全 文 ：咖啡因（caffeine）又称咖啡碱，别名茶素，属生物
碱类化合物，化学名为 1，3，7-三甲基-2，6-二氧嘌呤，
常见的有水合咖啡因和无水咖啡因两种，无水咖啡因
分子式为 C8H10N4O2（其分子量为 194.19），结构式见
图1。
水合咖啡因为白色有丝光的柔韧性长针状结晶
体，无臭，味苦，长期露置于空气中有风化性，加热到
100 ℃时失去结晶水，并有升华现象，加热到 120 ℃时
HPLC测定小粒种咖啡
不同部位咖啡因含量
韩洪波1，2，杨春琳1，李敏杰1，2
（1.攀枝花学院生物与化学工程学院，四川攀枝花 617000；2.攀枝花市干热河谷特色生物资源工程技
术中心，四川攀枝花 617000）
摘 要：利用 RP-HPLC测定小粒种咖啡不同部位（咖啡豆种仁、果皮和茎叶）中咖啡因含量。色谱柱：Agilent Eclips
XDB-C18（Sun，4.6 mm×150 mm）；流动相：甲醇-水（30∶70，体积比）；流速：1 mL/min；检测波长：280 nm；柱温为 30 ℃；
咖啡因标准曲线方程为：Y =11.566 2X+2.982 7，R2=1。咖啡因在 16 μg/mL~80 μg/mL范围内具有良好的线性关系。测
定出攀枝花本地引种的小粒种咖啡豆中咖啡因含量为 15.56 g/kg，果皮中含量为 13.62 g/kg，茎叶中的含量为 21.19 g/
kg。精密度实验结果为咖啡豆种仁、果皮和茎叶中含量的 RSD分别为 1.01 %、1.11 %、1.59 %；重复性实验结果为咖啡
豆种仁、果皮和茎叶中咖啡因含量的 RSD分别为 0.69 %、1.79 %、1.38 %；均小于 2 %，达到含量测定要求。咖啡豆种
仁、果皮和茎叶中咖啡因回收率分别在 95.6 %~108.4 %，94 %~103.4 %，96.5 %~102.6 %。
关键词：RP-HPLC；咖啡豆种仁；咖啡豆果皮；咖啡茎叶；咖啡因
The Caffeine Content Determination in Different Parts of Arabica Coffee by HPLC
HAN Hong-bo1，2， YANG Chun-lin1， LI Min-jie1，2
（1. Biology & Chemistry Engineering College of Panzhihua University，Panzhihua 617000，Sichuan，China；
2. The Engineering Center of Characteristic Biological Resources of Panzhihua Dry-hot valley， Panzhihua
617000，Sichuan，China）
Abstract：RP-HPLC determination of different parts of the arabica coffee （coffee seed kernel， peel，stems and
leaves） in the caffeine content. Column： Agilent Eclips XDB -C18 （Sun， 4.6 mm ×150 mm）； mobile phase：
methanol-water （30∶70，V/V）； flow rate：1mL/min；detectionwavelength：280nm； column temperature was 30℃；
Caffeine standard curve equation： Y=11.566 2X +2.982 7， R2=1. Caffeine in 16 μg/mL-80 μg/mL range with good
linearity. Determination of the local introduction of the Arabica Coffee Panzhihua caffeine content of coffee beans
15.56 g/kg， peel content 13.62 g/kg， stems and leaves of the content of 21.19 g/kg. Precision results for the coffee
seeds， peel，stems and leaves content of the RSD were 1.01 %， 1.11 %， 1.59 %；Repeatability results for the coffee
seeds，peel，stems and leaves， respectively， in caffeine content ofRSD0.69%， 1.79%， 1.38%；were less than 2%，
achieve assay requirements. Coffee seeds， peel，stems and leaves of caffeine recoverieswere 95.6%-108.4%，94%-
103.4%，96.5%-102.6%.
