 0.85 1 150.5
8 0.054 0.044 1.27 270.0
9 0.013 0.017 0.76 65.0
10 2.222 2.699 0.82 1 620.0
11 0.019 0.017 1.12 95.0
12 0.199 0.151 1.32 995.0
13 0.162 0.131 1.24 810.0
表 2 改良 SDS 法所提 DNA的浓度与 O.D 值
(注:DNA 模板均稀释 100 倍)
样品编号 A260 A280 A260/A 280(O.D 值)
DNA浓度
(μg/ml)
1 0.297 0.161 1.845 1 485
2 0.300 0.165 1.818 1 500
3 0.311 0.172 1.808 1 555
4 0.258 0.139 1.856 1 290
5 0.263 0.142 1.852 1 315
6 0.310 0.163 1.900 1 550
7 0.321 0.171 1.877 1 605
8 0.302 0.167 1.808 1 510
9 0.318 0.172 1.849 1 590
10 0.324 0.171 1.894 1 620
11 0.210 0.114 1.842 1 050
12 0.247 0.132 1.871 1 235
13 0.223 0.122 1.828 1 115
4 结语
目前对毛豹皮樟的研究还仅限于扦插繁殖 、驯化栽培技术等方面 ,这对该野生资源的开发利用还远
远不够[ 6] 。本试验对毛豹皮樟叶片 DNA 的提取不仅为今后对毛豹皮樟种质资源研究和分子生物学方
面的研究奠定了基础 ,而且对从樟科植物以及富含多糖 、多酚类物质的植物中提取 DNA具有一定的参
492 期 巩艳红 ,等:毛豹皮樟叶片总 DNA 的提取
考价值 。采用改良 SDS 法提取毛豹皮樟叶片 DNA ,不仅操作过程简便 ,省时间 ,且提取效果非常理想 ,
尤其在对大群体样本 DNA进行提取时 ,该法优势更加明显 。该提取方法也不涉及用毒性较大的酚和
CTAB两种试剂处理(CTAB试剂价格较昂贵[ 9])。
致谢:笔者有幸能在四川农业大学植物遗传育种分子细胞遗传室(开放实验室)完成实验工作 ,并得
到任正隆教授 、张怀愉副研究员 、张怀琼副教授和付体华教授等老师的大力支持和帮助 ,在此表示衷心
的感谢!
参考文献:
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第 24 卷 第 2 期 四 川 林 业 科 技 Vo1.24 , No.2
2003 年 6 月 Journal of Sichuan Forestry Science and Technology June , 2003
收稿日期:2002-11-23
基金项目:云南省教育厅资助项目。
作者简介:刘祥义(1964-),男 ,副教授 ,主要从事天然产物方向研究。
思 茅 松 增 脂 研 究
刘祥义1 ,陈玉惠1 ,李 明2
(1.西南林学院 ,云南昆明 650224;2.景谷林业股份有限公司 ,云南景谷 666400)
摘 要:采用割面喷施增脂剂 、本底产量对比法计算增脂率 , 对增脂剂 1#、2#进行了连续 4 个月的思茅松增
脂试验。结果显示:增脂剂 1#、2#使思茅松流脂时间延长 、松脂含油率增加 、最高增脂率分别达 28.6%和
22.1%。同时 , 松树长势更好。
关键词:增脂剂;思茅松;采脂;喷施;本底产量对比法
中图分类号:S785.4 文献标识码:B
文章编号:1003-5508(2003)02-0050-03
松脂是一种再生资源和重要的林副产品 。松脂经加工后得到的松香 、松节油是重要的化工原料。
云南省是我国松香生产省 ,松香产量在全国排名第四。思茅松是云南省主要用材及采脂树种 ,现有林地
面积 78.7万hm2 ,总蓄积量7 621.3万 m3 ,主要集中在思茅地区 。景谷县是思茅地区松香生产主产县 ,
也是云南省松香重点产区 ,年产量占全省总产量的三分之一以上 ,在行业中占有举足轻重的地位。松脂
是当地脂农靠山吃山 ,脱贫致富的主要财源 ,仅松脂一项 ,全县脂农年收入达 3 900多万元。然而 ,据统
计 ,全县脂农人年均采脂量仅为 953 kg ,单株产脂量仅 2.38 kg ,与全国采脂先进地区的人年均采脂量
2 000 kg ～ 3 000 kg ,单株产脂量 3.5 kg 相比 ,存在较大差距。除树种差异 、地理差异外 ,采脂工艺是其