Key words：RP-HPLC；coffee seed kernel；coffee pericarp；coffee stems and leaves；caffeine
食品研究与开发
Food Research And Development
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.06.024
基金项目：《优质小粒种咖啡蓝山及墨西哥 11等引种示范》攀枝花市
科技项目（项目计划编号：2008CY-S-4）
作者简介：韩洪波（1981—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：天然产物
分离分析。
检测分析
2013年 3月
第 34卷第 6期
85
式中：C为样品溶液或稀释液浓度，可由咖啡因标
准曲线计算，设咖啡因标准曲线方程为：Y=AX+B，样
品稀释液浓度 C=（Y-B）/A；a为稀释倍数，10；V为 50mL；
A由称量数据知。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
以峰面积积分值 Y 为纵坐标，标准溶液浓度
X（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程，咖
啡因标准曲线见图2。
显著升华。无水咖啡因为白色粉末，熔点为 235 ℃~
238℃，是弱碱性物质，易溶于热水、氯仿、冷乙醇和丙
酮，难溶于乙醚和苯，升华温度为 178℃~179℃。近些
年研究表明，咖啡因对神经系统、心脑血管系统、消化
系统、肿瘤化疗的生化调节、神经官能症和偏头痛等
均有一些积极作用[1-4]。
目前测定咖啡因的方法较多，如薄层色谱法、碘
量法、高效液相色谱法、重量法、分子印迹毛细管整体
柱液相色谱法和紫外分光光度法等[5-6]。采用反相高效
液相色谱法测定攀枝花本地引种的小粒种咖啡不同
部位咖啡因的含量，具有快速、准确、处理简便的特点。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
咖啡：采自攀枝花市干热河谷特色生物资源种植
基地；咖啡因标准品（纯度大于 99.9 %）：国药集团上
海化学试剂公司；CH3OH（AR）、氧化镁（AR）：成都市
科龙试剂化工厂；JYL-350A九阳理料机：九阳股份有
限公司；安捷伦 1200高效液相色谱仪：安捷伦科技有
限公司；FA2104S电子分析天平：上海恒平科学仪器有
限公司；DL-1电子万用炉：北京市光明医疗仪器厂；
SHZ-D（Ⅲ）循环水真空泵：天津华鑫仪器厂。
1.2 标准溶液与样品液的配制
1.2.1 标准溶液的配制
用电子分析天平精确称取咖啡因标准品 40 mg，
将其移入 50 mL的容量瓶中，并用蒸馏水定容，即配得
咖啡因标准品母液（800 μg/mL）。再用移液管精确移取
1、2、3、4、5 mL的母液，分别移入 50 mL的容量瓶中，
并用蒸馏水定容，即得到浓度为 16、32、48、64、
80 μg/mL的标准品溶液。
1.2.2 样品稀释液的配制
将咖啡豆分为咖啡豆果皮和种仁两部分，而咖啡
茎叶将其剪成小块，处理好的样品材料放入恒温干燥
箱中，55 ℃条件下，烘干，再将种仁、果皮以及茎叶粉
碎，过 0.45 mm的分样筛。分别精确称取样品 1.0 g于
50 mL的锥形瓶中，加入 0.5 g氧化镁，再加入 30 mL
蒸馏水，在沸水浴中浸提 20 min，每隔 5分钟振荡一
次，然后立即进行减压过滤，滤液冷却至室温后移入
50 mL 的容量瓶中，并用蒸馏水定容，稀释 10 倍后
待测。
1.3 色谱条件
色谱柱：Agilent Eclips XDB-C18（Sun，4.6 mm×
150 mm）；流动相：甲醇-水（30 ∶70，体积比）；流速：
1 mL/min；检测波长：280 nm；柱温为 30℃。
1.4 标准曲线的绘制
取配制的标品溶液，按浓度梯度，由低到高，依次
取 10 μL标品溶液进柱测定。
1.5 样品液的测定
分别对咖啡豆种仁、果皮和茎叶样品液进行测
定，每种做 6个平行样，每个平行样测定 6次。记录色
谱图，计算其含量。
1.6 咖啡因含量计算方法
样品中咖啡因含量以 1 kg干物质所含的克数表
示，具体计算公式如下：
图 1 咖啡因的化学结构式
Fig.1 Chemical structures of caffeine
O
N
O
N
N N
韩洪波，等：HPLC测定小粒种咖啡不同部位咖啡因含量
咖啡因含量（g/kg）=进样液浓度 C（μg/mL）× a ×母液定容体积 V（mL）× 10
-6
样品称取量 A（g）× 10-3 （1）
图 2 咖啡因标准曲线
Fig.2 Standard curve of caffeine
950
850
750
650
550
450
350
250
150
15 35 55 75
标品浓度/（μg/mL）
峰
面
积
检测分析
86
其线性回归方程为：Y=11.566 2X+2.982 7，R2=1。
结果表明，咖啡因在 16 μg/mL~80 μg/mL范围内具有
良好的线性关系。
2.2 精密度与重复性实验
取其中一个咖啡豆种仁样品液，精确吸取 10 μL，
重复进样 6次，咖啡因含量的 RSD为 1.01 %，种仁精
密度试验结果见表 1。
取 6个平行咖啡种仁样品液，对每组样品液重复
进样 6次，并计算出该组咖啡因含量平均值，结果如
下。咖啡因含量的 RSD为 0.69 %，种仁重复性实验结
果见表 2。
取其中一个咖啡豆果皮样品液，精确吸取 10 μL，
重复进样 6次，测含量，咖啡因含量的 RSD为 1.11 %，
果皮精密度试验结果见表 3。
取 6个平行咖啡种仁样品液，对每组样品稀释液
重复进样 6次，并计算出该组咖啡因含量平均值，结果
如下。咖啡因含量的 RSD为 1.79 %，果皮重复性实验
结果见表 4。
取其中一个咖啡茎叶样品液，精确吸取 10 μL，重
复进样 6次，测含量，咖啡因含量的 RSD为 1.59 %，茎
叶精密度实验结果见表 5。
取 6个平行咖啡种仁样品液，对每组样品稀释液
重复进样 6次，并计算出该组咖啡因含量平均值，结果
如下。咖啡因含量的 RSD为 1.38 %，茎叶精密度实验
结果见表 6。
2.3 回收率实验
精密称取 1.0 g样品，按照上述方法处理，分别精
确加入相应的咖啡因标准品的溶液，测定该方法的回
收率。咖啡豆种仁、果皮和茎叶中咖啡因回收率分别
在 95.6 %~108.4 %，94 %~103.4 %，96.5 %~102.6 %。
3 结论
攀枝花本地引种的小粒种咖啡豆中咖啡因含量
韩洪波，等：HPLC测定小粒种咖啡不同部位咖啡因含量
表 1 咖啡豆种仁精密度试验结果
Table 1 The precision results of coffee seed kernel
进样序次 峰面积积分值
稀释液浓
度/（μg/mL）
样品中含量/
（g/kg）
RSD/%
1
2
3
4
5
6
408.13
400.68
406.22
408.74
409.29
400.34
35.03
34.38
34.86
35.08
35.13
34.35
17.54
17.22
17.46
17.57
17.59
17.20
1.01
表 2 咖啡豆种仁重复性实验结果
Table 2 The repeatability test results of coffee seed kernel
组数 咖啡因含量平均值/（g/kg） RSD/%
1
2
3
4
5
6
17.40
17.49
17.67
17.60
17.36
17.43
0.69
表 3 咖啡豆果皮精密度试验结果
Table 3 Precision results of coffee pericarp
进样次数 峰面积积分值
稀释液浓度/
（μg/mL）
样品中含量/
（g/kg）
RSD/%
1
2
3
4
5
6
319.39
314.39
319.21
310.78
315.61
319.09
27.36
26.92
27.34
26.61
27.03
27.33
13.68
13.46
13.67
13.31
13.52
13.67
1.11
表 6 咖啡茎叶精密度实验结果
Table 6 The repeatability test results of coffee stems and leaves
组数 咖啡因含量平均值/（g/kg） RSD/%
1
2
3
4
5
6
20.94
20.97
21.45
21.24
21.60
20.91
1.38
进样次数 峰面积积分值
稀释液浓度/
（μg/mL）
样品中含量/
（g/kg）
RSD/%
1
2
3
4
5
6
480.08
480.22
486.17
494.72
495.74
496.40
41.25
41.26
41.78
42.52
42.60
42.66
20.53
20.54
20.79
21.16
21.21
21.23
1.59
表 4 咖啡豆果皮重复性实验结果
Table 4 Repeatability test results of coffee pericarp
组数 咖啡因含量平均值/（g/kg） RSD/%
1
2
3
4
5
6
13.71
13.91
13.85
13.37
13.33
13.55
1.79
表 5 咖啡茎叶精密度实验结果
Table 5 The precision results of coffee stems and leaves
检测分析
87
（上接第 84页）
2.7 稳定性实验
取同一供试品，分别在 1、2、3、4、5 h进样，结果芦
丁、槲皮素和异鼠李素峰面积的 RSD分别为 1.82 %、
2.36 %、2.53 %。说明供试品溶液在 5 h内稳定。
2.8 重复性实验
取骏枣样品 3份，按 2.3供试品溶液制备，测得芦
丁、槲皮素和异鼠李素含量平均值分别为 205.6 μg/g，
8.7 μg/g，171.0 μg/g。芦丁、槲皮素和异鼠李素峰面积
的 RSD分别为 2.24 %，1.44 %和 2.48 %。
2.9 加样回收率实验
精密量取已知含量样品液 3份，准确加入一定量
的对照品溶液，按 2.1色谱条件测定，计算加样回收
率，结果见表 2。
芦丁、槲皮素和异鼠李素的加样平均回收率分别
为 99.34 %，99.82 %和 98.90 %，RSD 分别为 1.42 %，
2.27 %和 2.44 %。
3 结论
本实验采用 HPLC法测定骏枣果肉中芦丁、槲皮
素和异鼠李素的含量，实验结果表明：骏枣中芦丁、槲
皮素和异鼠李素含量分别为 205.6、8.7、171.0 μg/g，平
均回收率分别为 99.34 %、99.82 %、98.90 %。该法具有
回收率高、重现性好等特点，结果准确，适于骏枣果肉
中芦丁、槲皮素和异鼠李素含量的测定。
参考文献：
[1] LI J,FAN L,DING S,et al. Nutritional composition of five cultivars of
Chinese jujube[J]. Food Chem,2007,103:454-460
[2] SAN B, YILDIRIM AN. Phenolic, alphatocopherol, beta -carotene
and fatty acid composition of four promising jujube (Ziziphus jujuba
Miller) selections[J]. Journal of food composition and analysis,2010,
23:706-710
[3] 黄锁义,覃成箭,余美科,等.益母草黄酮的提取及鉴别[J] .时珍
国医国药,2005,16(5):398-399
[4] 李红,郅洁,马彦梅,等.沙枣黄酮的提取及其抗氧化作用的研究
[J].时珍国医国药,2010,21(1):35-36
[5] 杜瑞芳,王雨梅,刘卫东,等.高效液相色谱法同时测定沙枣中槲
皮素和异鼠李素的含量[J].时珍国医国药,2008,19(4):831-832
[6] 刘娟,杨艳丽. HPLC法测定沙棘不同部位槲皮素和异鼠李素的
含量[J].辽宁中医药大学学报,2010,12(6):16-17
收稿日期：2012-06-18
表 2 芦丁、槲皮素和异鼠李素的加样回收率
Table 2 Recovery rate of Rutin，Quercetin and Isorhamnetin
standard content
样品
样品含
量/μg
加入量/
μg
测得量/
μg
回收率/
%
平均回
收率/%
RSD/%
芦丁 20.56 10.2 30.85 100.88 99.34 1.42
20.56 15.3 35.57 98.10
20.56 20.4 40.76 99.02
槲皮素 0.87 0.5 1.38 102.00 99.82 2.27
0.87 0.7 1.56 98.57
0.87 0.9 1.76 98.89
异鼠李素 17.10 11.1 28.15 99.55 98.90 2.44
17.10 16.6 33.07 96.20
17.10 22.1 39.41 100.95
韩洪波，等：HPLC测定小粒种咖啡不同部位咖啡因含量
为 15.56 g/kg，果皮中含量为 13.62 g/kg，茎叶中的含量
为 21.19 g/kg。精密度实验咖啡豆种仁、果皮和茎叶中
含量的 RSD分别为 1.01 %、1.11 %、1.59 %；重复性实
验咖啡豆种仁、果皮和茎叶中咖啡因含量的 RSD分别
为 0.69 %、1.79 %、1.38 %；均小于 2 %，达到含量测定
要求。咖啡豆种仁、果皮和茎叶中咖啡因回收率分别
在 95.6 %~108.4 %，94 %~103.4 %，96.5 %~102.6 %，说
明样品处理方法合理。参考其他咖啡中咖啡因含量测
定文献显示，阿拉比卡种咖啡豆的咖啡因含量在 15 g/kg
左右，与本文测定数据相当。本研究采用 HPLC法测定
小粒种咖啡中不同部位咖啡因含量实验数据准确
可靠。
茎的生长时间比较长，所以茎叶混合物含量比豆
和果皮含量高。大规模的咖啡种植中，我们可以考虑
将茎叶和咖啡豆加工中剩下果皮等材料商业化提纯
咖啡因。
参考文献：
[1] 赵灵芝,苏兴文,银巍,等.咖啡因对苯妥英诱导的小脑颗粒神经
元凋亡的保护作用及机制 [J].中国药理学通报 ,2004,20(12):
1370-1374
[2] 贾桂燕.咖啡降血糖活性的研究[D].吉林:吉林农业大学,2005:9-
12
[3] 丁发银,马海红.长期大量吸食咖啡因对消化性溃疡常规治疗影
响的观察[J].长治医学院学报,1999,13(4):261
[4] 范镜林,杨劲松,李鼎,等.皮下埋植式动脉介入联合咖啡因治疗
恶性骨肿瘤 14 例分析[J]. 中国肿瘤临床与康复 ,2005,12(3):
263-264
[5] 徐学笛.高效液相色谱法测定咖啡因含量的研究与探讨[J].科技
成果纵横,2008(2):60-61
[6] 成洪达,邢占芬,李彤,等.温度对高效液相色谱分离选择性的影
响[J].福建分析测试,2009,18(1):16-19
[7] 黄和,程学梅,叶英.GB/T 19182-2003/ISO 10095:1992咖啡－咖啡
因含量的测定－高效液相色谱法[S].北京:国家质量监督检验检
疫总局,2003
收稿日期：2012-06-31
检测分析
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
88